循环流化床反应器在麦芽糖月桂酸酯酶法合成中的应用.pdf

- 1 - 循环流化床反应器在麦芽糖月桂酸酯酶法循环流化床反应器在麦芽糖月桂酸酯酶法 合成中的应用合成中的应用 李攀，冯骉，张晓鸣，贾承胜 江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡 (214122) E-mail: lipan198210 摘摘 要要：设计制作了循环流化床反应装置，在固定化脂肪酶催化下合成麦芽糖月桂酸酯。 通过对床层膨胀比、平均停留时间以及糖酸比的研究确定了最佳工艺条件为：月桂酸浓度 300mmol/L，加酶量6g，以浓度为300mmol/L的月桂酸丙酮溶液作为循环流化液，流化床层 膨胀比为1.1， 物料进出流量为0.3mL/min, 分子筛添加量为10g，此时48小时后反应器产率达 到54.7g/(L.d)。 关键词关键词：循环流化床；固定化脂肪酶；非水相；麦芽糖月桂酸酯 1. 引言引言 糖酯是一类广泛应用于食品医药化工等行业的非离子型表面活性剂,它具有无毒、 无味、 易降解等优点1-2。目前糖酯合成主要采用化学法，产率低、产物组成复杂、分离纯化困难， 并且产物色泽深，而酶法催化合成糖酯具有反应选择性高、条件温和、副产物少、产品色泽 浅，产物容易纯化等优点，近年来已成为国内外普遍感兴趣的糖酯合成新方法3。 大多数关于酶法催化合成糖酯研究目前仍停留在间歇生产阶段， 只有少数几篇关于糖酯 连续化生产文献报道4-6，但其产率都不高。用搅拌式反应器（CSTR）进行连续合成时，为 避免酶与溶剂的分离， 将酶置于多孔介质如筛网内， 但同时也限制了酶与液体反应物的充分 接触4 ，5。用填料床反应器时，又由于固定化酶的粒度很小，床层空隙率太小，导致酶与液 体反应物的接触不良， 对流传递也较差6。 流化床通过气体或液体带动固体粒子实现流态化， 流态化的酶粒子空隙率增大， 与底物能更好的接触从而提高合成反应的效率。 为提高酶法连 续合成糖酯的产率， 本研究采用流化床连续合成麦芽糖月桂酸酯， 对其合成工艺进行了初步 研究。 2. 材料与方法材料与方法 2.1 材料材料 Novozym435脂肪酶，丹麦诺维信公司；月桂酸、麦芽糖、丙酮均为分析纯试剂；甲醇 色谱纯；分子筛（3A、4A） ，上海环球分子筛有限公司。 2.2 主要仪器主要仪器 HLPS美国Waters公司；GNP-9160型隔水式恒温培养箱，上海三发科学仪器有限公司； 501型超级恒温器，上海实验仪器场有限公司；HJ-1型磁力搅拌器，江苏省金坛市荣华仪器 有限公司；HL-3、HL-2S恒流泵，上海青浦沪西分析仪器厂；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪 器厂。 2.3 实验方法实验方法 2.3.1 麦芽糖月桂酸酯的连续合成麦芽糖月桂酸酯的连续合成 连续合成装置为一带循环的流化床反应装置，反应器主体是一玻璃柱D，固定化脂肪酶 - 2 - 置于柱内。在一容器内用过量的麦芽糖和月桂酸制备浓度100500mmol/L的丙酮溶液，用 一恒流泵将此溶液循环， 使柱内的酶床层维持在流化状态。 另外用一恒流泵向反应器连续输 入同样的料液。整套系统保持在50下。 2.3.2 液相色谱（液相色谱（HPLC）分析）分析 HPLC： Agilent 1100 Series， Agilient公司； 色谱柱； Zorbax SB-C18(5m,D4.6mm250mm)； 流动相： V(甲醇):V(水)=90:10； 体积流量0.8mL/min； 柱温30； UV检测器， 检测波长210nm； 进样量5 L。 2.3.3 产率计算产率计算 产率=(产物浓度 出料体积 V)/(反应时间 T反应器体积 v)100% 3结果与讨论结果与讨论 3.1 流化速度的估算流化速度的估算 流态化技术的首要参数是流化速度。 本实验用的固定化酶粒子呈球形， 其最小流化速度 umf和带出速度 ut可分别由7两式计算： )1 (150 )( mf 3 mfp 2 p mf = gd u （Rep20）- 3 22 p pt 225 )(4 g du = (0.4Rep500)- 取粒子平均直径 dp=610-4m， p=860kg/m3， =770kg/m3（50丙酮） ， =2.710-4 Pa.s， 空隙率 mf=0.5，经计算得最小流化速度及带出速度分别为 2.010-3m/s 和 2.4310-2m/s，经 核算，Rep均在公式的有效范围内。根据柱内径（D=1.0cm）计算得最小流化速度对应的体 积流量为 9.42mL/min，带出速度对应的体积流量为 114.6mL/min。实验测得实际最小流化体 积流量和带出体积流量分别为 10.2mL/min 和 109mL/min。计算值与实际测量值差距不大。 3.2床层膨胀比对麦芽糖月桂酸酯合成反应的影响床层膨胀比对麦芽糖月桂酸酯合成反应的影响 在流化床反应器中， 随着流化速度的增加， 床层高度与静止床层高度之比即膨胀比增大， 底物与酶接触程度随之改变，这势必对反应浓度以及产率产生重要的影响。在反应初期，随 着流化速度的增加，反应液体的湍动增强，液体与固定化酶颗粒之间的边界层减薄，传递作 用增强，因此产物浓度上升，如图 1 所示。但是固定化酶和流化介质的扰动对酶有一定磨损 作用8，随着流化速度的增加，磨损也增强，这可能是造成反应后期随着流化速度的增加产 物浓度下降的主要原因。 流化后的系统合成麦芽糖月桂酸酯的浓度均高于未流化的系统， 由 此证实了流化床系统的优越性。 从图 2 可见，当膨胀比为 1.1 时产率达到最高，此时浓度也处于较高水平。 - 3 - 4.5 5 5.5 6 6.5 7 012345 反应时间(d) 产物浓度(mmol/L) 1.1 1.2 1.3 1.4 1 图 1 不同床层膨胀比对麦芽糖月桂酸酯合成的影响 （进料流量 0.3mL/min，加酶量 4g，月桂酸浓度 200mmol/L） Fig.1 Effect of different expansion ratios of the bed on synthesis of lauroyl maltose ester(feed flow rate0.3mL/min，enzyme dozes 4g，concentration of lauric acid 200mmol/L) 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 0.81.8 膨胀比(流化高度/原高) 产物浓度(g/L) 20 25 30 35 40 45 50 产率(g/(L*d) 产物浓度(g/L) 产率(g/(L*d) 图 2 不同膨胀比下 48 小时时产率以及产物浓度 Fig.2 productivity and ester concentration after 48 hours at different expansion ratios 3.3 平均停留时间的确定平均停留时间的确定 在相同的膨胀比和进料流量下改变加酶量， 即静止床层高度， 从而改变了反应物的停留 时间，实验结果如图 3 所示。从图中可以看出随着加酶量的增加即停留时间的增加，反应产 物浓度增加，但增加幅度逐渐减小。在长时间的反应中，随反应时间的延长，产物浓度基本 稳定，48 小时后稍有下降，可能是随着反应时间的延长酶活力有所下降。图 4 为反应 48 小 时后的产率和产物浓度，由图可见，加酶量为 6g 时产率最高，加酶量大于 6g 后，产物浓度 有提高，但产率反而下降，显示出 6g 的加酶量是效率最高的。根据以最少的投入获得最大 产量的原则，6g 的加酶量最为合适。 0 1 2 3 4 5 6 7 8 012345 反应天数(d) 产物浓度(mmol/L) 2g 4g 6g 8g 图 3 不同加酶量下的产物浓度 (进料流量 0.3mL/min,月桂酸浓度 200mmol/L,床层膨胀比 1.1) Fig.3 product concentration at different at different enzyme dozes (feed flow rate 0.3ml/min,concentration of lauric acid 200mmol/L,expansion ratio 1.1) - 4 - 0 1 2 3 4 5 0246810 加酶量(g) 产物浓度（g/L) 0 10 20 30 40 50 产率（g/(L*d) 浓度(g/L) 产率(g/(L*d) 图 4 不同加酶量下反应 48 小时时产率以及产物浓度 Fig.4 productivity and ester concentration after 48 hours at different enzyme dozes 另一方面平均停留时间与进料流量成反比，随着进料流量的增加，平均停留时间缩短， 反应可能不充分，产物浓度将下降；反之，减小进料流量，使产物浓度上升，但到一定程度 后系统将达到平衡，产物浓度几乎不再上升。 图 5 显示不同进料流量下反应 48 小时后的瞬时产率和产物浓度，从图中可以看出 0.3mL/min 的进料速度为最佳进料速度，因为此时的产率最高。图 6 为不同进料流量下反应 产物浓度随反应时间的变化，从图中可以看出反应产物浓度大体上是稳定的。 0 1 2 3 4 5 00.40.5 不同加料速度(mL/min) 产物浓度 (g/L) 0 10 20 30 40 50 产率 (g/(L*d) 浓度(g/L) 产率(g/(L*d) 图 5 不同物料进出体积流量下 48 小时后产率以及产物浓度 Fig5 Productivity and ester concentration at different feed flows 3 4 5 6 7 8 9 012345 反应天数(d) 产物浓度(mmol/L) 0.1mL/min 0.2mL/min 0.3mL/min 0.4mL/min 图 6 不同进料流量对麦芽糖月桂酸酯合成的影响 (月桂酸浓度 200mmol/L,床层膨胀比 1.1，加酶量 6g) Fig.6 Effect of flow rate on synthesis lauroyl maltose ester (concentration of lauric acid 200mmol/L,expansion ratio 1.1,enzyme dozes 6g) 3.4 糖酸比对麦芽糖月桂酸酯合成反应的影响糖酸比对麦芽糖月桂酸酯合成反应的影响 由于糖在有机溶剂中的溶解度很小， 因此在实验中用过量的糖使其浓度保持饱和， 此时 - 5 - 改变酸的量即相当于改变了糖酸比。从图 7 可以看出，随着酸浓度的增加，产物浓度呈增加 趋势，但增加幅度逐渐减小。月桂酸浓度 300500mmol/L 时产物浓度基本不再增加，此时 产率趋于平稳，因此月桂酸进料浓度为 300mmol/L 为最佳浓度。 1 2 3 4 5 0100200300400500600 不同月桂酸浓度(mmol/L) 产物浓度（g/L) 30 35 40 45 50 55 60 产率(g/(L*d) 产物浓度(g/L) 产率(g/(L*d) 图 7 不同月桂酸浓度下 48 小时反应产率和产物浓度 （床层膨胀比 1.1，进料流量 0.3mLmim,加酶量 6g） Fig.7 Productivity and ester concentration of lauroyl maltose after 48 hours at different concentration of lauric acid (expandsion ratio 1.1,feed flow 0.3mL/min,enzyme dozes 6g) 3.5连续生产工艺的优化连续生产工艺的优化 除了进料流量和糖酸比外， 反应体系的含水量对麦芽糖月桂酸酯合成的产率也有较大的 影响。因为反应副产物为水，水的积累会抑制反应的进行，而 Novozym435 的最适酶活含水 量范围为 0.85-2.17%(w/w)9。 实验中通过向体系中添加不同量 3A 分子筛来调节体系中的含 水量。为获得最优的反应条件，设计了三因素三水平的正交实验，选择 48 小时后的产率作 为衡量系统最优标准，各参数水平和实验结果见表 1。对实验结果进行分析后知 A2B2C3为 最佳组合，即分子筛添加量为 10g，进料流量为 0.3mL/min，月桂酸浓度为 300mmol/L。 表 1 确正交试验表优化连续化生产工艺 Table 1 Orthogonal array used for determining critical condition 序号 A分子筛添加量 B 进料流量 C 月桂酸浓度 产率 (g) (mL/min) (mmol/L) (g/(L*d) 1 0 0.2 200 38.4 2 0 0.3 250 50.6 3 0 0.4 300 48.7 4 10 0.2 250 40.1 5 10 0.3 300 54.7 6 10 0.4 200 49.7 7 20 0.2 300 39.2 8 20 0.3 200 47.9 9 20 0.4 250 45.8 4. 结论结论 利用循环流化床系统连续合成麦芽糖月桂酸酯，确定了最佳工艺条件：月桂酸浓度 300mmol/L，加酶量6g，浓度为300mmol/L，月桂酸丙酮溶液250mL作为流化液,床层膨胀比 为1.1,物料进出速度为0.3mL/min，分子筛舔加量为10g，此时反应器产率达到54.7g/(L.d)。 - 6 - 参考文献参考文献 1 Arcos J A,Bernabe M,Otero C. Biotechnology and Bioengineering,1998,60(1):53-60 2 Sarney D B,Vulfson E N,Trends Biotechnology,1995,13(5):164-172 3 Karlheinz Hill,Oliver Rhode Sugar-based surfactants for consumer prosucts and technical applications.Fett/Lipid,1999,101(1):25-33 4 高旭,连续式酶反应器中脂肪酶催化合成麦芽糖糖月桂酸酯的研究.J 食品与生物技术学 报.2007,Vol.26,Mar.2007 16-26 5 Watanabe Y,Kuwabara K,Adachi S,et al.Production of saturated acyl L-ascorbates by immobilized lipase using a continuous stirred tank reactor J.J Agric Food Chem,2003,51,4628-4632 6Kuwabara K,Watanabe Y,Adachi S,et al.Continuous production of acyl L-ascorbates using a packed-bed reactor with immobilized lipaseJ.J Am Oil Chem Soc,2003,80:895-899. 7陈甘棠.化学反应工程M .北京:化学工业出版社,2004 8吴占松. 流态化技术基础及应用M.北京:化学工业出版社,2006 9watanabe,Y.Miyawaki,Y.Adachi,S.rt al.Synthesis of lauroyl saccharides through lipase-catalyzed condensation in microaqueous water-miscible solvents J. J.Mol.m Catal.B:Enzym.2000, 10:241-247. Application of Fluidized Reactor with Recycling in the Enzymatic Synthesis of Lauroyl Maltose Ester Li Pan，Feng Biao，Zhang Xiaoming，Jia