菠萝渣生产果胶酶的研究.pdf

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 5 期 收稿日期：2008-09-16 基金项目：湛江市科技招标项目(湛科200694 号)。 作者简介：林华娟(1970)，女，博士，副教授，研究方向为碳水化合物化学结构和理化性质的解析，农产品贮藏与加工。 菠萝(Ananascomosus(L)Merr)，凤梨科植物。其 果实由于具有独特的色、香、味而深受人们的喜 爱，除了鲜销以外被加工成罐头、果酱和饮料等 食品，是热带亚热带地区重要的经济农作物之一， 全世界年产达 1200 万 t 以上1，其中，广东省 湛江市是中国著名的“菠萝之乡” 、年产可达 100 多万 t。菠萝果实由于果皮较厚，在机械化加工过 程中产生的下脚料比例非常大(约占菠萝果实的 50%)2，仅湛江市年产菠萝渣就达 50 万 t。如何综 合开发利用这部分资源是当前菠萝产地迫切解决 菠萝渣生产果胶酶的研究 Study on production of pectinase by pineapple waste LIN Hua-juan, QIN Xiao-ming, ZHANG Chu-shu, HE Yang-yang (CollegeofFoodScienceandTechnology,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524088) Abstract:Activity of pectinase produced by Aspergillus niger and Mucor mucedo using pineapple waste as major nutrition was compared, and purifications of crude pectinase produced by Aspergillus niger were discussed. The results show that moisture of media has a key role in increase of pectinase activity for Aspergillus niger. When the moistures of the media were between the ranges of 40%70%, the pectinase activity produced by Aspergillus niger was remarkable higher than that of Mucor mucedo, although the growth of Aspergillus niger was slightly poorer. After purification by ammonium sulfate salting-out, the activity of the pectinase was rose from 68 U/mg to 96 U/mg. Furthermore, two fractions of PF1 and PF2 were obtained by Sephacryl S-300 chromatography from the primarily purified pectinase, which were identified to be exo- and endo-polygalacturonase respectively by analysis of thin layer chromatography. Key words:pineapple waste; Aspergillus niger; Mucor mucedo; pectinase; purification 林华娟， 秦小明， 张初署， 贺阳洋 (广东海洋大学食品科技学院，湛江 524088) 摘要：以菠萝渣为主要营养源，在分析比较了黑曲霉与高大毛霉的产酶效果基础上，以黑曲霉 为菌种生产果胶粗酶，通过硫酸铵盐析和 Sephacryl S-300 柱层析对果胶粗酶进行分离纯化。实 验结果表明，培养基水分含量对黑曲霉产酶效果起到关键性作用，水分含量在 40%70%范围 内，虽然黑曲霉菌体长势不如高大毛霉，但是产酶效果均明显优于高大毛霉。果胶粗酶经过硫 酸铵盐析后酶活力由原来的 68 U/mg 上升到了 96 U/mg。经过 Sephacryl S-300 柱层析分离纯化得 到 PF1 和 PF2 两种酶，薄层层析分析结果表明 PF1 和 PF2 分别为外切果胶酶和内切果胶酶。 关键词：菠萝渣；黑曲霉；高大毛霉；果胶酶；分离纯化 中图分类号：TS 201.2+5文献标志码：A文章编号：1005-9989(2009)05-0070-04 食品开发 70 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 5 期 的重大课题之一。 在菠萝渣综合利用方面，国外开展研究比较 早， 研究主要集中在成分(如蛋白酶)提取3和利用生 物技术生产酒精、醋酸和柠檬酸等生物产品两方 面4-6。我国 1991 年开始有菠萝渣利用研究方面 的报道7，之后相继有一些学者在白兰地果酒、 色素提取方面有少量研究8-9。但是在利用菠萝渣 生产果胶酶方面尚未见有任何报道。本研究尝试 利用菠萝渣发酵生产果胶酶，旨为菠萝渣综合加 工利用提供新的途径。 1材料与方法 1.1菌种 黑曲霉 2214(Aspergillus niger)：中国工业微生 物菌种保藏管理中心；高大毛霉 3.0015(Mucor mucedo)：中国科学院微生物研究所。2 个菌种均 为嗜酸好氧菌株。 1.2培养基和培养方法 1.2.1斜面培养基采用 PDA 培养基。 1.2.2菠萝渣培养基在基本培养基(麸皮 15%， (NH4)2SO40.9 %，CaCl20.075%)上添加适量干或湿 菠萝渣(麸皮与菠萝渣的干质量比为 1.51)，并根据 实验需要调整培养基水分含量。各培养基均在 0.1 MPa 条件下灭菌 30 min。 1.2.3培养方法用无菌水将斜面培养基上的孢 子洗下，移入另一装有无菌水的三角烧瓶，混合 均匀并使孢子浓度调整为 1106，按一定接种量将 孢子悬液接入经过灭菌处理并冷却至室温的菠萝 渣培养基，于 30 培养 72 h。液状培养基采用振 摇方式(240 r/min)培养，其他条件一致。 1.3粗酶液制备 对于固体培养基，加入 3 倍量无菌水浸提 1 h 后，冷冻离心(12000 r/min、4 、10 min)得到的 上清液即为粗酶液；对于液状培养基直接冷冻离 心得到的上清液为粗酶液。 1.4果胶酶活力的测定 1 mL 0.5%果胶酸溶液中加入 0.1 mL 酶液(根 据需要适当稀释)，于 37 反应 30 min 后沸水浴 加热 10 min，冷却后取 0.2 mL 反应液，采用 3,5- 二硝基水杨酸法10测定游离半乳糖醛酸，同时以钝 化失活酶液在相同条件下操作为空白对照。酶活 力单位定义为在上述反应条件下，每分钟水解果 胶酸产生 1 mol 的半乳糖醛酸所需的酶量为 1 个酶 活力单位(U)。 1.5果胶内切酶的层析柱分离纯化 采用 Sephacryl S-300 层析柱进行分离纯化11。 称取 100 mg 果 胶 酶 溶 解 于 适 量 的 0.02 mol/L HAC-NaAC 缓冲液(pH 4.2)，然后上柱于经过相同 缓冲液平衡后的 Sephacryl S-300(2.6 cm80 cm)层 析柱。先用 400 mL 缓冲液洗脱，再用含有 00.15 mol/L NaCl 的相同缓冲液进行梯度洗脱。层析柱流 速为 30 mL/h，以每管 3 mL 收集洗脱液，并检测 洗脱液的蛋白质(280 nm)和果胶酶活性。 1.6蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝法进行测定12， 以牛清蛋白 (Sigma 公司)为标准物质计算蛋白质含量。 1.7薄层层析 用添加有 0.3%羧甲基纤维素钠的 8%硅胶悬 浊液涂布制板，使用前于 110 活化 1 h 备用。展 开剂为正丁醇/乙酸/水=4/6/3(体积比)，展开结束后 于通风厨下风干，然后用 50% H2SO4显色剂均匀 喷雾，100 条件下放置 5 min 显色13。 2结果与分析 2.1菌种的选择 大量文献报道，水分、碳源以及 pH 对霉菌产 果胶酶效果有显著影响。许多霉菌的最适培养基 水分含量约在 70%，作为碳源的果胶以及半乳糖 醛酸等单糖对产果胶酶有很好的诱导作用，另外， 许多产果胶酶霉菌为嗜酸好氧菌株14-16。营养成分 分析结果表明， 菠萝渣除了水分外(水分含量约为 81.6%)， 含有丰富的果胶、单糖、有机酸(以湿质 量计，含量分别为 1.7%、2.5%和 2.0%)以及矿物 质等营养物质，pH 值一般在 4.017。因此推测菠萝 渣适合作为产果胶酶霉菌的营养源。 不同菌种其生长环境适应性有明显的差异18。 为了选择适合于菠萝渣培养基上生长并能高产果 胶酶的菌种，本研究分析比较了在不同水分含量 条件下，黑曲霉和高大毛霉的产酶效果。各培养 基于 30 培养 72 h 后观察菌体的生长情况。实验 结果显示，水分含量较低的固体状培养基上的菌 体均明显优于液状培养基，液状培养基中几乎看 不到菌体。这个结果说明高水分含量均不利于黑 曲霉和高大毛霉的生长。另外，对于固体状培养 基，高大毛霉的长势明显优于黑曲霉。 图 1 为培养基水分含量与霉菌产酶活力的关 系图。从图 1 可以看出，培养基水分含量低于 70%时，黑曲霉的酶活力明显高于高大毛霉，并且 食品开发 71 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 5 期 培养基水分含量在 40%70%范围内，酶活力没有 明显变化。黑曲霉的酶活力高达 258 U/mL，约为 高大毛霉酶活力的 4 倍。随着水分含量的升高， 黑曲霉的酶活力呈直线下降，当水分含量高于 90%时，黑曲霉的酶活力明显不如高大毛霉(分别 为 30.3 U/mL 和 61.2 U/mL)。从以上结果可以看 出，水分含量在 40%70%范围时，菠萝渣均适合 黑曲霉和高大毛霉的生长，但是黑曲霉产酶效果 明显优于高大毛霉。考虑到用湿菠萝渣制备培养 基，不需添加额外水分即可将培养基调整至 65%， 另外，菠萝渣不需任何烘干处理，制备工艺简单， 又可以减少能源消耗。综合评价结果，确定以黑 曲霉为产酶菌种，以湿菠萝渣与麸皮组成比为 4/1 的培养基(其他成分与基本培养基相同)生产制备果 胶酶。 2.2硫酸铵盐析初步纯化果胶粗酶 以黑曲霉为菌种，按以上确定的培养基配比 在相同条件下发酵、制备，得到了果胶粗酶。果 胶粗酶中除了果胶酶以外一般还含有多种非果胶 酶，因此本研究尝试利用硫酸铵盐析方法对果胶 粗酶进行初步纯化。为了确定硫酸铵盐析的最佳 条件，本实验分析比较了硫酸铵饱和度与硫酸铵 上清液酶活力及蛋白质浓度变化的关系，结果如 图 2 所示。 从图 2 可以看出，硫酸铵饱活度低于 0.4 时， 硫酸铵上清液的果胶酶活力没有明显下降，但是 蛋白质浓度呈明显下降趋势。当硫铵饱活度高于 0.4 时，硫酸铵上清液的果胶酶活力和蛋白质浓度 均呈显著下降趋势。从这个结果可以看出，酶活 力较高的蛋白质其大部分分布在硫酸铵饱和度为 0.41 范围内的沉淀部分，表明可以通过调整硫酸 铵饱和度的方法对果胶粗酶进行初步纯化。实验 结果显示，利用硫酸铵盐析方法收集硫酸铵饱和 度在 0.41 范围内的蛋白质沉淀部分，得到的初步 纯化果胶酶的酶活力从原来的 68 U/mg pro.上升到 了 96 U/m g pro.，纯化倍数为 1.4 倍。 2.3果胶酶的柱层析分离纯化 许多霉菌产生的果胶酶都是多种酶组成的混 合酶11,15-16。 为了分析果胶酶的酶组成，本研究参考 Thibault 的方法11，尝试用 Sephacryl S-300 柱层析 对果胶酶进行进一步的分离纯化。果胶酶在 Sephacryl S-300 层析柱上的洗脱曲线如图 3 所示。 从图 3 可以看出，果胶酶经过柱层析分离得 到两个明显的蛋白质峰(PF1 和 PF2)，并且均有明 显的酶活力。这个结果表明，初步纯化果胶酶中 至少存在两种不同性质的酶。分别收集这两个蛋 白峰、浓缩并通过 sephadex G-25 柱层析进行脱盐 处理后得到 PF1 和 PF2 两种酶组分，以蛋白质得 率计，PF1 和 PF2 的得率分别为分离前果胶酶的 83.9%和 6.1%。 为了分析比较 PF1 和 PF2 的果胶酶解方式， 分 别用这两种酶进行果胶酶解(37 、1 h)反应并进 行了薄层层析分析(见图 4)。从图 4 可以看出，PF1 的果胶酶解液中基本上只有半乳糖醛酸酸，而 PF2 的果胶酶解液中出现两个明显糖组分，而且其比 移值均明显低于半乳糖醛酸标准品， 说明这两个组 分为重合度不同的果胶低聚寡糖。这个结果表明， PF1 为外切果胶酶， 而 PF2 为内切果胶酶。以上结 300 200 100 0 20406080100 培养基水分含量/% 果胶酶本科活力/(U/mL) 黑曲霉 高大毛霉 图 1培养基水分含量与黑曲霉和高大毛霉产果胶酶效果 的关系 00.20.40.60.81 40 30 20 10 0 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质浓度/(mg/mL) 酶活力/(U/mL) 硫酸铵饱和度 酶活 蛋白质浓度 图 2硫铵盐析饱和度与上清液果胶酶活性及蛋白质含量的 关系 050100150200250300 3 2 1 0 0.3 0.2 0.1 0.0 NaC 浓度/(mol/L) 管数(3 mL/tube) Abs.280nm 酶活力/(U/mL) 280 nm 酶活力/(U/mL) PF1 PF2 图 3果胶酶在 Sephacryl S-300 柱层析上的洗脱曲线 食品开发 72 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 食 品 科 技 2009 年 第 34 卷 第 5 期 果表明黑曲霉产生的果胶酶中，主要由外切果胶 酶和内切果胶酶组成。 3讨论 从以上实验结果可以看出，培养基水分含量 在 40%70%范围时，菠萝渣均适合黑曲霉和高大 毛霉的生长，但是黑曲霉产酶效果明显优于高大 毛霉(约为高大毛霉的 4 倍)。另外，本实验得到的 果胶酶的酶活力(68 U/mg pro.)也明显高于另外一些 霉菌源果胶酶的酶活力18。这个结果表明可以以黑 曲霉作为菌种有效利用菠萝渣生产果胶酶，这为 菠萝渣高值化利用又增加了一条新途径。为了提 高果胶酶的使用效率和经济价值，有必要对果胶 粗酶进行分离纯化。经过硫酸铵盐析初步纯化后 (硫酸铵饱和度在 0.41 范围内的蛋白质沉淀部分)， 果胶酶的酶活力从 68 U/mg pro.上升到了 96 U/m g pro.。利用 Sephacryl S-300 柱层析进行进一步的分 离纯化，得到 PF1 和 PF2 两种果胶酶。薄层层析 分析结果表明，PF1 和 PF2 分别为外切果胶酶和 内切果胶酶，说明利用菠萝渣发酵生产得到的果 胶酶中含有外切果胶酶和内切果胶酶。这个结果 与许多文献报道的霉菌源果胶酶一般是由多种不 同酶解方式的果胶酶组成相一致11,15。在食品工业 应用上，对果胶酶纯度要求一般不是很高，但是 如果用于化学结构分析或者需达到可控定向酶解 目的，就必须对果胶酶进行分离纯化以获得单一 的果胶酶19。为了更好地发挥果胶酶的使用价值， 对果胶酶进行分离纯化后，还需要进一步了解果胶 酶的酶学特性，下一步将对以上分离纯化获得的果 胶酶进行酶学特性研究。 参考文献： 1陈富桥,祁春节,易干军.全球菠萝贸易与消费市场分析 J.世界农业,2003,(7):22-24 2杨礼富,谢贵水.菠萝加工废料-果皮渣的综合利用J.热 带农业科学,2002,(8):67-71 3Hebbar H U, et al. 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