微乳凝胶固定化酶催化长链脂肪酸酯的合成.pdf

第 l 9卷 第 4期 2 0 0 0年 7月 无 锡 轻 I 大 学 学 报 J o u r n a l o f W u x i Un i v e r s i t y o f Ll g h t I nd u s t r y Vo 1 1 9，No 4 】 ， 2 0 0 0 文章编 号 ： 1 0 0 90 3 8 X( 2 0 0 0 ) 0 4 0 3 6 10 4 微乳凝胶固定化酶催化长链脂肪酸酯的合成 弓 卜 ； 6 三 ， 。 胡 学 铮 ， 殷 福 珊 ( 无锡轻工大学化 学与材料 工程 学院， 江苏无锡 2 1 4 0 3 6 ) TO 一 Qs i 摘要 ：研究 了以 AOT ( 二( 2 乙基 已基) 琥珀 酸酯 磺酸钠) 正庚 烷 水明胶 组成的 反相 微乳 凝胶 固定化脂肪 酶 在有机溶剂 中催化 棕桐 酸和 十六醇 的酯化反应 反 应在 2 5 下进行， 固定化 脂肪 酶 重复使用 1 6次后， 平衡 转化 率仍 可达 9 0 反 应 既可用釜 式反应器 又适 用柱式反应 器 产物通 过冷却的反应液 后沉淀析 出， 回收率可达 6 5 ， 产品纯度 高 、 关 键 词 ： 型 ； 旦 塞 堕 堕 堂 ； 堕 丹 舂 自 夤 两 昌 j矗 中图分类号 ： 1 6 4 5 5 6 文献标识码 ：A S y n t h e s i s o f Lo n g - c h a i n F a t t y Ac i d Es t e r b y Li p a s e I mmo b i l i z e d b y M i e r o e m u l s i o n b a s e d Or g a n o - g e l i n Or ga ni c M e di a LI U J u n k a n g ，LI U Yi n g ( S c h o o l o f Ch e mi c a n d Ma t e r i a l En g i n e e r i n g HU Xu e - z h e n g ，YI N Fu s h a n Wu x i Un i v e r s i t y o f L i g h t I n d u s t r y Wu x l 2 1 4 0 3 6 ) Ab s t r a c t ：I n t h i s p a p e r ，t h e c a t a l y t i c a l e s t e r i fic a t i o n o f p a l mi d c a c i d wi t h 1 - h e x a d e c a n o l b y l i p a s e i m mo b i l i z e d b y mi c me mu l s i o n - b a s e o r g a n o - g d t h a tn s i s t e d o f b i s 一 ( 2 - e t h y l h e x y 1 ) s o d i u m s u l p h s u c c i n a t e ( A OT) h e p t a n e wa t e r g e l a t i n i n a p o l a r o r g a n i c s o l v e n t wa s s t u d i e d Th e t e mp e r a t u r e o f t h e r e a c d o n s y s t e m w 2 5 Af t e r 1 6 t i me s r e p e a t e d u s e s t he p e r c e n t c o n v e r s i o n o f p a l m a c i d wa s b i g g e r t h a n 9 0 Th e c a t a l y s t c a n n o t o n l y b e u sed i n b a t c h r e a c d o n b u t a l s o b e u s e d i o a p a c k e d be d o f t h e i m mo b i l i z e d l i p a seTh e p r o d u c t c a n b e d e p o s i t e d O u t b y c o l d i n g r e a c t i o n s o l u t i o nTh e r a t e of r e c o v e r y o f I - h e x a d e c a n o l p a l mi t a t e wa s mo r e t h a n 6 5 Th e p u r i t y of p r o d u c t wa s v e ry h i g h Ke y wo r d s ：mi c me mu l s i o n - b a s e o r g a n o - g e l s ；i mmo b i l i z e d l i p a se ；e s t e r ； f i c a t i o n 自从 1 9 8 4年 Al e x a n d e r MKl i n a n o v等人发现 酶在有机溶剂中仍有催化活性后 ， L u i s i 及其合 作 者制作出以 A r 异辛烷 水 明胶组成的反相微乳 凝 胶【 2 j ，井 把 生 物 酶 固 定 在 凝 胶 中通 过 NMR、 C D、 TE M、 S E M研 究 了凝 胶 的结 构L 3 j ， 发 现反相微乳 凝胶 固定 化酶溶 于反相 胶 束的 小水 浦 中， 保持 了反相胶束体 系中酶反应的优点 该凝胶 不溶于大多 数有 机溶 剂 ， 在 3 0 以 下有 一定 的机 械强度 但遇 水会溶 胀破碎 用该 凝胶 固定脂肪 酶 在有机溶剂中催化脂肪酸和脂肪醇的酯化反应， 具 有反应体系简单、 产物分离容易、 反应条件温和、 酶 活性保持时间长 、 酶重复使用方便等优点 反应既 可在釜武 反 应器 中进 行， 又适 合柱式 反应 器， 便 于 生产规模 的扩大 国 内从 2 0世 纪 9 0年代 起对有 机溶剂 中脂肪酶催 化酯合 成进行 了一些 研 究 J 但用 反相 微乳 凝 胶 固定 化 酶在 有机 溶 剂 中催化 醑 收稿日期： 1 9 9 9 1 2 0 1 ： 捧订 日期 ： 2 0 0 0 0 4 0 4 作者简介 ：刘俊康 ( 1 9 6 4 一) ， 男 江苏吴县人， 理学学士， 副教授 维普资讯 无锡轻I大学学报 第 1 9卷 化反应还 未见报道 脂肪酸酯是一 大类重 要 的有机 化合物 广泛应 用于 食 品、 饮 料 、 饲 料 、 化 妆 品及 医药 等 日常 用 品 中， 直接从动植物 中提 取 已无 法满 足 日益 增长 的需 求 为此， 人 们把研 究 目光转 向生 物方法 来合成 ， 酶 催化合成的产品被公 认为是 “ 天然 ” 产 品 棕榈 酸 十 六酯 为蜡状 的 吸 留性物 质 ， 是优 良的柔 润剂 ， 可 用 于化 妆品 中， 具有 和皮 肤的 亲和 性好 、 可 生物 降解 等优 点 1 材料 与 方 法 1 1 材料与仪器 脂肪酶1 0 0 0 0 0 U mL ， NOVO公 司提 供 i 庚 烷分析纯， 杭州炼油厂生产； A O T( 二 ( 2 乙基 已 基) 琥珀酸 酯磺酸钠 ) 上海试剂二 厂生产 ； 明胶 化学纯 上海 化学试 剂站 分 装厂 分装 ； 棕 榈酸 化 学纯 ， 海盐 日用 化工 厂 生产 ； 十 六醇化学 纯， 锡 山 洪声化工 厂生产 ； 其它 脂肪酸 和脂 肪醇均为 化学 纯 试剂 T J 2 7 0 - 3 0型红 外 分光 光度计天 津 光学 仪器 厂制造； WI ， 1显微熔点测定仪 厦门教学仪器厂 制造 1 2 实验方法 1 2 1 含酶反相微乳凝 胶的制备在 5 0 mL的具 塞三 角烧瓶 中加 入 固体 明胶 、 去离 子 水、 AOT和庚 烷 ， 在电磁力 搅 拌下 ， 加 热 到 4 5 5 0 。 保 温到 明 胶固体颗粒全部溶解后， 加入一定量的酶液， 搅匀 后， 冷却到 3 O 以下， 停 止搅 拌， 放 置 一段 时 间即 得到透明的含酶微乳 凝胶 1 2 2脂肪酸 酯的合 成夏 分 离方 法称取一 定 量 的含酶微乳凝胶 制成一定大小的颗粒， 放入 5 0 mI 的具塞三 角烧 瓶 中， 烧 瓶 放入烧杯 中水 浴恒温 在 2 5下， 加入 2 5 mL棕榈 酸和 十六醇的 庚烷溶液 反应立即开始 用恒温 电磁搅 拌器 搅拌 定时吸取 1 mL反应液放入盛 有 5 mL体积比为 1 ： 4的苯 乙醇 溶液的三角瓶中， 以酚酞作指示剂， 用 0 0 2 5 m o l L 的 Na O H 的乙醇溶液 滴 定反 应 液 中的棕 榈 酸来 确 定反应进程 柱式反应 是把 含酶凝胶颗 粒填 充在 一 层析柱中 将棕榈酸和十六醇的庚烷溶液按一定速 度滴加， 用上述滴定方法确定流出液 中抹榈酸的质 量分数 反应达平衡后， 收集产物到 1 5 0 mL的具塞 三角烧瓶 中， 把具塞 三 角烧 瓶冷却 到 7 ， 棕 榈 酸 十六酯的溶解度降低， 有大量白色晶体析出， 立刻 减压过 滤 即 得 晶体 ， 晶 体 用 红 外 灯 烘 干 ( 烘 去 庚 烷 ) ， 称重 1 2 3 棕拥酸 十 六酯熔点 的测定 将分离得 到的 干燥产品( 晶体) 放在表 面皿 中用玻棒研细后， 取少 许放在一薄玻璃片上， 再用 另一相同的玻璃 片盖 上 放 在 WL - 1显微熔 点测 定仪 上， 慢 慢升温 在放 大镜 中观察晶体熔化时温度计的读数， 即为熔点 1 2 4棕搁酸 十六醋 红外 光谱 的测定将 上述 分 离得到 的少量干燥 产 品( 晶体) 放进盛有烘干 的 K B r 晶体 的玛瑙 研钵 中 ， 研细 后压 成盐 片， 在 T 3 2 7 0型 红外 分光 光度 计上扫描得到红外谱 图 ， 2 结栗， 一 与讨论 2 1 固定 化酶对酸 醇鹭化反应的选择性 十六酸和十六酵分别和 不同碳链的酵和酸 的 反应结 果如表 1所示 可知 十六酸和 8种不同碳链 长度的醇 反应 的初 速 度 随着 链 长的增 加呈 下降 的 趋势， 这和不 同链长的 醇( 异 丙 醇除外 ) 在 凝胶中 的 扩散 速度 有关 不 同链长 的醇和 十六 酸反应 的转 化 率基本相 同， 异丙 醇等亲水性 太强 的 醇反 应初速 度 小， 而且 4 8 h的转化率也 只有 2 3 表 1 十 六酸 和十 六醇 分别 和不 同碳 链 的醇 和酸反 应结 果 Ta b 1 T h e r e s u l t 0 f p a l m l t t c a c i d a n d 1 - h e x a d e c l mo l t -e B ct i n g wi l h d i f f e r e nt al c o ho l an d ac i d 十六 酸 十 六醇 醇 相对 初 2 4 h转 酸 相 对初2 4 h转 速 度 化率 一 速 度 化 率 异 丙醇 2 0 2 3* 丁酸 1 9 4 3 2 6 丁醇 1 0 0 9 2 3 戊酸 2 9 3 B 7 戊醇 6 2 5 9 2 3 辛酸 9 6 B 9 2 9 异戊 醇 6 9 3 9 2 十 二酸8 5 5 9 3 9 癸醇 6 2 5 9 3 5 十 四酸 1 0 0 9 3 9 十 四醇 5 5 7 9 3 2 十六 酸 7 1 9 3 6 十六醇 3 7 5 9 3 2 油酸 8 8 7 9 2 9 十 八醇 3 4 1 9 3 十 八酸 5 8 8 4 注 * 为 4 8 h的转 化率 十六醇和不同链长的酸的反应情况较复 杂 从 相对初速 度来看 十 四酸的反 应速 度最 快 而 辛酸 、 十二酸、 十 四酸、 十六酸和油酸 的相对初速度也较 快； 从 2 4 h转化率的数据可以看出， 丁酸和戊酸的 转化率较小， 其它酸的转化率都在 9 0 左右 反应相对 初速度 主要与酶 的选择 性和反应底 物的扩散速度有关 从以上结果可以推 出 该酶对 中、 长碳 链 的酸选 择性 较 好 ； 油 酸 由于 扩 散性 比十 八酸和 十六酸 好， 所 以反 应 相对 初速度 高 亲水性 太强的丙醇、 乙醇等 能和水混溶， 因此会进入凝胶 的微乳液滴中， 对酶分子 的括性和结构都可能产生 维普资讯 第 4期 刘俊康等 ： 微乳凝肢 固定化酶催化长链脂肪酸酯 的合成 3 6 3 影响 ， 因此不但反应速度慢 ， 而且转化率也较低 2 2 含酶凝胶加人量 对醋化 反应速度的影响 不同凝胶量对 0 1 mo Vl 的棕榈 酸和十六醇的 酯化反应的反应初速度的 影响 见表 2 当凝胶量为 I 7 g时， 它与相对 反应 初速度基 本上成 线性关 系， 回归出通过原点的线性方程为 ： ：1 0 6 7 3 ( R2 = 0 9 9 7 9 ) 当凝胶 量为 1 0 g时， 反 应 初速 度开 始 向 下偏离 这说明对 0 1 mo l L的棕榈酸 和十六 醇 的 酯化反应来 说， 当凝胶量小于 7 g时 ， 反应 主要是 由 动力 学控制， 内扩散 可 以忽 略 ； 当 凝胶 量大 于 1 0 g 时， 内扩散速 度小 于反 应速 度， 这 时 内扩散影 响就 不可忽略 在工业 生产 中要 根据 反应速度和 生产 成 本两因索来确定含酶凝胶的最佳 用量 寰 2 援胶用量对相对反应初速度的影响 Tab- 2 Th e e ffe c t of o r g a no - g e l I J s e l e v e l on r e l at i v e r e ac t i v e i n J t i a l v e l o ci t y 凝腔 用量 g 相 对反 应韧 速度 1 1 2 5 3 3 3 5 5 4 3 7 7 3 3 0 1 O 0 2 3 微乳凝 胶重复使 用情况 微乳凝胶固定化酶的重复使用 可大大降低成 本 经 1 4 d的重复使用发现， l 6次反应的平衡转化 率均达到 9 0 以上 ， 见表 3 且前 1 1次达 到平衡 的 时间都在 1 2 0 rain内， 从第 1 2次开始达到平衡的时 间在 1 5 0rai n内 寰 3 诒乳凝腔固定化酶的重复使用情况 T a b 3 T h e c B s e o f r e p e t i t i v e ma n i p u l a t i o n o f l I p e i m mo b i l m i c r o e mu l s i o u b a s e d o r a n o - g e l 重 复 次 数 笳 重 复 次 数 I 2 9 2 2 2 1 0 2 3 2 1 I 2 4 2 I 2 2 5 5 2 1 3 2 5 6 2 1 4 2 5 7 2 l 5 2 5 8 2 1 6 2 5 注： 反应条件为酶质量浓度 1 0 mg mL的微乳凝腔 8 ， 反应 温度 2 5。 搅拌速度 1 5 0 r rai n 柠榈酸、 十六醇浓度均 为 0 1 0 r n o l L 2 4 反应液的重 复使 用情况 回收液 的循环 使用 是 该方 法 是否 有 实用 意 义 的关键 加入棕榈酸和十六醇， 配成酸和醇的浓度 均为 0 ， 1 mo ml 的庚烷溶液 ( 以下简称回收液) 新配的 0 I mo l l ， 棕 榈酸和 十 六醇溶 液( 以下 简称 新配液 ) 分 别用 回收液 和 新配 液作 反应 液 进行 反 应， 6 0 rai n的 反应进程 见图 1 可 以看 出， 回收液 和 新配液 在 6 0 rai n内反应速 度基本相同 ， 说 明回收液 中的棕榈酸十六酯对酶催化反应基本没有抑制作 用， 所 以对 反 应速 度几 乎无 影 响 但反应 的平衡 转 化率还是不同的， 实验测出回收液的反应平衡转化 率 为 9 2 7 ，而 新 配 液 的 反 应 平 衡 转 化 率 为 9 3 4 。 说明橡榈 酸 十 六酯 对 反应 平 衡 有影 响 ， 产 物的加入会使平衡 向逆反应方向移动 反应时闻 田 i n 反应条件 ：酶质量浓度为 7 5 mg ， m L的微乳凝腔 5 g ， 反应温度 2 5 搅拌速度 1 5 0 r rai n ， 檬榈酸、 十六醇浓 度均 为 0 1 0 d L 圉 l 回收液和新配液的反应进程 g 1 1 k r e a c t i v e p r o s r e s s c u m o t r e c u p e r a t e d B o - I Uo n a nd ne w pr e pm- J v e s o l a 2 5 用流动柱反应器合成棕榈酸十六醋 用一根内径为 1 8 c m的层析柱作为管式反应 器， 装柱 后凝胶高度 为 2 5 c m 在 2 5下试验 了浓 度为 0 1 0 mo V 1 的棕榈酸和十六醇溶液在不 同体 积流量下的反应转 化率 ， 结果见表 4 在 3 0 mL h的 体积流量时， 反应 转化 率可 达 9 3 5 ， 和 釜式反 应 平衡转化率相同 此后， 随着体积流量的提高， 转化 率逐渐 降低 体积流量为 3 0 mL h时， 柱反应器的流出体积 和棕榈酸浓度的关系见图 2 当流 出体积为 2 5 mI 时， 反应液开始流出 流出体积为 4 0 mL后， 反应趋 于 稳 定 表 4 不同体积流量下的反应转化宰 Ta b 4 Th e r e a c t i v e p e r c e n t c o nv e r s i o n o f d i ffe r e n t v ol u me t r i c f l o w 体积 流量 ( mL ) 转 化率 3 0 4 0 7 0 93 5 9 “2 0 7 9 8 芝哥草挥 维普资讯 3 6 4 无锡轻I大学学报 第 1 9卷 拿 喜 越 强 制 霉 圈 2柱式 反应 流 出曲线 Fi g 2 T h e e i u t i o n c B - v e o f c y l i nd r i c r e a c t i o n 2 6 分 离回收和产品鉴定 反应液冷却到 7 时 ， 产 品回收率 达 6 5 见 表 5 表 5棕桐 酸十 六叠 分离 数据表 T a b 5 T h e d s t a s h e e t o f p f y i n g p a l mi t i c a ci d I - he x a de s t e r 注 ： 1 ) 用 0 0 2 5 mo l L Na OH的 乙醇溶 液滴 定 测得 ； 2 ) 把 产 品溶解 于庚烷 中配 成 的溶液 过滤后的母液可重复使用 在过滤 时，棕榈 酸 十六酯晶体 吸附较多 的庚烷 如能 改用象 压滤这 样 的过滤方式， 可减少庚 烷 的吸 附， 从 而使 产 品更 纯 用 wL 1 显微 熔 点 测定 仪 测得 产 品 熔 点为 5 2 5 3 参考文献 。 和 棕榈 酸十六 酯 文献 值 ( 5 3 5 4 ) 基本相 近 用 T J 2 7 0 3 0型红外 分光光 度计 测定。 未发现 。一H 伸缩振动峰( 见图 3 ) ， 可认 定 产 品 中棕 榈 酸和 十六 醇的量极 少 酱 捌 蝌 圈 3棕橱 酸十 六叠 红 外光 谱 围 g 3 Th e m s p e c t r u m O pl a mt t i c a dd 1 - h e x a de s t e r 3 结论 用反 相微 乳凝胶 固定 化脂肪 酶 ， 以庚烷作 溶 剂 在 2 5下催化 棕 榈酸 十 六 酯 的合成 ， 反应 体 系 简 单 ； 生物催化剂重复使用 l 6次， 1 4 d 后反应平衡转 化率 仍可达 9 0 以上 而反 应达到 平衡 的时 间只需 22 5 h 。 增加凝胶 量或 提 高凝胶 中脂肪酶 的质量 浓度 ， 反 应 完 成时 间还 可进