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响应曲面法优化西兰苔总黄酮的提取工艺条件 王冰芳,张学武 3 (华南理工大学轻工与食品学院,广东广州510641) 摘要 研究利用超声提取西兰苔叶子黄酮化合物的优化工艺,利用响应曲面法研究乙醇浓度、 料液比、 温度对西兰苔总黄酮提取率的影 响。研究表明,西兰苔总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇浓度70%、 料液比127、 温度70,此时西兰苔总黄酮得率达11. 958 9 mg/g。 关键词 西兰苔;总黄酮;提取;响应曲面法 中图分类号 S635. 9 文献标识码 A 文章编号 0517 - 6611(2010) 01 - 00359 - 04 Opti m ization of Total Flavonoids Extraction from M ini Broccoli by Response Surface M ethodology WANG Bing2fang et al (College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou, Guangdong 510641) Abstract The paper aimed to study the optimal conditionsof flavonoids from mini broccoli leaves by ultrasonic. Response surface methodolo2 gy (RS M) was used to study effects of ethanol concentration extraction, solid2liquid ratio, extraction temperature. The results showed that the optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration 70% , solid2liquid ratio 127, extraction temperature70. In this case, the extraction rate of total flavonoids from leaves reaches 11. 958 9 mg/g . Key words Mini broccoli; Total flavonoids; Extraction ; Reponse surface 作者简介 王冰芳(1985 - ) ,女,江西鹰潭人,硕士研究生,研究方向: 天然产物活性。3 通讯作者,博士生导师,教授, E2mail: snow_dancesina. com。 收稿日期 2009208224 西兰苔是由西兰花与芥兰杂交后代选育而成的一种新 型蔬菜,又称小小西兰花。西兰苔主要以肥嫩的花苔供食 用,富含黄酮、 硫苷化合物、 维生素、 蛋白质、 花青素、 矿物质 等多种营养成分。此外,西兰苔还有健胃助消化、 抗癌的药 用价值,是一种高品质、 高档次的功能型绿色蔬菜 1。 目前黄酮提取方法主要为有机溶剂回流法和超声法。 超声提取能加速提取成分的扩散、 释放并与溶剂充分混合而 利于提取,超声提取无需加热,提取时间短、 温度较低、 收 率高 2 - 3。 通过研究乙醇提取西兰苔黄酮工艺条件,在单因素试验 的基础上,对影响西兰苔黄酮得率的提取温度乙醇浓度和 液料比等因子进行初步探讨,再借助试验设计软件Design Expert,采用响应面法的中心组合设计(CCD)考查各因素单 一和交互作用等对西兰苔黄酮类化合物提取效果的影响,得 出西兰苔黄酮乙醇提取工艺最优条件,旨在为西兰苔黄酮的 进一步开发利用提供技术支持 4 - 5。 1 材料与方法 1. 1 材料 西兰苔:广州市蔬菜研究所。芦丁(生化试剂, Sigma公司)、 无水乙醇、Al(NO3)3、NaOH、NaNO2均为分析 纯。10 ml容量瓶及JLL3502B多功能粉碎机(顺德市科塑塑 料电器有限公司);UV22300型紫外可见分光光度计(上海天 美科技有限公司) ; EYELA型旋转蒸发器(上海爱明仪器有 限公司); Thermo型真空冷冻干燥箱(广州三元科技有限 公司)。 1. 2 方法 1. 2. 1 总黄酮含量测定原理 6。黄酮含量测定采用硝酸铝 络合分光光度法,其原理是以芦丁做标准,采用分光光度计 法测定样品中黄酮类物质的含量,黄酮类化合物能与铝离子 生成稳定的络合物,该络合物在波长510 nm有特征吸收峰, 其吸光值与总黄酮含量呈正比,于510 nm波长处比色定量 测定。 1. 2. 2 芦丁标准曲线的绘制 6。将芦丁于 120 烘箱中烘 至恒重,于干燥器中冷却后精密称取干燥至恒重的芦丁对照 品20 mg,置于100 ml容量瓶中,超声波下使其溶解,用60% 乙醇定容至刻度,此溶液即为含芦丁0. 2 mg/ml的芦丁标准 液。分别移取0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 ml的芦丁标准液于6 个10 ml容量瓶中、 各加0. 3 ml 5%的NaNO2溶液摇匀,放置 6 min。再各加0. 3 ml 10% Al(NO3)3溶液摇匀,放置6 min。 继续加入4. 0 ml 4%的NaOH溶液,用60%乙醇定容至10 ml,放置15 min。在510 nm处测定吸光度,以浓度(mg/ml) 为纵坐标,吸光度(A)为横坐标作标准曲线,结果见图1。 图1 芦丁的标准曲线 Fig. 1 Standard curve of rutin 1. 2. 3 西兰花中总黄酮的提取和测定 4。准确称取 0. 5 g 西兰花粉至锥形瓶中,按照要求加入一定量的提取剂,在一 定温度下超声提取一定时间,抽滤,滤液用60%乙醇定容至 50 ml作为待测液。取1. 5 ml待测液于50 ml容量瓶中,按 “1. 2. 2” 试验方法测其总黄酮含量,根据下式计算黄酮得率: 黄酮得率Y(mg/g) =m1V1/m2V2 式中, m1为依据标准曲线计算出被测液中黄酮含量(mg) ;V1 为待测液的总体积(ml) ;m2为称取的西兰花粉的质量 (g); V2为待测液分取的体积(ml)。 1. 3 单因素试验设计 1. 3. 1 提取溶剂对提取工艺的影响。分别用水、 乙醇、 甲醇 为溶剂对西兰苔中黄酮类物质进行提取。 1. 3. 2 料液比对提取工艺的影响。在超声温度60、 提取 安徽农业科学, Journal ofAnhuiAgri .Sci . 2010, 38(1) : 359 - 362责任编辑 李菲菲 责任校对 况玲玲 时间60 min、 乙醇浓度80%条件下,探讨西兰苔和乙醇的料 液比对西兰苔黄酮提取效果的影响。 1. 3. 3 提取温度对提取工艺的影响。在料液比125、 提取 时间60 min、 乙醇浓度80%条件下,探讨温度对西兰苔黄酮 提取效果的影响。 1. 3. 4 乙醇浓度对提取工艺的影响。在料液比125、 提取 时间60 min、 温度60 条件下,探讨乙醇浓度对西兰苔黄酮 提取效果的影响。 1. 4 响应曲面优化试验的设计 在单因素试验结果的基础 上,综合各因素对西兰苔总黄酮得率的影响,确定3个主要 因素,采用统计软件Design Expert( version 5. 0. 7, Stat2Ease Inc. ,Minneapolis,MN. USA)中的中心旋转组合设计(Central Composite Rotatable Design, CCRD) ,以乙醇浓度、 提取温度、 料液比为自变量,分别以X1、X2、X3为代表,以黄酮的提取率 为因变量进行分析。因子编码及水平见表1。 表1 响应曲面分析因素与水平 Table 1 Analytical factors and levels of RSA 水平 Level 因素Factor 提取温度(x1 ,A) Extraction temperature 乙醇浓度(x2 ,B) % Ethanol concentration 液料比(x3 ,C) Solid2liquid ratio - 15060120 06070125 17080130 根据相应的CCD试验方案进行试验后,利用最小二乘 法拟合响应值与自变量之间的关系方程: Y=B0+B1x1+B2x2+B3x3+ B12x1x2+ B13x1x3+B23x2x3 +B11x 2 1+B22x 2 2+B33x3 2 式中,Y为响应值,B0为常数项,B1、B2、B3分别为线性系数, B12、B13、B23为交互项系数,B11、B22、B33为二次项系数。 2 结果与分析 2. 1 单因素试验结果 2. 1. 1 提取溶剂对提取工艺的影响。由图1可知,水作溶 剂时黄酮提取率最低,乙醇和甲醇提取效率差不多。因此, 笔者选择乙醇作为西兰苔中黄酮类物质的提取溶剂。 图1 溶剂对提取率的影响 Fig. 1 Effects of different reagents on extraction rate 2. 1. 2 料液比对提取工艺的影响。从图2可以看出,随着 料液比的扩大,总黄酮的得率不断提高,当料液比从110扩 大至125时,总黄酮的得率增加趋势非常大,之后增幅较 小。这是由于料液比扩大可增加物料与溶剂的接触面积,使 得黄酮类物质更充分地溶解出来;但料液比过大也会造成杂 质过多溶出,使得进一步的浓缩消耗更多的能量和时间,同 时也会阻碍黄酮的溶出,所以确定最佳料液比为125。 图2 料液比对黄酮提取的影响 Fig. 2 Effects of ratio of solid2liquid on total flavonoids extrac2 tion 2. 1. 3 提取温度对提取工艺的影响。由图3可知,在对西 兰苔总黄酮提取时,随着温度的升高,总黄酮在乙醇中溶解 度不断增加,得率不断增大,在温度达到60 时,得率达到 最大值,60 以后黄酮得率呈下降状态,因为温度过高会破 坏西兰苔中的黄酮,温度的加大也会增加杂质的溶出。 图3 提取温度对黄酮提取的影响 Fig. 3 Effects of extraction temperature on total flavonoids ex2 traction 2. 1. 4 乙醇浓度对提取工艺的影响。由图4可知,黄酮得 率随乙醇浓度的增加而升高,但由于乙醇浓度过高时,沸点 下降,导致挥发过大,同时一些醇溶性杂质、 色素、 亲脂性强 图4 乙醇浓度对黄酮提取的影响 Fig. 4 Effects of ethanol concentration on total flavonoids ex2 traction 的成分溶出量增加,从而导致黄酮类化合物提取率下降。因 此,最适乙醇浓度为80%。 063 安徽农业科学 2010年 2. 2 响应曲面试验结果 采用Design Expert进行试验设计 以及数据分析,试验值和预测值见表2。对表2试验数据进 行多元回归拟合,得到超声波提取西兰苔黄酮的二次多项回 归模型方程。提取温度 (x 1)、 乙醇浓度 (x 2)、 料液比 (x 3)与 黄酮得率之间的二次多项方程: Y=8.71 +0.40x1+2.68x2+0.43x3+0.58x1x2 +01021x1x3+0.37x2x3- 0.26x1 2 - 0.28x2 2 +1.10x3 2 对该模型方程进行方差分析和显著性检验,结果表明, 提取温度、 乙醇浓度、 料液比3因素对黄酮得率的效应显著, 各因子间交互作用比较明显。在该试验设计范围内,该模型 回归显著(P0. 000 1) ,模型的复相关系数为0. 994 9,模型 的校正决定系数AdjR 2 = 0. 988 4,说明该模型能解释 98184%响应值的变化,即该模型与实际试验拟合良好,试验 误差小,证明应用响应曲面法优化西兰苔总黄酮提取是可行的。 2. 3 响应曲面分析 由图57可直观地看出,乙醇浓度、 温度、 料液比的交互作用较显著。等高线的形状可反映出交 互效应的强弱大小,椭圆形表示2个因素交互作用显著,而 圆形则与之相反。 表2 响应曲面试验设计与结果 Table 2 Response surface design and results of flavonoids extraction 试验号 TestNo. 提取温度 (x1) Extraction temperature 乙醇浓度 (x2) Ethanol concentr2 ation 料液比 (x3) Solid2 liquid ratio 得率真实值 mg/g Yield of true value 得率预测值 mg/g Yield of predicted value v 1- 10- 16. 726. 47 2- 1- 105. 405. 65 3- 1109. 809. 86 4- 1017. 367. 29 51- 105. 385. 31 610- 17. 176. 56 71017. 908. 14 811012. 0711. 82 901- 18. 969. 15 100008. 758. 71 110008. 648. 71 120008. 818. 71 130- 1- 14. 544. 54 140008. 678. 71 1501110. 7510. 76 160- 114. 834. 65 170008. 688. 71 图5 提取温度、 乙醇浓度的响应曲面图 Fig. 5 Response surface plots of extraction temperature and ethanol concentration 图6 提取温度、 料液比的响应曲面图 Fig. 6 Response surface plots of extraction temperature and solid2liquid ratio 在选取的各因素范围内,根据回归模型通过Design Ex2 pert软件分析得出,西兰苔黄酮最佳提取条件为:提取温度 69. 82、 浓度70%、 料液比126. 80,黄酮得率的预测值为 11. 958 9 mg/g。考虑到实际操作的便利,确定西兰苔黄酮的 优化提取工艺条件为:提取温度70、 浓度70%、 料液比 127。为了证实预测结果,用试验中得到的最佳条件重复试 163 38卷1期 王冰芳等 响应曲面法优化西兰苔总黄酮的提取工艺条件 验3次,得总黄酮含量分别为11. 955 6、11. 954 7、11. 953 8 mg/g,与预测值为11. 958 9 mg/g基本一致,即该方程与实际 情况拟合很好,响应曲面法适用于对西兰苔黄酮的乙醇回流 提取工艺分析和参数优化。 图7 乙醇浓度、 料液比的响应曲面图 Fig. 7 Response surface plots of ethanol concentration and solid2liquid ratio 3 结论 (1)通过采用中心组合设计试验和响应面分别表明了提 取温度、 乙醇浓度、 料液比对西兰苔黄酮得率的影响,回归方 程为Y= 8.71 + 0.40x1+ 2.68x2+ 0.43x3+ 0.58x1x2+ 01021x1x3+0.37x2x3- 0.26x1 2 - 0.28x2 2 + 1.10x3 2。方差分 析结果表明,拟合检验极显著,决定系数达0. 994 9,该方程 能较好地预测西兰苔黄酮提取得率随各参数变化的规律。 (2)响应曲面法优化西兰苔总黄酮的最佳工艺条件:提 取温度70、 浓度70%、 料液比127,黄酮得率为11. 958 9 mg/g。 (3)响应曲面法能对西兰苔黄酮的超声提取工艺进行回 归分析和参数优化。 参考文献 1黄云鲜,吴小明,叶志文.西兰苔栽培技术浅析J .南方农业,2009,1 (1):14 - 15. 2靳素荣,徐墨,雷家珩,等.超声提取荷叶黄酮的工艺研究J .食品科 技,2007,10(10):97 - 99. 3张颖心,何潮洪.从毛竹叶中提取总黄酮的工艺研究J .高校化学工 程学报,2006,20(5):691 - 695. 4许晖,孙兰萍,张斌,等.响应面法优化花生壳黄酮提取工艺的研究 J.中国粮油学报,2009,24(1):107 - 111. 5蔡为荣,顾小红,汤坚.仙人掌皮黄酮提取工艺优化J .农业工程学 报,2008,24(6):299 - 303. 6吴华勇,黄赣辉,顾振宇,等.响应曲面法优化竹叶总黄酮的提取工艺 研究J .食品科学,2008,29(11):196 - 200. (上接第310页) 物超标的影响,水质达标率相对较低。由于氟化物超标属背 景值超标,不纳入超标评价范围,因此,地下水型水源地水质 达标率也较高。 同时通过比较可以看出,安徽省长江以南地区和江淮之 间地区的水源地达标率明显要高于淮河以北地区,其原因主 要是同区域地理位置、 气候等多种因素有关,另外上游水源 的水质情况对于安徽省部分水源地水质的影响也较大。因 此,淮河以北地区的水源地保护工作十分严峻。 3. 2 水源地保护措施建议 为了保障城镇居民生活饮用水 的安全,保护水源地的工作必须及时有效地开展,建议针对 水源地类型分别实施水源地保护。 (1)对于河流型,应加强上游污水团下泄季节和人为因 素特征的分析及了解,早预防早准备,并积极规划建设应急 或备用水源地;生态补偿机制是控制流域水污染的有效途 径 4 ,可以结合流域生态补偿相关机制 5 - 6 ,开展河流型饮 用

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