明胶固定化果胶酶的制备及酶学性质研究.pdf

315工艺技术食品科学2006, Vol. 27, No. 12 明胶固定化果胶酶的制备及酶学性质研究 林建城，朱丽华，王志鹏，黄志明，陈国强 ( 莆田学院环境与生命科学系， 福建 莆田 3 5 1 1 0 0 ) 摘 要：以明胶为载体、戊二醛作为交联剂制备固定化果胶酶，对其固定化条件和酶学性质进行了研究。结果 表明：以 1 5 %明胶为载体、5 %戊二醛为交联剂、1 g明胶固定果胶酶4 m g制备的固定化酶，其酶活力回收率达 4 5 . 8 5 % ；固定化酶的最适温度 5 5 ，最适 p H 3 . 4 ，Km a p p值 3 . 4 8 m g / m l ；固定化酶的酸碱稳定性与温度稳定性均得 到提高，连续使用 7 次后固定化酶相对活力还剩下 4 7 . 0 6 % 。 关键词：明胶；果胶酶；固定化酶 S t u d y o n P r e p a r a t i o n a n d P r o p e r t i e s o f P e c t i n a s e f r o m A s p e r g i l l u s n i g e r I m m o b i l i z e d t o G e l a t i n L I N J i a n - c h e n g ，Z H U L i - h u a ，W A N Z h i - p e n g ，H U A N G Z h i - m i n g ，C H E N G u o - q i a n g ( D e p a r t m e n t o f E n v i r o n m e n t a n d L i f e S c i e n c e s , P u t i a n U n i v e r s i t y , P u t i a n 3 5 1 1 0 0 , C h i n a ) A b s t r a c t ： P e c t i n a s e f r o m A s p e r g i l l u s n i g e r w a s i m m o b i l i z e d w i t h g e l a t i n a n d c r o s s l i n k e d w i t h g l u t a r a l d e h y d e . T h e i m m o b i l i z a t i o n c o n d i t i o n s a n d p a r t i a l p r o p e r t i e s o f i m m o b i l i z e d e n z y m e w e r e i n v e s t i g a t e d . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p e c t i n a s e a c t i v i t y c o u l d r e t a i n u p t o 4 5 . 8 5 % w h e n p r e p a r e d w i t h 1 5 % g e l a t i n , 5 % g l u t a r a l d e h y d e a n d f o u r m i l l i g r a m m e p e c t i n a s e f o r o n e g r a m m e g e l a t i n . T h e o p t i m u m p H a n d o p t i m u m t e m p e r a t u r e o f i m m o b i l i z e d p e c t i n a s e f o r t h e h y d r o l y s i s o f p e c t i n w e r e d e t e r m i n e d t o b e p H 3 . 4 a n d 5 5 , r e s p e c t i v e l y . A n d t h e a p p a r e n t M i c h a e l i s c o n s t a n t o f i m m o b i l i z e d p e c t i n a s e Km a p p e q u a l e d t o 3 . 4 8 m g / m l . T h e s t a b i l i t y o f i m m o b i l i z e d e n z y m e t o p H a n d t e m p e r a t u r e w a s m u c h g r e a t e r t h a n o f t h e n a t u r a l e n z y m e . T h e r e c o v e r y a c t i v i t y o f t h e i m m o b i l i z e d p e c t i n a s e w a s m o r e t h a n 4 7 . 0 6 % a f t e r r e p e a t e d 7 t i m e s . K e y w o r d s： g e l a t i n； p e c t i n a s e ； i m m o b i l i z a t i o n e n z y m e 中图分类号 ： Q 8 1 4 文献标识码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 2 - 6 6 3 0 ( 2 0 0 6 ) 1 2 - 0 3 1 5 - 0 4 收稿日期： 2 0 0 6 - 0 8 - 0 1 基金项目：莆田市科技计划项目( 2 0 0 5 N 1 2 ) 作者简介：林建城( 1 9 6 6 - ) ，男，副教授，主要从事生物化学与酶工程的教学与科研。 与游离酶相比，固定化酶不仅具有重复利用其催化 活性，实现连续化生产，降低生产成本等优点，也可 避免使用游离酶给产品带来异物，进而提高产品质量， 固定化酶已成为当前酶工程领域的研究热点。果胶酶在 食品工业已有广泛运用，适用于葡萄、苹果和枇杷等 多种水果的加工，是饮料工业中有效的澄清剂，已广 泛将其运用于果汁、果酒的工业化生产 1 , 2 。此外，在 天然产物的提取、纺织麻类脱胶、造纸业中的生物制 浆等方面也多有应用。已有将果胶酶固定于载体制成固 定化酶的报道 3 6 ，但是，由于固定化载体强度等各方 面原因，限制了其在生产上的实际运用，所以探讨果 胶酶固定化的有效方法具有重要意义。本文报道的是以 明胶为载体，戊二醛为交联剂制备固定化果胶酶，并 对其固定化条件及其酶学性质进行研究。 1材料与方法 1 . 1仪器设备 磁力搅拌器 上海大普仪器有限公司( J B Z - 1 4 H ) ； 数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司( H H - 4 ) ； 精密 数显酸度计 上海伟业仪器厂( P H S - 2 5 ) ；电子天平， 德 国产( T E 2 1 2 ) ；冰箱等。 1 . 2试剂 果胶酶、果胶和明胶 S i g m a 公司；果胶酶来自 黑曲霉( A s p e r g i l l u s n i g e r ) 瑞士 ； 其它化学试剂均为国 产分析纯( A . R ) 。 1 . 3方法 1 . 3 . 1固定化酶的制作方法 7 1 5 % 的明胶溶液1 0 0 m l 加入1 m l 6 0 m g / m l 的果胶酶 液，搅拌均匀后，加入5 %浓度的戊二醛1 0 m l ，充分 搅拌，凝固后置 4 冰箱保存4 h ，取出切成约3 m m 见 方的小方块，用0 . 5 %浓度的戊二醛溶液浸泡1 6 h ，取 2006, Vol. 27, No. 12食品科学工艺技术316 出用蒸馏水洗涤数次，干后保存备用( 明胶、酶液、戊 二醛均用p H 3 . 4 的N a A c - H A c 缓冲液缓冲液配制或稀释) 。 1 . 3 . 2果胶酶活力的测定 采用次碘酸钠滴定法 8 。 1 . 3 . 3固定化酶活力的测定 2 0 m l 反应体系包括：1 % 果胶溶液( p H 3 . 4 ) 1 0 m l ，蒸 馏水 1 0 m l ；5 5 水浴预热1 5 m i n 后，加入1 g 固定化酶， 5 5 水浴保温反应 l h ，隔2 0 m i n 摇动一次，回收固定化 酶；反应液置沸水中灭活 1 0 m i n ，冷却后滴定，采用 次碘酸钠滴定法测定酶活力 8 。1 个酶活力单位( U ) 定义 为：在上述条件下，每分钟酶促反应生成 1微克当量半 乳糖醛酸的酶量。 2结果与分析 2 . 1固定化体系的确定 2 . 1 . 1明胶浓度的确定 用1 0 % 2 0 %的明胶浓度分别制备固定化果胶酶， 结果表明( 表1 ) ，随着明胶浓度的增加, 所制备的固定化 酶的凝胶状态变化很大。1 0 % 浓度的凝胶机械强度明显 不足，操作时易破碎；1 5 %和 2 0 %的凝胶机械强度较 大、弹性较好，成型也较佳，然而，20%的明胶浓 度配置条件难以控制，搅拌不彻底或不及时易发生焦糊 现象，不利于与酶液和戊二醛充分混合。综合考虑应 该选择1 5 %明胶浓度较为适宜。 明胶浓度( % )酶活力单位( U )回收率( % ) 1 01 . 5 54 3 . 4 1 1 51 . 6 44 5 . 8 5 2 01 . 7 94 9 . 9 3 表1 明胶浓度对固定化酶的酶活力与回收率的影响 Table 1 Effect of concentration of gelatin on the activity and activity recovery rate of immobilized pectinase 戊二醛浓度( % )酶活力单位( U )回收率( % ) 11 . 2 83 8 . 8 7 21 . 4 83 6 . 1 3 51 . 7 04 4 . 9 0 71 . 5 03 9 . 9 2 表2 戊二醛浓度对固定化酶的酶活力与回收率的影响 Table 2 Effect of concentration of glutaraldehyde on the activity and activity recovery rate of immobilized pectinase 2 . 1 . 2戊二醛浓度的确定 以 1 5 %明胶为载体，分别用 1 % 、2 % 、5 %和 7 % 等四种戊二醛浓度为交联剂制备固定化酶。结果表明 ( 表 2 ) ，放置 4 h 后，随交联剂浓度的增大，凝胶机械 强度、弹性与成形逐渐增强；戊二醛浓度为 1 %和 2 % 的凝胶经戊二醛浸泡1 6 h 后稍有粘连现象，浓度为5 % 的成胶状态最好；同时，5 %戊二醛固定化酶的酶活力 与回收率均较高，是固定化果胶酶的最佳交联剂浓度。 2 . 1 . 3酶浓度的确定 以1 5 % 明胶为载体和 5 %戊二醛为交联剂分别按每 克明胶固定2 . 6 7 、4 . 0 0 、5 . 3 3 、6 . 6 7 和8 . 0 0 m g 的酶量制 备固定化酶，结果表明( 表3 ) ：1 g 明胶固定大于 4 m g 以 上酶量的固定化酶其酶活力随着酶量增加固定化酶活力 略有升高，但回收率呈下降趋势，因此选择1 g明胶固 定4 m g的酶量较为适宜。 固定m g 酶量/ g 明胶酶活力单位( U )回收率( % ) 2 . 6 71 . 3 73 2 . 4 1 4 . 0 02 . 0 24 1 . 8 7 5 . 3 32 . 0 73 8 . 9 9 6 . 6 72 . 1 33 7 . 1 0 8 . 0 02 . 2 33 5 . 0 8 1 0 . 6 72 . 2 53 2 . 6 9 表3 固定不同酶量对固定化酶的酶活力与回收率的影响 Table 3 Effect of concentration of enzyme on the activity and activity recovery rate of immobilized pectinase 2 . 2固定化果胶酶与溶液酶的酶学性质比较 2 . 2 . 1最适 p H 分别测定了不同p H值下固定化酶与溶液酶催化果 胶的水解能力，结果表明( 图1 ) ：固定化果胶酶最适 p H 为3 . 4 ，比游离酶的偏低( 最适p H 3 . 8 ) ，这与“使用带 正电的载体固定化的酶其最适p H 向酸性偏移” 9 理论相 符 合 。 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 23456 a 相对活力( % ) p H值 b 图1 固定化酶和溶液酶的最适pH值 Fig.1 Optimum pH of immobilized pectinase and free pectinase a : 固定化酶 ； b : 溶液酶 2 . 2 . 2酸碱稳定性 检测了固定化酶与溶液酶在4 下经不同p H 值缓冲 液处理2 h后的剩余酶活力，以各处理组的相对酶活力 对p H作图，分析酶的酸碱稳定性范围。结果( 图 2 ) 表 明：游离酶在p H 3 . 4 4 . 8 区域相对比较稳定，而固定 化酶在p H 2 . 8 5 . 6 区域内是稳定的，比游离酶范围宽。 317工艺技术食品科学2006, Vol. 27, No. 12 2 . 2 . 3最适温度 在2 0 8 0 范围内，测定固定化酶与溶液酶催化果 胶水解的酶促反应速度。结果( 图3 ) 表明：溶液酶的最 适温度为 5 0 ，而固定化酶为5 5 ，比游离酶高。这 是由于大多数固定化酶的热稳定性提高了，最适温度也 随之提高。 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 2345678 a 相对活力( % ) p H值 b 图2 固定化酶和溶液酶的酸碱稳定性 Fig.2 pH stability of immobilized pectinase and free pectinase a : 固定化酶 ； b : 溶液酶 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 09 0 a 相对活力( % ) 温度( ) b 图3 固定化酶和溶液酶的最适温度 Fig.3 Optimum temperature immobilized pectinase and free pectinase a : 固定化酶 ； b : 溶液酶 2 . 2 . 4温度稳定性 分别检测了固定化酶与溶液酶在不同温度下处理 2 h 后的剩余酶活力。结果见图4 ，在5 0 以下热处理 2 h 后，与未经处理的酶活力比较都有所下降，但变化幅 度不大。当在 6 0 下热变性2 h后，游离酶活力损失了 8 0 . 5 % ，而固定化酶活力只损失3 7 . 5 % ；在8 0 下热变 性 2 h后，游离酶接近丧失活力，而固定化酶还保留有 3 5 . 0 %的活力，固定化酶的热稳定性提高了。 2 . 2 . 5酶的动力学参数 以 2 1 0 m g / m l果胶为底物，分别测定固定化酶与 溶液酶的酶活力，用L i n e w e a v e r - B u r k 双倒数作图法( 图 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 a 相对活力( % ) 温度( ) b 图4 固定化酶和溶液酶的温度稳定性 Fig.4 Temperature stability of immobilized pectinase and free pectinase a : 固定化酶 ； b : 溶液酶 5 、6 ) ，求得固定化酶表观米氏常数 Km a p p= 3 . 4 8 m g / m l 小 于溶液酶的Km= 5 . 1 6 m g / m l ，说明了固定化酶对底物的亲 和力大，有利于果胶酶催化果胶的水解。 2 . 2 . 6固定化酶的操作稳定性 对固定化酶连续进行十批次的操作，计算每次使用 后的相对酶活力，结果如图 7所示，连续使用 3次酶 活力保持较高水平，连续使用 7次后酶相对活力还剩 2 5 2 0 1 5 1 0 5 l / v ( 1 / U ) - 0 . 3- 0 . 2- 0 . 1 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 1 / S ( m g / m l ) 图5 固定化酶的米氏常数 Fig.5 Michaelis consants of immobilized pectinase 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 0 l / v ( 1 / U ) - 0 . 3- 0 . 2- 0 . 1 0 0 . 1 0 . 2 0 . 3 0 . 4 0 . 5 1 / S ( m g / m l ) 图6 溶液酶的米氏常数 Fig.6 Michaelis consants of free pectinase 2006, Vol. 27, No. 12食品科学工艺技术318 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 相对活力( % ) 次数( 次) 图7 固定化果胶酶的操作稳定性 Fig.7 Operational stability of immobilized pectinase 4 7 . 0 6 % ，而后酶活力下降速度加快，因此在提高操作 稳定性上还有待进一步的研究，以便更好地在生产实践 中加以运用。 3结 论 以明胶为载体固定化果胶酶的最佳条件是：1 5 %明 胶溶液 1 0 0 m l 固定 6 0 m g 的果胶酶( 相当1 g 明胶固定4 m g 酶) ，5 %戊二醛为交联剂，该条件下制得固定化酶凝胶 强度大，酶活力回收率高。 明胶固定化果胶酶最适p H 为3 . 4 ，最适温度为5 5 ， Km a p p是3 . 4 8 m g / m l 。固定化酶的酸碱稳定性范围与热稳 定性均高于游离酶。 参考文献： 1 O r t e g a N , D i e g o S , P e r e z - M a t e o s M , e t a l . K i n e t i c p r o p e r t i e s a n d t h e r - m a l b e h a v i o u r o f p o l y g a l a c t u r o n a s e u s e d i n f r u i t j u i c e c l a r i f i c a t i o n J . F o o d C h e m i s t r y , 2 0 0 4 , 8 8 : 2 0 9 - 2 1 7 . 2 何志刚, 李维新, 林晓姿. 枇杷果汁加工的酶处理技术研究 J . 食品 科学, 2 0 0 4 , 2 5 ( 1 ) : 7 2 - 7 5 . 3 S a r t o g l u K , D e m i r N , A c a r J , e t a l . T h e u s e o f c o m m e r c i a l p e c t i n a s e i n f r u i t j u i c e i n d u s t r y , P a r t 2 : d e t e r m i n a t i o n o f t h e k i n e t i c b e h a v i o r o f i m m o b i l i z e d c o m m e r c i a l p e c t i n a s e J . J o u r n a l o f F o o d E n g i n e e r i n g , 2 0 0 1 , 4 7 : 2 7 1 - 2 7 4 . 4 A l k o r t a I , G a r b i s u C , L l a m a M J , e t a l . I m m o b i l i z a t i o n o f p e c t i n l y a s e f r o m p e n i c i l l u m i t a l i c u m b y c o v a l e n t b i n d i n g t o n y l o n J . E n z y m e a n d M i c r o b i a l T e c h n o l o g y , 1 9 9 6 , 1 8 : 1 4 1 - 1 4 6 . 5 王宏, 仇农学. 果胶酶的固定化 J . 食品与发酵工业, 2 0 0 5 , 3 1 ( 2 ) : 7 0 - 7 2 . 6 张应玖, 金成日, 王红梅, 等. 果胶酶的固定化研究 J . 生物技术, 1 9 9 6 , 6 ( 2 ) : 2 6 - 2 9 . 7 焦云鹏, 王志民,