栖热菌4-α-糖基转移酶对马铃薯淀粉的改性作用.pdf

第 28 卷增刊 1农 业 工 程 学 报Vol.28Supp.1 2012 年5 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringMay 2012363 栖热菌 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉的改性作用 李学红 1，陆 勇1，王 冰1，金征宇2，徐学明2 （1. 郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州 450002；2. 江南大学食品学院，江苏无锡 214122） 摘要：该文将栖热菌 4- - 糖基转移酶（TS GT）作用于马铃薯淀粉，分别利用理化分析、质构 TPA 分析及酶解分析等 方法研究该酶对淀粉糊化、凝胶特性和消化性的影响。结果表明，TS GT 可以显著降低马铃薯淀粉中直链淀粉质量分数， 使从初始的 21%降低至 15%，从而使淀粉糊冻融稳定性得以提高、糊透明度得到改善；对酶处理马铃薯淀粉凝胶的研究 结果显示，TS GT 对淀粉的改性存在最适作用条件，控制 0.0240.06 U/g 的酶用量作用 30 min 可以明显改善淀粉凝胶 质构特性，使凝胶硬度降低，而弹性、咀嚼性、黏结性和胶着性得到不同程度的提高；进一步的消化试验结果表明，使 用 0.024 U/g 以下的酶用量作用 30 min，马铃薯淀粉的抗消化性得到提高，继续加大酶量则使抗消化性下降。因此，应用 TS GT 对马铃薯淀粉改性处理，控制合适的酶作用程度可以显著提高马铃薯淀粉糊及凝胶的应用特性，同时增加其抗消 化性。 关键词：淀粉，酶，凝胶，淀粉糊，质构特性，消化性 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2012.z1.061 中图分类号：TS231文献标志码：A文章编号：1002-6819(2012)-Supp.1-0363-06 李学红，陆勇，王冰，等. 栖热菌 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉的改性作用J. 农业工程学报，2012，28(增刊 1)： 363368. Li Xuehong, Lu Yong, Wang Bing, et al. Effects of thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on modified property of potato starchJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2012, 28(Supp.1): 363 368. (in Chinese with English abstract) 0引言 4- - 糖基转移酶（4- - GTase，EC 2.4.1.25）属于 - 淀粉酶家族，是一个多功能性酶。此酶既可催化淀粉 - 葡聚糖链分子间的转移即发生歧化反应，也可以催化淀 粉分子内葡聚糖转移发生环化反应。前者能够改变淀粉 分子链的长度分布，后者则可以导致高水溶解性及具有 乳化特性的环状糊精的生成1。研究表明，当底物为直链 淀粉时 4- - 糖基转移酶多发生环化反应， 而有支链淀粉存 在时倾向于发生歧化反应，而且这种歧化反应程度依赖 于底物淀粉的分子结构，使用不同种类的底物淀粉，其 歧化作用功能表现不一2。因此，4- - 糖基转移酶作用于 淀粉应该可以较大程度地改变淀粉的凝胶特性及糊特 性，且这种改变与原料淀粉种类有很大关系3。近年来， 国外已陆续发表了一些将 4- - 糖基转移酶用于淀粉改性 的报道，其中应用较多的是改性大米淀粉，该酶可以使 大米淀粉分子结构发生改变从而有效改善了大米淀粉凝 胶的性质4- 6；将该酶应用于马铃薯淀粉改性的研究还很 少， 目前只有一篇文献报道了 4- - 糖基转移酶可以降低马 铃薯淀粉的熔点和凝胶热焓、并赋予马铃薯淀粉凝胶热 可逆的性质7， 而该酶对马铃薯淀粉凝胶质构特性及糊特 收稿日期：2011- 12- 21修订日期：2012- 04- 20 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31171757） ；郑州轻工业学院博士 启动基金项目（2007BSJJ004） ；2011 年郑州市科技创新团队支持项目。 作者简介：李学红（1969），女，河南郑州人，副教授，博士，硕士生导 师， 主要从事淀粉深加工方向研究。 郑州郑州轻工业学院食品与生物工程 学院，450002。Email：em19li 性的影响的研究报道还未见到。 本文使用实验室自制的栖热菌高转移活性 4- - 糖基 转移酶（TS GT），以马铃薯淀粉为原料，通过酶改性 试验，研究马铃薯淀粉糊特性及凝胶特性的变化。马铃 薯淀粉是一种广泛使用的商业化淀粉， 通过 4- - 糖基转移 酶改性马铃薯淀粉的研究，对以后开发高品质马铃薯淀 粉产品具有积极的意义。 1材料与方法 1.1原料与试剂 4- - 糖基转移酶（TS GT，实验室自制：以栖热菌 4- - 糖基转移酶质粒转化大肠杆菌得到重组菌株， 液体培 养后经超声波破碎菌体获得 4- - 糖基转移酶的粗酶液， 再 经加热及亲和层析纯化、浓缩得到试验用酶制品。该酶 最适 pH 值 7.5， 最适温度 75， 转移酶活力 38.35 U/mL） ； 直链淀粉（Sigma, From potato）；马铃薯淀粉，购于超 市；其他化学试剂均为分析纯。 1.2仪器与设备 DZKW- 4 电热恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限 公司）；LG10- 2.4A 离心机（北京医用离心机厂）；分析 天平（上海光正医疗仪器有限公司）；TA.XT plus 物性 测试仪（英国 Stable micro systems 公司）；NDJ- 79 旋转 粘度计（上海安德仪器设备有限公司）；UV- 2100PC 型 紫外可见光分光光度计（UNICO 公司）；PHS- 3C 型 pH 计（上海精密科学仪器有限公司）；Genex 移液枪，微量 进样器等。 农业工程学报2012 年 364 1.3试验方法 1.3.1酶处理马铃薯淀粉中直链淀粉含量的测定 8 直链淀粉标准曲线的绘制：准确称取 40.00 mg 直链 淀粉，用 1 mL95乙醇润湿，再加入 l mol/L NaOH 溶液 9 mL，在沸水浴上加热 10 min，冷却，用蒸馏水配制成 100 mL 标准液。分别吸取 0、1、2、3、4 和 5 mL 上述 标准溶液于 5 个 100 mI 容量瓶， 再分别加入 1 mL/L HAC 溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mL，之后加入 2 mL 的 碘液，用蒸馏水定容至刻度。静置 20 min 后，在波长 620 nm 下测定其吸光值。以吸光值为纵坐标，直链淀粉 的含量为横坐标，绘出标准曲线。标准曲线方程为： y=0.2481x，R2=0.9987。 直链淀粉含量的测定：准确称取样品 100 mg（原淀 粉或酶处理淀粉的冻干粉），加入浓度为 95乙醇 1 mL 和 1 mol/L NaOH 9 mL，在沸水浴中加热 10 min，使淀粉 糊化，冷却后用蒸馏水转移到 100 mL 容量瓶中稀释至刻 度。再准确吸取 5 mL 上述糊化液于 100 mL 容量瓶中， 加入 1 mol/L 醋酸 1 mL 和碘液 2 ml， 定容后静置、 比色， 由标准曲线计算出试样中的直链淀粉质量分数。试验重 复 3 次，取平均值。 1.3.2酶处理马铃薯淀粉凝胶的制备及质构特性的测 定 1）酶处理马铃薯淀粉凝胶的制备 准确称取一定量的马铃薯淀粉， 加入 Tris- HCL 缓冲 液（pH 值 7.5）配成 8.0% （质量体积比）的淀粉悬浮液， 置于 95水浴中振荡保温 30 min 使充分糊化，取出稍 冷，放入 75水浴中恒温。搅拌下加入一定量酶溶液， 75反应 30 min，取出立即放入 100的沸水中灭酶 30 min。 趁热将处理后淀粉糊倒入直径为 2 cm 的一次性 无菌注射器中，冷却至室温，封口放入 4的冰箱放置 24 h 成胶。 以pH值7.5的Tris- HCL缓冲液代替酶液制得的淀粉 凝胶样品作为对照。 2）酶处理马铃薯淀粉凝胶质构特性的测定（TPA 分析） 将凝固的淀粉凝胶从注射器中倒出，准确切成高度 为 1.5 cm 的柱状体，室温下利用质构仪 TPA 程序测定淀 粉凝胶的硬度、回复性、弹性、黏结性、胶着性和咀嚼 性9- 10（每种取样 3 次，3 次测定结果取平均值）。具体 测定条件如下 循环计算模式；探头：圆柱形探头 P50；测试模式： 压缩；测试前速度：2.00 mm/s；测试速度：1.00 mm/s； 测试后速度：1.00 mm/s；次数：2；目标模式：压力；压 缩率：40%；触发类型：自动；触发力：5.0 g。 1.3.3酶处理马铃薯淀粉糊冻融稳定性的测定 1111 准确称取马铃薯淀粉样品，加入 Tris- HCL 缓冲液 （pH7.5）配成 3.0%（质量体积分数）的淀粉悬浮液，先 于 95保温糊化、75酶处理 30 min，之后用 100沸 水灭酶活并冷却至室温。将酶处理淀粉糊置于- 20的冰 箱中冻藏 24 h，然后自然解冻，在 5 000 r/min 的离心机 中离心 20 min，弃去上清液，准确称取沉淀物的质量， 按下式计算析水率（%） 析水率=(糊质量沉淀物质量)/糊质量 100%。 以pH值7.5的Tris- HCL缓冲液代替酶液制得的淀粉 糊样品作为对照。试验重复 3 次，取平均值。 1.3.4酶处理马铃薯淀粉糊透明度的测定 12 准确称取马铃薯淀粉样品 0.8 g， 加入 Tris- HCL 缓冲 液（pH 值 7.5）配成 1.0%（质量体积比）的淀粉悬浮液， 95水浴中保温 30 min 使充分糊化， 取出稍冷， 放入 75 水浴保温。加入适量的酶液，搅拌下 75恒温反应 30 min，立即放入 100沸水灭酶活 30 min。之后冷却至 室温，在 650 nm 波长下测定淀粉糊的透光率。 以pH值7.5的Tris- HCL缓冲液代替酶液制得的淀粉 糊样品作为对照。试验重复 3 次，取平均值。 1.3.5酶处理马铃薯淀粉消化性的测定 13 采用 Englyst 方法进行。准确称取 200 mg 淀粉样品， 加入 0.2 mol/L pH 值 5.2 的醋酸钠缓冲液 15 mL，37预 热后，加入含有猪胰 - 淀粉酶（290 U/mL）和淀粉葡萄 糖苷酶（15 U/mL）的酶液 5 mL，立即置于 37水浴中 保温消化，分别在 20 和 120 min 时取样 0.5 mL，迅速加 入 4.5 mL 的无水乙醇， 吸取上层溶液， 采用 DNS 法测定 样品中葡萄糖的含量， 并计算样品中快消化淀粉 （RDS） 、 慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的质量分数（%）。 RDS=(G1-G0)0.9 SDS=(G2-G1)0.9 RS=100-(RDS+SDS) 式中，G0为未被酶作用的淀粉样品中葡萄糖的量，mg/g； G1为酶作用于淀粉样品20 min后产生的葡萄糖量， mg/g； G2为酶作用于淀粉样品 120 min 后产生的葡萄糖质量分 数，mg/g。 2结果与分析 2.1TS GT 对马铃薯淀粉中直链淀粉含量的影响 马铃薯淀粉经 TS GT 处理，其直链淀粉含量明显减 少。如图 1 所示。 图 1嗜热 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉中直链淀粉质量分数 的影响 Fig.1Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on amylose content of potato starch. 增刊 1李学红等：栖热菌 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉的改性作用 365 马铃薯原淀粉直链淀粉质量分数为 20.47%，经 TS GT 保温处理 30 min 后其直链淀粉含量显著下降， 0.06 U/g 的加酶量可使直链淀粉含量降至 14.75%，但再 增加酶量则直链淀粉含量下降趋缓，说明此时酶对淀粉 的转化反应已基本达到平衡。 Park 等曾利用 4- - 糖基转移酶对大米淀粉进行改 性研究， 通过对改性后淀粉结构的分析， 发现直链淀粉 质量分数减少而支链淀粉侧链长度增加， 说明 4- - 糖基 转移酶能够将直链淀粉片段转移至支链侧链上14。本 试验测定的直链淀粉质量分数减少的结果， 也提示以马 铃薯淀粉为底物可能同样发生了类似的转移反应， 这种 转移反应导致淀粉结构的改变， 相应也会导致淀粉理化 性质发生变化。 2.2TSGT 对马铃薯淀粉凝胶特性的影响 利过质构仪 TPA 程序对酶处理淀粉凝胶进行测定， 发现 TS GT 对马铃薯淀粉凝胶特性产生显著影响。该酶 可以使马铃薯淀粉凝胶硬度下降，而胶着性、咀嚼性、 凝胶弹性、黏结性和回复性得到不同程度的提高，从而 具有显著改善马铃薯淀粉凝胶品质的作用。 2.2.1硬度、咀嚼性和胶着性 由图 2 可以看出，随着酶的加入处理，马铃薯淀粉 凝胶的硬度显著下降， 0.06 U/g 的加酶量可使凝胶硬度由 107.5 降低到 81.7，以后再增加酶的加量，凝胶硬度降低 的变化趋缓。而对于马铃薯淀粉凝胶的咀嚼性和胶着性 而言，少量的加酶量会使两者显著提高，当加酶量超过 0.024 U/g 时咀嚼性和胶着性又转而降低，加酶量超过 0.06 U/g 时两者降低的变化趋缓。因此从总体上来看，控 制 0.0240.06 U/g 的加酶量，可以起到降低马铃薯淀粉 凝胶的硬度、提高凝胶咀嚼性和胶着性的作用。如果进 一步加大酶使用量，则主要达到降低凝胶硬度的效果， 而对咀嚼性和胶着性影响相对有限。 图 2嗜热菌 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉凝胶硬度、咀嚼性 和胶着性的影响 Fig.2Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on hardness, chewiness and gumminess of potato starch gels. 凝胶硬度跟凝胶中结晶的密度有关，结晶密度降低， 则凝胶硬度也降低。而凝胶的咀嚼性和胶着性则主要跟 凝胶网络的形成及结构强度有关15。当 TS GT 使用量较 少时，淀粉中直链淀粉质量分数随酶量的增加而线性降 低，相应由直链淀粉分子间形成的结晶度也随之降低， 而此时转移到支链淀粉侧链上的葡萄糖片段不足以推动 侧链间结晶的形成，却有助于链间的交联，在一定程度 上促进了淀粉网络结构的形成。因此淀粉凝胶的低酶量 处理表现为凝胶硬度的下降、以及咀嚼性和胶着性的提 高。当增大酶使用量时，酶的作用主要表现在支链淀粉 侧链长度的调整以及对淀粉分子的轻微降解。有研究表 明，4- - 糖基转移酶最终可使侧链长度分布范围扩大，出 现一些新的短侧链和长侧链，同时使淀粉支链丛部分脱 离主链。这种支链淀粉侧链的分布以及分子规模降低的 淀粉结构无疑对凝胶网络形成产生不利影响，因此使凝 胶咀嚼性和胶着性又表现为降低趋势。 2.2.2凝胶弹性、黏结性和回复性 弹性反映的是淀粉凝胶受到彻底挤压后，在一段时 间内恢复变形的能力。淀粉凝胶的弹性受淀粉分子所形 成网状结构的交联点数量和交联点密度的影响，有效交 联点数目越多，凝胶弹性越大；淀粉凝胶的黏结性表示 分子间的内聚力，受淀粉分子链长的影响。长链淀粉分 子含量越大，凝胶中的分子之间相互作用力也越大16。 凝胶弹性、黏结性和回复性与凝胶的咀嚼性和胶着性有 很高的相关性。由图 3 也可看出，酶添加量对凝胶弹性、 黏结性和回复性的影响曲线与凝胶咀嚼性和胶着性的影 响曲线有相似的规律。 图 3嗜热 4- - 糖基转移酶对凝胶弹性、黏结性和回复性 的影响 Fig.3 Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on springiness, cohesiveness and resilience of potato starch gels. 控制 0.024 U/g 左右的加酶量，可使直链淀粉分子含 量减少，但葡萄糖链的酶催化转移导致支链淀粉侧链长 度的重新分布，使凝胶网络交联点大幅增加而结晶体密 度下降，从而体现为弹性、黏结性和回复性的增加并达 到最高值17。酶后续作用于支链淀粉侧链间的糖基转移 以及部分支链丛的解离，虽然该作用对凝胶弹性、黏结 性和回复性的影响有限，但由于呈现不利的趋势，因此 控制酶添加量十分重要。 2.3TSGT 对马铃薯凝胶冻融稳定性的影响 4- - 糖基转移酶的作用可以显著降低淀粉中直链淀 粉质量分数，增加支链淀粉分子量，从而对淀粉糊冻融 性产生影响。从图 4 中可以看出，酶添加处理可有效降 低淀粉凝胶经冻融后的析水率。0.04、0.06 和 0.15 U/g 加 农业工程学报2012 年 366 酶量可使凝胶析水率由 33%分别下降到 28%、27.5%和 24%，再加大酶量则析水率变化不大，这也说明 4- - 糖基 转移酶可以显著提高马铃薯淀粉凝胶的抗冷冻能力。 图 4嗜热 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉糊冻融稳定性的影响 Fig.4Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on freeze- thaw stability of potato starch paste 淀粉的老化或持水力跟直链淀粉质量分数直接相 关，由于直链淀粉分子平行排列、彼此羟基之间形成氢 键导致淀粉聚集体水合能力降低，溶解度降低11。正如 本文 2.2 中所讲，TS GT 作用于淀粉使直链淀粉质量分 数减少，而新形成的支链淀粉分支结构也不易平行排列 发生氢键缔合，从而使酶处理后的淀粉凝胶持水能力增 强，冻融稳定性提高。 2.44-糖基转移酶对马铃薯淀粉糊透明度的影响 将马铃薯淀粉配成 1%的溶液，经糊化和酶处理后在 分光光度下检测，发现淀粉糊透明度也发生了变化。如 图 5 所示，控制 0.2 U/g 以下的酶使用量，随酶量的增多 淀粉糊透明度逐渐提高，透光率由 9.6%升高到 11.9%。 再加大酶量，糊透光率又呈下降趋势。 图 5嗜热 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉糊透明度的影响 Fig.5Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on clarity of potato starch paste 淀粉糊透明度跟淀粉糊化后分子重新排列并相互缔 合的程度有关。如果淀粉糊中淀粉分子不发生相互缔合、 无残存的淀粉颗粒及老化后形成的凝胶束，则糊透明度 就较高18。TS GT 处理降低了直链淀粉质量分数从而减 少了直链淀粉间形成的氢键缔合，由于结构障碍支链淀 粉侧链氢键形成度又不高，这就有利于糊透明度的提高。 这种由于分子结构调整而导致的糊透明度改善，虽然试 验结果证明改善程度不够大，但对 TS GT 的实际应用仍 具有积极意义。 2.54- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉消化性的影响 依据体外模拟淀粉的消化速率，淀粉可分为快速消 化淀粉（RDS）速消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）。 RDS 能被快速消化并在十二指肠区域被机体吸收，与生 糖指数值密切相关；SDS 在体内持续缓慢释放葡萄糖， 具有低血糖食品的特性；而 RS 不能被消化，有利于肠道 健康20。 从图 6 结果可以看出，TS GT 处理可以显著影响马 铃薯淀粉的消化特性，改变上述 3 种淀粉的含量。当使 用的酶量由少逐渐增多时，马铃薯淀粉中慢消化淀粉和 抗性淀粉含量呈现先增加后减少的趋势，当酶用量达到 0.025 U/g 时淀粉抗消化性达到最高。 有文献报道，淀粉的消化性与支链淀粉的分支侧链 链长分布密切相关，支链淀粉短链与长链质量比与 SDS 含量之间存在抛物线关系19，含有较多短链侧链或者含 有较多长链侧链淀粉，都容易使淀粉在老化时形成不完 全晶体，致使其慢消化性提高20- 21。而如前所述，4- - 糖基转移酶作用于马铃薯淀粉，将直链淀粉部分链段转 移至支链淀粉上，同时调整支链淀粉侧链长度，使之分 布范围变宽，即短侧链和长侧链数量均有增加；酶处理 也使直链淀粉质量分数减少，但相比支链结构的变化， 可能其影响相对较小。因此，酶的这种作用方式导致马 铃薯淀粉抗消化性提高。但随着酶用量的提高，部分支 链丛从主链上的解离，淀粉的分子量下降，空间阻碍减 少，有利于淀粉酶的水解作用，因此酶处理样品又呈现 消化性能提高的趋势。 注：RDS，快速消化淀粉；SDS，速消化淀粉；RS，抗性淀粉 图 6嗜热 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉消化性的影响 Fig.6Effects of Thermus scotoductus 4- - glucanotransferase on digestion of potato starch paste 3结论 1）马铃薯淀粉经 TS GT 处理后，其直链淀粉质量 分数显著下降。0.06 U/g 的酶量处理 30 min 可基本达到 最大降幅， 使直链淀粉质量分数从初始的 21%降至 15%。 增刊 1李学红等：栖热菌 4- - 糖基转移酶对马铃薯淀粉的改性作用 367 2）马铃薯淀粉经 TS GT 处理后，其凝胶质构特性 发生明显变化，具体表现为凝胶硬度下降，而弹性、咀 嚼性、黏结性、胶着性和回复性都有不同程度提高。凝 胶质构特性的变化与酶的使用量密切相关， 0.06 U/g 的酶 量处理 30 min 后即可使凝胶硬度基本降到最低，再增大 酶量硬度变化不大；而控制 0.024 U/g 酶量基本可使凝胶 咀嚼性、胶着性、弹性、黏结性和回复性达到最高值， 再增大酶量反而使 5 种质构参数下降。 3）经 TS GT 处理的马铃薯淀粉，其糊冻融稳定性 和透明度也得到不同程度的提高。0.15 U/g 的酶量处理 30 min 可使淀粉糊冻融和析水率降到最低，而 0.2 U/g 的 酶量使糊透明度达到最高。 4）TS GT 处理可以显著影响马铃薯淀粉的消化性， 随着酶量的增加，其抗消化性呈现先提高后降低的趋势。 0.024 U/g 酶量处理 30 min 可最大程度增加其慢消化淀粉 和抗性淀粉含量。 5）应用 TS GT 对马铃薯淀粉进行改性处理，酶的 作用程度是重要的工艺条件之一，控制合适的酶作用条 件可以显著提高马铃薯淀粉糊及凝胶的应用特性，同时 增加其抗消化性。 参考文献 1Park J H, Kim H J, Kim Y H, et al. 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