一株产白藜芦醇真菌的培养及调控研究.pdf

生物工程 食 品 科 学 2 0 0 7 , V o 1 2 8 ， N o 0 5 2 4 5 一 株产 自藜芦醇真菌的培养及调控研究 曹 庸 1 , 2 ，唐永红 1 , 3 ，卢成英 2 ，黄早成 2 ( 1 华南农业大学食品学院，广东 广州 5 1 0 6 4 2 ：2 湖南省林产化工工程重点实验室，湖南 张家界 3 吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首4 1 6 0 0 0 ) 摘要：在虎杖组织培养过程中分离出 1 株真菌，对其发酵液提取物进行 T L C和HP L C分析证明能产生白藜芦醇， 并对其培养条件及 白藜芦醇积累特性进行了初步研究，通过正交优化试验得到最佳培养条件为：2 0 g L蔗糖、2 g L 硝酸铵、自然p H值( 6 8 47 0 ) 、温度为2 8 “C，转速 l O O ff mi n 。3 mmo l L苯丙氨酸前体物、Mg 2 + 、 Z n 能促进真 菌B 一 3 9的生长及白藜芦醇的积累，其白藜芦醇含量能达 8 6 6 1 7 g 1 0 0 ml 。 关键词 ：白藜芦醇 ；真菌；分离；培养条件 ；积累特征 S t u d y o n I s o l a t i o n o f Re s v e r a t r o l p r o d u c i n g F u n g u s a n d I t s Ac c u mu l a t i n g Ch a r a c t e r i s t i c s CAO Yo n g ， TANG Yo n g h o n g ， L U Ch e n g y i n g ， HUANG Za o c h e n g ( 1 Co U e g e o f F o o d S c i e n c e ， S o u t h Ch i n a Ag r i c u l t u r a l Un i v e r s i ty， Gu a n g z h o u 5 1 0 6 4 2 ， Ch i n a ： 2 K e y L a b o r a t o r y f o r F o r e s t P r o d u c t s a n d C h e mi c a l I n d u s t r y E n g i n e e ri n g o f H u n a n ， z h a I l 舀i a j i e 4 2 7 0 0 0 ， C hin a ： 3 C o l l e g e o f B i o l o gic al R e s o u r c e s a n d E n v i r o n me n t a l S c i e n c e s ， J i s h o u Univ e i ty， J i s h o u 4 1 6 0 0 0 ， C h i n a ) Ab s t r a c t ：A f u n g u s wa s s e p a r a t e df r o m theti s s u ec u l t u r al p r o c e s s e sof Po l y g o n u m Cu s pi d at u m an dthe z y m o t i c e x t r a c t swe l x an aly z e d b y T LC an d HP L C T h e f u n g u s o b t a i n e d i s B一 3 9 whic h c a n p r o d u ce r e s v e r a t r o 1 Th e o p t i mi z e d c u l t u r a l c o n d i ti o n s a r e ： s a c c h a r i n e2 0g L NH4 NO4 2g L， p H6 8 7 0and 1 0 0r rai nb yo r t h o g o n a l tes ts 3 mmo l LP h ewi th Mg 2 + and Zn 2 C an i n c r e a s e t h e g r o wt h o f t h e f u n g u s B一 3 9 and the c o n t e n t o f r e s v e r t r o 1 Th e a c t u al c o n t e n t r e s v e r a t r o l i n the fun g u s i s d e t e r mi n e d a s 8 6 6 1 7 1 a g 1 0 0 ml b y I -I P LC Ke y wo r d s ：r e s v e r a t r o l ；f u n g i ； i s o l a t i o n ；c u l t u r a l c o n d i t i o n s ； a c c u m u l a t i n g c h a r a c t e r i s t i c s 中图分类号：Q9 4 9 2 4 0 8 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 2 6 6 3 0 ( 2 0 0 7 ) 0 5 0 2 4 5 0 4 白藜芦醇( r e s v e r a t r o 1 ) 具有 防癌、抗高血压和导 致冠状动脉 血管扩展血 管等活性 ，具有 降低 大 鼠血清 中总胆固醇 以及降血脂等作用【 、可有效抑制血管细胞 中组织因子 T F和细胞质 的异常表达【 ， 】 防止心血管疾病 发生 ，还把 它作为健 康食 品添加 剂，具有广 阔 的科研 与 市 场 前 景 。 目前国内外学者主要从二个方面来生产和研究白藜 芦醇，即化学合成法【 】 、植物细胞及组织培养法【 们 。但 植物 生长缓慢 ，资源短缺 ，故限制 了该药的进一 步开 发利用。而微生物次生代谢产物或其衍生物( 如抗 生素) 对人类做 出了重要 的贡献，并且人们逐渐认识到微 生物 次级 代谢产物也 是新药发现 的重要源泉 。 因此 ，作者 瞄准微生物这一重要资源 ，在虎杖组织培养过程中分离 出一株能产 白藜芦醇的真菌 B 一 3 9 ，并对其培养条件进行 了初步研 究。本研究在 前期工作 的基础上 ，继续对真 菌 B一 3 9的培养条件优化及 白藜芦醇积累特性进行 了探 收稿日期：2 0 0 6 0 5 1 6 基金项目：湖南省科技厅资助项 目 ( 0 3 J Z Y 3 0 2 0 ) 作者简介：曹庸( 1 9 6 6 一 ) ，男，教授，研究方 向为资源化学 。 索 ，结果表 明，可 以通 过微 生物 发酵来大 量生产 白藜 芦醇 ，从而彻 底摆 脱依 赖栽培 ，破坏 资源 的困境 。 1 材料与方法 1 1 材料 、试剂 与仪 器 1 1 1 材料 新鲜虎杖采 自吉首大 学张家界校 区。 1 1 2 培养 基 P DA培 养基 。 1 1 _ 3 试剂 乙腈 、 甲醇 、乙酸 乙脂 、HC】 、甘氨酸 、Na OH 和 Na C 1 均为分析纯；硅胶 G 青岛海洋化工有限公司； 白藜芦醇标准对照品( 9 9 ) S i g ma公司。 1 1 4 仪器 高效液相色谱仪( L C 一 9 0 A ) 日本岛津公 司；紫外分 维普资讯 2 4 6 2 0 0 7 , V o L 2 8 , N o 0 5 目 晶 科 学 生物工程 光光度计( u v 1 6 0 A ) 日本岛津公司；万分之一分析天 平( k E G 2 2 0 ) ；人工气候箱( L R H - 2 5 0 G S ) 广东省医疗器 械 厂 。 1 2 产 白藜芦真菌分离筛选及鉴定 从虎杖组织培养过程 出现内生真菌生长，并将其取 样，接入 固体 P DA培养 基平板上进行划线分离 ，经反 复驯化 培养和划 线分离 ，获 得纯菌种 。再将 纯菌种接 种液体复筛培养基 中，在温度 2 6 、转速 1 O O r mi n条 件下培养 1 O d，待菌丝 体长好后进行 白藜芦醇提 取和 TL C和 HP L C鉴定。 1 3 基本参数的检测 加 t 1 3 1 生物 量的测定 菌丝体采 用定量滤纸抽滤后称重 。 1 3 2 白藜芦醇 的提取 发酵液取 出超声波处理 3 0 rai n 破碎细胞壁后，用乙 酸 乙酯( 1 ： 1 ) 提取 1 2 h，静置分层 ，萃取液待用 ，留水 层第二次用乙酸 乙酯( 1 ： 0 5 ) 提取 6 h ，并合 并萃取液 ，再 用旋转蒸发仪浓缩后定容至 1 ml 。 1 3 3 白藜芦醇的检测 柱系 C 1 8 反向硅胶柱( D i k ma 2 5 04 6 ram) 恒速洗 脱，流速 1 ml mi n ，流动相 4 3 2 乙腈 ，柱温 3 0 ， 检测波长 U V3 0 6 n m，进样量 1 0 u l 。用面积归一法计算 白藜 芦醇 的含量 。 1 4 菌种的活化及孢子液的制备 取冰箱中冷藏的菌种接于马铃薯固体平板培养基上 2 8 下培养 5 d ，再经过数 次平板转接 ，活化 。将 已活 化好的菌种平板在无菌操作下采用无菌生理盐水将其孢 子洗 脱，稀释，浓度约为 1 1 0 6 个 ml ，用作种子液 。 1 5 温度 、碳源与氮源 的正交试验优化 以 P D A培养基为基础，采用 L ， ( 3 ) 正交表设计正交 试验 ，因素水平 安排 见表 1 。培养基 p H 值为 7 0，培 养转速 1 0 0 r rai n ，7 d后通过测定茵体生物量及白藜芦醇 的含量 ，经方 差分析得 最佳培 养条件 。 表 1 正交试验因素水平表 T a ble 1 F a c t or s a n d le v els o f o Rh og on al d e sign f or c ult ur e c o n di t ion s 1 6 无机离子 Mg 2 + 、F e 2 + 、Z n 2 + 和 c | 2 离子对真 菌 B - 3 9生长代谢 的影响 取 Mg 2 + 、F e 2 + 、Z n + 和 c a 为受试离 子，浓度为 0 5 g L。设不加任何离子为对照。向含有不同生长因子 的改 良培养液 中接入 1 0 的真菌 B 3 9孢子液 。2 8 ， 1 0 0 r rai n培养 7 d后 ，测定茵丝 的生长量及 白藜芦醇的 含 量 。 1 7 苯丙氨酸对真菌 B 一 3 9 生长代谢的影响 1 0 的真菌 B 3 9 孢子液接种到已配制好的改 良 培养 液 中，将培养液 分为 4组 ，一组 为对照组 ，加入 1 ml 无菌水，一组为 l mmo l L浓度 的苯丙氨酸调控组，加入 浓度为 0 O 0 8 4 g m l 苯丙氨酸液 l m l ，一组为 2 mm o l L浓度 的苯丙氨酸 调控组 ，加入 0 0 1 6 8 g ml 的苯丙氨酸 液 1 ml ，组为 3 mmo l L浓度 的苯丙氨 酸调控组 ，加 入 0 0 2 5 2 g m l 的苯丙氨酸液 l ml ，一组为 4 m mo l L浓度 的 苯丙氨酸调控组，加入 0 0 3 3 6 g ml 的苯丙氨酸液 l ml ， 2 8 ，1 0 0 r mi n培养 7 d后 ，测定菌丝的生长量及 白藜 芦醇 的含量 。 1 8 综合 因子对真菌 B 3 9生长代谢的影响 1 0的真菌 B 3 9 孢子液接种到已配制好的改 良 培养 液中 ，将培 养液分 为 2组 ，一组为空 白对照组 ，一组 为实验组，加入最佳浓度 的无机离 子、苯丙氨酸溶液 ， 2 8 ，1 0 0 r mi n培养 7 d后，测定茵丝 的生长量及 白藜 芦醇 的含 量 。 2 结果 与分析 2 1 产 白藜芦真菌筛选及鉴定 按 照 “ 培养 分离单 菌落 初 筛 复筛 ”的方法 ， 在虎杖组织培养过程中分离 出一株真菌 B 3 9 。T L C和 H P L C 对该菌发酵提取物进行分析检测发现，该茵能产 白藜芦醇物质( 图 1 4 ) 。通过形态观 察 ，依据 常见 与 常用真菌 及 真菌 鉴定手册 将其初 步鉴定为 真 菌青霉属产黄青霉( P c h r y s o g e n u m) 。 2 2 温 度 、碳源 与氮源优化 结果 表 2直观 分析表 明：以生物 量为指标 ，各 因素 的 影响大小次序是 R n RA R c ，即因素 B ( 碳源) 的影响 图 1 真菌 B - 3 9提取物的T L C图谱 Fi g 1 Chr omat ogr a m of TL C o f f un g us B- 3 9 ex t r a c t s 维普资讯 维普资讯 2 4 8 2 0 0 Z V o 1 2 8 , N o 0 5 良 品 科 学 生物工程 g 1 0 O m1 ) 无机离子 图 6 无机离子对真菌B - 3 9生长与白藜芦醇代谢的影响 Fig 6 E ffe c t s o f i n or g an i c i o n s O n g r owt h an d r e s v er a t r o l pr od u c t i o n o f f u n gu s B 3 9 结果表 明( 图6 ) 供试离子对真菌B 3 9 代谢产 白藜芦醇 的影响存在差异。在均等的浓度( 0 5 ) 下 ，Mg 2 + 和其它 无机离子相比，可 以明显地促进真菌 B 3 9产白藜芦醇的 能力，Z n 2 + 也起到 了一定的作用。这说明真菌 B 3 9产 白藜芦醇的代谢途径中主要受到了Mg 2 + 的调节，Z n 2 + 也 发挥 了一定的作用 ，但其调 节机制还需要进一步研究。 2 A 苯丙氨酸对真菌 B 3 9生长代谢影响的测定 苯丙氨酸转氨酶是虎杖植物白藜芦醇的生物合成途径 中所必需的转氨酶之一 ，可能对真菌 B 3 9的生长与 目的 产物的积累也有很大影响，因此在实验中研究了苯丙氨酸 ( P h e ) 对真菌 B 3 9 生长代谢的影响结果表明，不同浓度的 苯丙氨酸溶液对菌体的生物量的影响不大，但对 白藜芦醇 含量 的影响较大 。添加 1 、2 、3 、4 mmo l L的苯丙氨酸 ( P h e ) 后，白藜芦醇含量分别为2 8 7 2 6 、3 0 9 1 1 、5 2 7 8 0 、 3 1 1 8 0 v g 1 0 0 m l ，其中3 m m o l L浓度的P h e 组是空白对照 的白藜芦醇的含量 2 1 8 1 2 1 t g 1 0 0 ml 的约2倍( 图5 ) 。 2 5 综合因子对真菌 B 3 9生长代谢 的影响 对照组 实验组 综合因子 图 7 综合因子对 B - 3 9生长与白藜芦醇的影响 Fig 7 Eff e c t s of c omp o s it i v e f a t or s on gr o wt h an d r e s v er a t r o l pr o du c t i o n o f f u n gu s B一 39 结果表明( 图7 ) ，综合因子对 真菌 B - 3 9的生物量及 白藜芦醇含量影响较大，生物量达 4 9 5 7 g ，比对照组多 了近 I g，白藜芦醇含量达 8 6 6 1 71t g 1 0 0 ml ，是对照组 的 2倍 多 3 讨论与结论 结果显示，优化后真菌B 3 9的最佳培养条件为 2 0 g L 葡萄糖 、2 g L硝酸铵 、温度为 2 8 ， 自然 p H 值( 6 8 7 0 ) ，转 速 1 0 0 r rai n ，能更好促 进真菌 B 3 9的生长 与 白藜 芦 醇 的积 累 ，其 生物 量 和 白藜芦 醇 含 量分 别 为 4 5 5 4 g、3 9 5 8 1 t g 1 0 0 ml 。 在均等的浓度( 0 5 ) 下，Mg 2 + 能明显促进 自藜芦醇 含量的增加 ，Z n 2 在一定 范围 内也起到 了作用 ， 同时 不同浓度的苯丙氨酸溶液对真菌 B 3 9的白藜芦醇含量的 影响也较大，由此推测真菌 B 3 9产 白藜芦醇的新陈代谢 途径 与虎杖 植物 白藜 芦醇 的生物 合成 途径 可能相 似 ， Mg 。 和 z n z 可能是启动苯丙氨酸转氨酶这一 白藜芦醇的 生物合成途 径中所必需的转氨酶之一 的诱导因子，但真 菌 B 一 3 9 产 白藜芦醇的生物合成途径及其作用机制还需要 进一 步研 究证 明。 综合培养条 件 、无机 离子和苯 丙氨 酸前体物 等调 控因子，实验结果表 明，真菌 B 3 9的生物量及 白藜芦 醇含量 均有较 明显 的增长效益 ，生物量达 4 9 5 7 g ，白 藜芦醇含量达 8 6 6 1 7 1 t g 1 0 0 ml ，比优化培养条件下的多 了4 u 1 0 0 m l 左右，但与虎杖植物中的白藜芦醇含量 1 3 相 比 ，明显 偏低 ，但可摆 脱植物 生长 缓慢 ，资源 短缺，组织培 养条件 要求苛刻 ，成本相对较高等缺陷， 开辟了一条新的生产 白藜芦醇的途径，并为进一步扩大 生产奠 定 了基础 ，为药用保 健品 、食 品添加 剂等行业 提供 了更 为广 阔的廉价 资源 。 参考文献 ： 【 1 】 ME I S H I A N G J ， L I NG C ， U DE A NI G O ， e t a 1 C a n c e r c h e m o p r e v e n ti v e a c t i v it y o f r e s v e r a tr o l ， a n a t u r a l p r o d u c t d e r i v e f r o m g r a p e s J S c i e n c e ， 1 9 9 7 ， 2 7 5 ( 1 ) ： 2 1 8 - 2 2 0 【 2 】 B UR K NHA R D S ， R E I T E R R J ， T A N D X， e t a 1 DN A o x i d a t i v e l y d a ma g e d b y c h r o m i u m( I I I ) a n d I- h O 2 i s p r o t e c t e d b y t h c a n ti o x i d a n t s me l a to n n i n , N( 1 ) - a c e tyl - N ( 2 ) - f o m y l 一 5 m e t h o x y k y n u r a min e ， r e s v e r a t r o l a n d u r i c a c i d J I n t J B i o c h e m C e l l Bio l ， 2 0 0 1 ， 3 3 ( 8 ) ： 7 7 5 7 8 3 3 】 S T I V A L A L A， S AV I O M， C A R AF OL I F ， e t a 1 S p e c