番茄果实高质量总RNA的提取富集及RT_PCR检测.pdf

番 茄 果 实 高 质 量 总 RNA 的 提 取 富 集 及 RT PCR 检 测 迟丽红，马远征，刘海平，田慧琴，罗云波 ，朱本忠 ( 中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京100083) 摘要: 以番茄果实为材料， 比较了 3 种在果实中提取 RNA 的方法， 针对番茄果实多糖的特点， 利用无水乙醇和 异丙醇联合沉淀的方法除去多糖， 改良了 Trizol 法。为了检验含量比较低的 miRNA， 利用 Licl 沉淀的方法进行富 集。结果表明: 改良 Trizol 法能够有效地去除多糖， 提取到的 RNA 28S rRNA 亮度约为 18S rRNA 的 2 倍， A260 与 A280 比值为 1 84， A260 与 A230 比值为 1 92， RNA 产率为 350 4 g /g， 说明利用改良 Trizol 法从番茄果实中提 取的 RNA 质量好、 完整性好。由此法所得的 RNA 可直接用于 cDNA 文库构建等分子生物学实验。 关键词:番茄;miRNA;改良 Trizol 法 中图分类号:TS25536文献标识码:A 文章编号:1003 188X( 2011) 03 0134 04 0引言 番茄( Solanum lycopersicum L )属茄科草本植 物， 又称西红柿、 番柿、 洋柿子、 六月柿， 是研究果实成 熟的模式材料。现代生物技术的发展为研究果实成 熟的分子机理提供了各种快速、 简单的方法; 但高质 量、 高浓度总 RNA 的提取、 纯化是该项研究的前提条 件， 如 cDNA 的合成， Northern 杂交和 miRNAs 的分离 等 1 。目前，CTAB 法2 、 异硫氰酸胍法3 和高氯酸 盐 4 是番茄中总 RNA 提取的常用方法， 当以叶子、 根、 茎等组织为材料时提取质量好、 浓度高， 但在番茄 果实中的效果欠佳， 质量差， 浓度低， 这主要是因为受 到果实中丰富多糖、 蛋白质、 多酚类物质及其它次生 代谢产物的影响 5 。所以， 现在急需一种能够有效去 除该类物质影响的优化方法。MicroRNAs 是分子生物 学的热点领域， 在 2002 年和 2003 年， 有关 MicroRNAs 的研究连续两年被美国科学 评为全球年度十大科 技进展之一 6 。该研究的基本技术就是 MicroRNAs 的分离提取， 高质量和浓度的总 RNA 是该项研究基 本要求， 因此选择一种总 RNA 的有效富集方法就显 得尤为重要。本文拟对文献中植物 RNA 提取技术进 行尝试和分析， 在此基础上改进了常规的 Trizol 法， 通 过用 49 1 的 ( 氯仿) ( 异戊醇) 的混合液抽提 2 次 去除蛋白质污染， 以及利用冰乙醇和醋酸钠联合沉淀 收稿日期:2010 05 11 基金项目:国家自然科学基金项目( 30972037) 作者简介:迟丽红( 1986 ) ， 女， 内蒙古包头人， 硕士研究生，( E mail) lh_chi yahoo com cn。 通讯作者:朱本忠( 1975 ) ， 男， 湖北嘉鱼人， 副教授， 博士生导师， ( E mail) cauzbz yahoo com cn。 多糖等手段， 从成熟的番茄果实组织中提取出了高质 量的总 RNA，同时利用 Licl 沉淀法的富集作用获得 高浓度的总 RNA 和内参基因的 actin 的 RT PCR 获得良好的预期效果。该方法分离、 纯化、 富集的番 茄果实总 RNA 能满足分子生物学的要求， 也可用于 MicroRNAs 的分离提取。 1材料与方法 1 1材料和试剂 1 1 1材料 取番茄品种“中蔬 4 号” 绿熟期果肉新鲜组织， 经 液氮速冻后存储于 80 冰箱保存备用。 1 1 2实验试剂和处理方法 异硫氰酸胍、 焦碳酸二乙脂( diethyl pyrocarbonate， DEPC) 购自 Sigma 公司， 反转录试剂盒购自 Promega 公司， RT PCR 引物购自上海生物公司， 其它药品、 试 剂为常规国产分析醇。 所用的试剂为新开试剂， 用 RNase free 水配置， 塑料耗材均需预先用 DEPC 水处理 12h 以上， 然后 120高温灭菌; 研钵、 试剂瓶等物品经 200 高温烘 烤 4h， 避免 RNA 酶的污染。 1 2总 RNA 提取方法 1 2 1改良 Trizol 法 以 Gehrigh 等的 Trizol 法 7 为基础进行优化。由 于番茄果实含有丰富的多糖， 笔者增加了一个 15% 乙 醇除去多糖的步骤。由于 miRNA 含量较少， 如果要提 取出 miRNA， 必须增大总 RNA 产率， 所以将 70% 乙醇 沉淀 RNA 优化为 80% 乙醇沉淀 RNA。由于用 Trizol 法提取出的 RNA 蛋白污染较多， 增加了一步用氯仿: 431 2011 年 3 月 农 机 化 研 究第 3 期 异戊醇抽提， 以便更有效地去除蛋白污染。 1 2 2改良异硫氰酸胍法 以 Wang 等的异硫氰酸胍法 7 为基础进行优化。 优化方案即在氯仿 异戊醇( 24 1) 抽提步骤中加入 1/10 体积的无水乙醇和 5 mol/L 醋酸钾( pH 5 2) 促 进多糖析出。 1 2 3改良高氯酸盐法 以 Boss 等的高氯酸盐法 5 为基础进行优化。优 化参数主要是提取缓冲液组成、 提取缓冲液提取后离 心速度和低浓度乙醇及醋酸钾的除糖效果等。 1 3RNA 富集方法 Licl 沉淀法 由于上述方法提取出的 RNA 的浓度依然不够用 于 miRNA 的后续试验， 对 RNA 又进行了 Licl 沉淀。 为了增强富集效果， 将等体积的异丙醇沉淀 30min 变 为 3 倍体积的无水乙醇沉淀过夜。 1 4RNA 纯度及其完整性检测 1 4 1RNA 琼脂糖凝胶电泳分析 在 RNA 提取方法优化研究中， 每种方法提取的 RNA 都用 50 L DEPC 水溶解， 取 2 L 电泳。RNA 经 1 2 % 琼脂糖凝胶电泳后， 用紫外凝胶成像系统观 察其完整性。 1 4 2RNA 纯度鉴定及产量计算 用 300L 10 mM TE 缓冲液( pH 7 5) 稀释 5L RNA 提取样品后， 在紫外分光光度计中测量其在 230， 260， 280 nm 处的紫外吸光值 A230， A260 和 A280。每种方法重复提取 3 次分别测定， 取平均值。 根据 A260/A280， A260/A230 比值分析 RNA 纯度; 并 且用下面的公式计算 RNA 总产量 4 ， 即 RNA 得率 = RNA 浓度( 即 40 A260 稀释倍数) 样品体积( mL) /样品质量( g) 1 4 3RT PCR 检测所提得 RNA 的质量 取 10 L 改良 Trizol 法提取的番茄果实总 RNA， 按照 Promega 公司的 MLV 反转录试剂盒说明书进行 反转录。 PCR 扩增基因为番茄 actin 引物序列如下: 上游引物: 5ACACCCTGTTCTCCTGACTGAG 3 ; 下游引物: 5AGCCTGGATAGCAACATACATAGC 3 。 2结果与分析 2 1RNA 完整性比较 RNA 样品的凝胶电泳分析是判断 RNA 质量的重 要手段之一， 从电泳胶上根据 28S 和 18SrRNA 的完整 性可以判断出 RNA 有无降解以及降解程度， 也可以 判断有无 DNA 污染 1 。3 种提取方法所得的 RNA 在 1 2% 的非变性凝胶上电泳结果如图 1 所示。3 种方 法提取的 RNA 均无明显降解， 高氯酸盐法和 Trizol 法 提的总 RNA 电泳均有明显的 28S， 18S 和 5S 3 条带， 并且 28S 与 18S 的带的亮度比约为 2 1。说明 RNA 完整性较好、 降解少， 但 Trizol 法与改进高氯酸盐法提 取的总 RNA 在点样孔附近均有明显的蛋白质污染。 比较发现 Trizol 法蛋白污染较少， 且条带亮度比高氯 酸盐法的亮， 说明 trizol 法提取 RNA 得率最高。用异 硫氰酸胍法提取的番茄果实总 RNA， 电泳检测到的条 带亮度很弱， 说明该方法不适合提取番茄果实 RNA。 图 1 3 种方法提取的 RNA 琼脂糖凝胶电泳图 Fig 1Agarose electrophoresis of total RNAs extracted by three methods 2 2RNA 样品的紫外扫描分析 对 3 种方法所得到的总 RNA 进行紫外扫描分析， 不同提取方法提取的蕃茄 RNA 的纯度与产率如表 1 所示。从表 1 可以看出，改良 Trizol 法提取的番茄果 实 RNA 的产率和纯度均优于其它 4 种提取方法。紫 外吸 收 值 OD260/ OD280 均 值 为 1 84， OD260 / OD230 均值为 1 92， 可知其 RNA 纯度较高， 并有效除 去了蛋白、 多糖、 酚类物质。从产率来看，RNA 的损 失和降解也比较少， 适合番茄果实总 RNA 的提取。 其他两种提取方法的产率都比改良 Trizol 低; OD260/ OD280 比 值 较 小， 说 明 有 蛋 白 和 酚 存 在; OD260/ OD230 小于 1 2， 表明有小分子或盐存在。综合表明， 另外两种方法有待进一步优化。 表 1不同提取方法提取的番茄 RNA 的纯度与产率 Tab1Comparison of RNA purity and yield from tomato with different methods 方法 OD260 /OD230 OD260 /OD280 RNA 产率 /g g 1 改良 Trizol 法1921843504 异硫氰酸胍法108120781 高氯酸盐法1181471148 2 3Licl 法富集 RNA 结果分析 由于上述 3 种方法提取出的 RNA 浓度较低， miR- NA 含量很少， 很难用于 miRNA 的后续研究， 用 licl 沉 531 2011 年 3 月 农 机 化 研 究第 3 期 淀的方法对 RNA 进行富集， 结果如图 2 所示。 图 2Licl 沉淀法富集 RNA Fig2Agarse electrophoresis of total RNAs enriched by Licl 从图 2 中可见， Licl 法富集后的 RNA 有明显的 28S， 18S 和 5S 3 条带; 并且 28S 与 18S 的带的亮度比 约为 2 1。这说明 RNA 完整性较好与改良 Trizol 法 提取的总 RNA 相比， 富集后的 RNA 条带亮度有明显 的提高， 说明 RNA 经过富集后浓度有较大的提高， 可 以应用于 miRNA 的后续试验。 2 4Licl 沉淀后番茄果实 RNA 的质量检测( RT PCR) 为了进一步确定所提取的 RNA 的完整性， 对 Licl 沉淀法富集的 RNA 进行了反转录获得 cDNA， 选择内 参基因 actin， 以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 获得 与预期大小一致的约为 600bp 的扩增片段 ( 如图 3 所 示) ， 结果表明提取 RNA 质量较好， 可以用于后续的 分子生物学研究。 图 3以番茄果实 cDNA 为模板的 actin 基因片段 PCR 扩增产物电泳图 Fig 3PCR products of actin gene fragments cloned from cDNA of tomato fruit were analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel 3结论 番茄果实组织中含有大量的多糖、 多酚类物质， 干扰了完整 RNA 的提取。多糖与 RNA 性质类似， 在 除去多糖的同时， RNA 也被携走， 导致 RNA 产率降 低。而在沉淀 RNA 时， 也容易产生多糖的凝胶状沉 淀。或溶解后形成粘稠的溶液， 无法用于下一步的分 子生物学实验。同时， 试验中也发现异硫氰酸胍法和 高氯酸盐法中用乙醇进行沉淀所获得的白色不透明 沉淀物体积大， 且难溶于水， 这也可由吸光值结果得 到证实。去除多糖的方法很多， 低浓度乙醇沉淀法和 醋酸钾沉淀法， 提高缓冲液中 Nacl 浓度也有助于去除 多糖。本试验中结合使用乙醇和醋酸钾， 改良了 Tr- izol 法， 除去多糖的效果较好。另外， 用 49 1 的 ( 氯 仿) :( 异戊醇) 的混合液抽提 2 次去除蛋白质污染， 获得的 RNA 质量好、 纯度高。 本文采用了 3 种方法提取番茄果实 RNA， 其中改 良的高氯酸盐法和异硫氰酸胍法不能有效地除去多 糖， 而且耗时较长; Trizol 法经改良后可以高效的提取 高质量的 RNA。最后， 用 Licl 沉淀的方法富集 RNA， 提高了总 RNA 的浓度， 相应的提高了 miRNA 的浓度， 为 miRNA 进一步的研究奠定了基础。 综上所述， 在 3 种 RNA 提取方法中， 以改良 Trizol 法最优。笔者应用该方法还成功地提取了李子、 葡萄 的果肉 RNA。该方法可以适用于大多数核果类生物 果肉的提取。 参考文献: 1 李宏， 王新力 植物组织 RNA 提取的难点及对策J 生 物技术通报， 1999( 1) : 36 39 2 Hu CG，Honda C，Kita M，et al A simple protocol for RNA isolation from fruit trees containing high levels of polysaccha- rides and polyphenol compounds J Plant Molr Biol Rep， 2002， 20: 69 3 Wang DH，Wang BC，Li IB，et al Extraction of total RNA from Chrysanthemumcontaining high levels of phenolic and carbohydratesJ Colloid Surfaces B:Biointerfaces，2004， 36: 111 114 4 Boss PK，Davies C， Robinson SP Analysis of the expression of anthocyanin pathway genes in developing Vitis vinifera L cv Shiraz grape berries and the implications for pathway regu- lation J Plant Physiol， 1996， 111: 1 059 1 066 5Zarnore，P D ，Haley，B The big world of small RNAs J Science， 2005， 309: 1 519 1 524 6 Gehrigh H，Winter K，Cushman J，et al An improved RNA isolation method for succulent plant species rich in polyphe- nols and polysaccharidesJ Plant Mol Biol Rep， 2000， 18: 369 376 7 邵毅 李采后果肉褐变发生机理及控制技术的研究D 631 2011 年 3 月 农 机 化 研 究第 3 期 北京: 中国农业大学， 2009: 55 57 Extraction of High Quality Total RNA from Tomato Fruit and RT PCR Test Chi Lihong，Ma Yuanzheng，Liu Haiping，Tian Huiqin ，Luo Yunbo，Zhu Benzhong ( Collage of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China ) Abstract:Trizol method， guanidine thiocyanate method and perchlorate method，were employed to extract total RNA in fruit of tomato And Trizol method was accordingly modified in extracting the total RNA in tomato by integrating a polysac- charide removing step in correspondence with the fact that tomato fruit was rich in polysaccharides and polyphenol Due to the low content of miRNA，we were using Licl precipitation method to enrichment it The results showed that the modi- fied Trizol method was capable of efficiently removing polysaccharides， and that of the RNA extracted by the modified Tr- izol method， the lightness of 28 S RNA was two times as much as that of 18 S RNA， the value of A260/A280， A260/ A230 was1 84，1 92;and the RNA yield reached 350 4g/g， which explained that the modified Trizol method could extract high quality and high complete RNA at a higher productivity This high quality RNA could meet the demands of molecular analysis，such as cDNA library construction Key words:tomato;miRNA;modified Trizol method (