红曲霉菌微胶囊化培养.pdf

红曲霉菌微胶囊化培养 3 张子儒 郑巧东 姚善泾 (浙江大学 化学工程与生物工程学系,杭州,310027) 摘 要 采用NaCS2PDMDAAC微胶囊对红曲霉菌进行了固定化培养试验,在进行连续6批 的培养中发现,红曲霉菌可以很好地在NaCS2PDMDAAC微胶囊生长和产红曲色素。与游离 培养细胞的比较表明,微囊化培养的糖耗时间会远远少于游离培养,红曲色素的浓度在前3 批略低于游离培养,一但达到稳定后,就会高于游离培养。同时也表明,微囊化培养时红曲霉 菌的浓度远远大于游离培养。 关键词 红曲色素,NaCS2PDMDAAC微胶囊,细胞固定化,红曲霉菌 第一作者:硕士研究生。 3 国家自然科学基金资助项目(No. 20276065) 收稿时间:2003 - 08 - 06 生物微胶囊是一种新兴的细胞固定化技 术13。纤维素硫酸钠(NaCS)2聚二甲基二 烯丙基氯化铵(PDMDAAC)生物微胶囊是一 种在1980年代被开发的固定化技术,近年来 在微生物固定化培养上有不少成功的应 用47。与其他固定化体系相比, NaCS2 PDMDAAC微胶囊膜层较薄 (20 100m) , 机械强度较高,生物相容性良好,传递和截留 性质适宜以及物化性质稳定。更重要的是, 该体系制备方法简单,只需一个步骤即可完 成,大大减小了染菌的机率。 红曲色素是一种天然的染色剂和防腐杀 菌剂,红曲霉菌发酵液中还含有多种生理活 性物质,具有降胆固醇和降血压的功效8。 红曲色素是一种次级代谢产物,长期以来都 是采用大米固态发酵法,尽管产量较高,但劳 动强度大,效率低,不适合于大规模工业生 产,而现在国内外使用的液态发酵法的红曲 色素产量低,发酵周期仍然很长9。如果采 用微囊化培养,可以在保持现有发酵条件的 基础上,缩短发酵周期,提高红曲色素产量, 从而显著提高生产效率。 我们在前 期 的 工 作 中,曾 多 次 采 用 NaCS - PDMDAAC微胶囊体系进行一些初 级代谢产物的发酵培养,如乙醇、 乳酸、 谷氨 酸、 纳豆激酶等56,而本文将把该微胶囊 体系用于红曲霉菌的固定化培养,通过模拟 红曲霉的固态发酵环境,来了解该微胶囊体 系在固定化培养生产次级代谢产物时微生物 在微胶囊内的生长繁殖和代谢规律。 1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 111 菌 种 红曲霉菌( Monascus purpureus) ,购自 浙江省微生物研究所,经本实验室筛选后使 用。 11112 培养基(g/ L) 葡萄糖3010 ,NaNO3310 ,酵母提取物 110 ,MgSO47H2O 015 ,K2HPO43H2O 110 , FeSO40101和KCl 015。 11113 微囊化材料 NaCS由本实验室自制, PDMDAAC购 自美国Aldrich公司。 112 实验方法 11211 红曲霉菌的培养 将活化的红曲霉菌接入试管斜面,30 下培养8 d。然后用10 mL无菌水从斜面洗 下孢子接入种子培养液,在往复式摇床中 1 第29卷 第11期 张子儒等:红曲霉菌微胶囊化培养 研 究 报 告 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 30, 160 r/ min下培养24 h后,将同一种子 液分别接入游离和固定化发酵瓶中。 11212 红曲霉菌的微胶囊化 配制315 %的NaCS和210 % PDM2 DAAC溶液,灭菌后待用。在无菌条件下,将 一定量的红曲霉种子液与NaCS溶液混合, 滴入PDMDAAC溶液中,磁力搅拌固化90 min左右,制成微囊化红曲霉菌。 11213 微囊化红曲霉菌的多批次培养 将30 mL微囊化红曲霉菌接入含有90 mL发酵培养基的500 mL摇瓶中,在摇床中 30,160 r/ min下培养,定时取样分析培养 基中残糖浓度和红曲色素浓度。在糖耗尽后 24 h左右更换培养基,同时取出一定量微胶 囊用于红曲霉菌生物量的分析。重复培养6 批。 11214 红曲霉菌体的收集 取出的微胶囊经过机械破碎后,用砂芯 漏斗抽滤,以去离子水洗涤数次后装入具塞 试管中,放入烘箱内烘干备用。 11215 红曲霉菌体中氨基葡糖的释放10 将烘干的待测样每管加2 mL 60 %的 H2SO4,25 浸泡24h后,稀释至H2SO4终浓 度为1 mol/ L ,置于250 mL三角瓶,0198 MPa高压下加热1 h ,冷却后用1 mol/ L NaOH中和至pH710 ,定容到100 mL待测。 113 分析方法 葡萄糖:用DNS法测定。 红 曲 色 素:用 比 色 法 测 定。Ultra2 spec3300pro全光谱扫描发酵上清液,取500 nm处的吸光值来表征红曲色素浓度。 生物量:游离细胞生物量用干重法直接 测定。固定化细胞生物量通过测定红曲霉菌 体细胞中的氨基葡糖含量来推断11。 氨基葡糖测定法12:用Elson2Morgan 法测定。 2 结果与讨论 211 微囊化的第1批培养与游离培养的比 较 为作比较,在进行固定化培养的同时也 进行了游离细胞培养,图1为红曲霉菌的第 1批微囊化细胞培养和游离培养的结果。 图1 红曲霉菌游离和微囊化第1批发酵比较 从图1中可以发现,第1批微囊化细胞 培养与游离培养具有相似的产物积累和糖耗 过程,葡萄糖和红曲色素浓度与时间的关系 都呈现与微生物游离培养规律相同的 “S” 型,表明微囊化对红曲霉菌的生长和产物生 产没有影响。在红曲霉菌的微囊化培养过程 中,葡萄糖耗尽时间比游离培养时缩短了24 h。从这个结果我们可以推测,在微囊化细胞 培养中,微胶囊既能给细胞提供一个良好的 液态环境,也能提供一个支持壁和保护体系, 可以让细胞与培养环境之间较好地进行能量 与质量交换。同时由于胶囊膜的保护,可以 防止由于剪切力的作用而使菌丝体切断,由 此增加了发酵细胞密度,使糖耗时间缩短。 而在其他微生物,如大肠杆菌、 酵母的培养 中5 ,6,由于这些微生物不存在菌丝受剪切 力的影响,所以其第1批微囊化培养的糖耗 时间与游离培养几乎一致。 同时从图1中还能看到,在培养第1批 微胶囊化细胞时,由于细胞在经历了微囊化 过程后有一个适应过程,红曲色素的产量比 游离培养低。但随着微囊化培养的重复进 行,结果将得到明显改善。 212 微囊化红曲色素的分批重复培养 红曲霉菌的第1批微囊化培养结果表 明,微囊化培养在产红曲色素方面并不优于 游离培养,但是在换入新的培养液并进行后 2 食品与发酵工业 Food and Fermentation Industries Vol129 No111 研 究 报 告 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图2 微囊化红曲霉菌第1、2和第4批发酵曲线 续发酵时,红曲色素的产量就会逐步改善。 我们共进行了连续6批的微囊化培养。图2 中示出了第1、 第2和第4批糖耗和红曲色 素产量随时间的变化规律。可以发现,糖耗 时间越来越短,到第4批时,已从游离细胞培 养的70 h降到12 h ,而红曲色素浓度随着发 酵的进行则越来越高。在第1和第2批发酵 时,红曲色素浓度还低于游离培养,但到第4 批时,发酵液中红色素浓度已经超过了游离 培养时的结果。其主要原因在于,固定化体 系为红曲霉菌的生长提供了良好的条件,使 得在微胶囊内聚集了超过游离培养多倍的菌 体浓度。从图2中可以看出,每批次最终产 物浓度依次升高,而糖耗也逐步加快,第4批 后糖耗速率基本稳定,但红色素的产量还在 不断上升。从第2批开始,尽管葡萄糖在24 h已经基本被消耗尽,但红色素积累还需要 一定的时间,因此从第2批开始,换液时间一 般控制在48 h左右。 213 微囊化红曲霉生物量的氨基葡糖法测 定 红曲霉菌菌丝发达,与微胶囊内壁紧密 结合在一起,采用机械法破碎后,很难除去胶 囊碎片,所以无法用干重法来直接测定红曲 霉的生物量,因此只能用间接法来关联。从 相关报道的结果1314看,通过测定细胞中 的特殊物质,如氨基葡糖的含量来推测生物 量比较准确、 易行。在红曲霉菌菌丝体中,氨 基葡糖是细胞中的一种特殊物质,当红曲霉 菌达到稳定期后的一段时间内,其细胞中的 氨基葡糖含量基本上保持一定的值,因此只 要测定收集的红曲霉菌菌丝体中的氨基葡糖 含量就能关联到相应的菌体干重。 图3 红曲霉菌体中氨基葡糖含量 葡萄糖耗尽后,在不同时刻从若干平行 样中取出菌丝体,测定氨基葡糖含量,得到了 如图3所示的结果。从中可以看出,红曲霉 菌菌体中的氨基葡糖含量与菌体量成正比。 同时还采用氨基葡糖法测定了每批次发酵终 点的生物量浓度,示于图4中。从中可以发 现,每批微囊化培养后,红曲霉菌菌浓都有不 同程度的增长,在第5批时达到了1314 g/ L (发酵液 ) , 而普通游离培养的细胞浓度只有 512 g/ L (发酵液 ) , 但在第6批时略有下降。 同时,随着菌浓的积累,红曲色素的产量也不 断上升,在第6批也有一个突然的下降过程。 图4 微囊化红曲霉菌重复培养菌干重 和红曲色素产量曲线 3 结 语 在固定化红曲霉菌的第1批发酵中,由 3 第29卷 第11期 张子儒等:红曲霉菌微胶囊化培养 研 究 报 告 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 于胶囊的保护和支撑作用,囊内的菌丝体不 但浓度高于游离培养,并且避免了剪切力的 破坏而更加完整,因此葡萄糖消耗更快。但 是细胞对固定化体系需要一个适应过程,随 着一批又一批发酵的进行,除了囊内菌浓继 续增加外,糖耗也在缓慢加快,这时的红曲色 素产率已经远高于游离时的水平。但是由于 细胞浓度的增加,为了保证发酵液中的溶氧 水平,摇床的转速必须有所加快。在这样的 情况下,有可能会对微胶囊产生破坏作用,影 响培养的继续进行,如在第6批培养时,胶囊 出现一定程度的破碎说明了这一点。 这些结果充分说明,对于霉菌类微生物, 微囊化培养是一个很好的选择,而且微胶囊 培养也完全适用于次级代谢产物的生产,但 要适当控制好时间。这同样也给我们一个启 示,在好氧微生物的微囊化培养中,要注意氧 的供给,加快摇床转速并不是一个最佳选择。 在大规模微囊化培养时,应注意生物反应器 的选择。 参考文献 1 Jen C R , Hancher D J1Biotech Bioeng , 1996 ,50 : 357364 2 Rupp R G1Large2Scale Mammalian Cell Culture1 New York: Academic Press ,1985 3 Lim F , Sun A M1Science ,1980 ,210 :908 4 姚善泾 1 生物工程学报,1998 ,14(2) :193197 5 张惠勇,梅乐和,姚善泾 1 生物工程学报,1999 , 15(3) :165170 6 叶子坚,姚善泾 1 微生物学报,2000 ,40(5) :507 512 7 Yao SJ1Verfahrenstechniche Auslegung einer An2 lage fuer die Natrium2Cellulosesulfat2herstellung zur Immobilisierung von Biokatalysatoren1VDI2 Verlag , Dusseldorf , Germany , 199615759 8 Fabre C E , Santerre A L , Lore M O1J Food Sci2 ence , 1993 , 58 :10991102 9 Carels M ,Shepherd D1Can J Microbiol , 1977 ,23 : 13601372 10 Sakurai Y, LeeT H , ShiotaH1Agric Biol Chem ,1977 ,41(4) :619624 11 Aidoo K E , Hendry R , Wood B J B1Eur J Appl Microbiol Biotechnol ,1981 ,12 : 69 12 张惟杰主编,糖复合物生化研究技术(第二版 ) , 浙江:浙江大学出版社,1999 13 Ride JP , Drysdale R B1PhysiologicalPlant Pathology ,1972 ,2 :715 14 Kennedy M J ,Thakur M S ,Wang D I C. Prog , 1992 ,8 :375381 Cultivation of EncapsulatedMonascus purpureusin NaCS2PDMDAAC Capsules Zhang Ziru Zheng Qiaodong Yao Shanjing (Department of Chemical and Biochemical Engineering , Zhejiang University , Hangzhou , 310027) ABSTRACT The NaCS2PDMDAAC capsules were applied to pigment production by the fungus Monaseus purpureus1The results in the repeated culture of six batches showed that the encapsu2 lation system had no effect on the growth ofM1pu