响应面优化法对香菇多糖提取的工艺研究.pdf

辽宁农业科学2 0 1 0 ( 2 ) ： 1 1 1 4 Li a o n i n g Ag r i cu l t u r a l Sc i e nc e s 文章编号 ： 1 0 0 21 7 2 8 ( 2 0 1 0 J 0 2 0 0 1 1 0 4 响应面优化法对香菇多糖提取的工艺研究 魏桢 元 ，钟耀广 ，刘长江 ( 1 上海海洋大学食 品学院 ， 上海2 0 1 3 0 6 ； 2 沈 农业 大学 食品学院 ， 辽 宁 沈阳 1 1 0 1 6 1 ) 摘要 ： 采用响应 面法优化热水浸提香菇 多糖的工艺条件 ， 以浸 提时 间 、 浸提 温度 和料液 比为影响 因素 ， 在 单因 素实验 的基础上 ， 应用 B o x B e h n k e n中心组合实验 方法进 行三 因素三 水平 的实验 设计 ， 以 多糖 得率 为响 应值 进行 响应 面分析 ( R S A) 。实验结 果表明 ， 热水 浸提香菇 多糖的最佳 工艺条 件为 ： 浸提温 度 7 8 6 o C、 浸提 时间 1 2 0 rai n和料 液比 1 ： 5 8 ， 3 ( g m1 ) ， 在此条件下 的多 糖得率和含量分别为 1 4 2 2 和 3 8 5 7 。 关键 词 ： 香菇 多糖 ； 响应 面法 ； 提取 ； 优化 中 图 分 类 号 ： $ 6 4 6 1 2； R 2 8 4 2 文 献 标 识 码 ： A 香 菇 ( L e n t i n u s e d o d e s )属 于 担 子 菌 纲 伞 型 科 真 菌 ( B a s i d i m y c e t e s ) ，是 世界 上第 二 大 食 用 菌 。 中医理论认 为香菇具有多种功效 ， 可以治疗伤寒 、 天花 、 溃疡 、 便秘 、 痛风等。现代医学研究表明， 香 菇多糖能促进人体 内细胞毒 T淋巴细胞 ( C T L ) 的 产生 ， 提 高 C T L 的 杀 伤 活 力 ， 增 强 人 体 免 疫 功 能 。此外 ， 香 菇 多 糖 还 具 有 多 种 生 物 活 性 ， 包 括抗肿瘤 、 抗病毒 、 抗凝血和 降血脂 等活性 口。 。 本研 究采 用 热水 浸 提 法 对 香 菇 多 糖 进 行 提 取 ， 并 对影响香菇多糖的几个重要因素进行 了响应面分 析 ， 并优化了其工艺条件 。 1 材料与方法 1 1材 料 与仪 器 1 _ 1 1 实验 材 料 干香菇 ， 上海市农业科学院食用菌研究所 ， 干 燥 粉碎 后过 8 0目筛 ， 备 用 。 1 1 2 实验仪 器 J Y L A 0 7 0多 功 能 粉 碎 机 ， 九 阳 股 份 有 限 公 司 ； HH S恒 温 水 浴 锅 ； 金 坛 市 正 基 仪 器 有 限 公 司 ； R 2 0 5旋 转 蒸 发 器 ， 上 海 申生 科 技 有 限 公 司 ； T D L 5 A低速 台式 离 心机 ， 上 海 安亭 科 学 仪 器 厂 ； C P A分析天平 ， 德 国赛 多利 多股份公 司； 2 1 0 0分 光光度， 优尼科仪器有 限公 司 ； T H Z 一 8 2( A)气浴 恒温 振荡 器 ， 金 坛 市 科 析 仪 器 有 限 公 司 ； D F - 1 0 1 S 磁力搅拌器 ， 巩义市予华仪器有限公司。 1 1 3 实 验 试 剂 9 5 乙醇 ( 国药集 团化 学试 剂 有 限 公 司 ， A R) ； 浓硫 酸 ( 国药 集 团化学 试剂 有 限公 司 ， A R) ； 重蒸 酚 ( 上 海楷 洋 生 物 技 术 有 限 公 司 ， A R) ； 丙 酮 ( 国药集 团 化 学 试 剂 有 限公 司 ， A R) ； 乙醚 ( 国 药 集 团化 学试 剂 有 限 公 司 ， A R) ； D 一 葡 萄糖 ( 上 海 埃 彼 化学 试 剂有 限公 司 ， A R) 。 1 2 实验 方 法 1 2 1 香 菇 多糖 的提 取 称 取 一定 量 的香 菇 粉 末 ， 按 实验 设 计 的浸 提 时 间、 浸 提 温 度 、 料 液 比条件 进 行 热 水 浸提 ， 然 后 抽 滤 ， 重 复 提 取 2次 ， 合并 滤 液 ， 滤 液 浓 缩 至原 体 积的 1 3 ，加入 3倍体积的 9 5 乙醇 ， 4醇析过 夜 。醇析 液在 常 温下 于 4 0 0 0 r m i n离 心 1 5 m i n ， 将沉 淀物 热 风干燥 ， 得 香菇 粗 多糖 。 1 2 2 多糖 含量 测 定 标准 曲线绘制 ：准确称取标准葡聚糖 ( 或葡 萄糖 ) 2 0 mg 于 5 0 0 m l 容量瓶中 ， 加水至刻度， 分 别 吸取 0 4 、 0 6 、 0 8 、 1 0 、 1 2 、 1 4 、 1 6 、 1 8 ml ， 再 用水 补 至 2 0 m l 。然 后加 入 6 苯酚 1 0 m l 及 收稿 日期 ： 2 0 1 0 0 3 0 1 基金项 目： 上海海洋大学研究 生科研 基金项 目 ( A 2 5 0 1 - 0 9 -00 0 0 8 7 1 3 8 ) ； 上海 海洋大学 引进优 秀人才科 研基金 项 目( B - 8 2 0 3 - 0 8 0 2 2 1 ) 作者简介 ： 魏 桢元( 1 9 8 4一) 男 ， 上海 ， 硕士研究生 ， 研 究方 向 ： 功能性食品 ， w e i s h o u v i p 1 6 3 C O l la 通讯作者 ： 钟耀广 ( 1 9 6 5一) 男 ，教授 ， 博士 ， 研究方 向 ： 食 品安全与功能性食品 ， z h o n g y a o g u a n g 1 2 6 c o rn - 1 2 辽 宁 农 业 科 学 2 0 1 0拒 浓硫 酸 5 0 ml ，静 止 1 0 m i n ， 摇 匀 ， 室 温 放 置 2 0 m i n 以后 于 4 9 0 n m测光 密度 ， 以 2 0 m l 蒸馏水 按同样显色操作作为空 白， 以横坐标为葡萄糖浓 度 ， 纵坐标为光密度值 ， 制作标准 曲线。 取一定量的香菇多糖粉末 ， 复溶 ， 用透析袋流 水透析过夜 ， 去除单糖 、 寡糖等小分子物质。透析 液进 行梯度 稀 释 ， 按照 苯酚一 硫 酸法 ， 测定4 9 0 a m 波长 下 的吸光度 ， 并 根 据 多糖 标 准 曲 线方 程 计算 多糖含 量 。 1 2 3 多糖提 取 的单 因素 实验 按照不同的热水提取温度、 时间、 料液比提取 香菇多糖 ， 实验重复 3次， 计算多糖得率。 1 2 4响应 面优 化设 计 实验 结合单 因素 实验 结果 ， 应用 B o x B e n h n k e n设 计三因素三水平的实验 ， 并利用响应 面法对香菇 多糖 的提取 条件进行 优化 。 2结果与讨论 2 1 多糖 标准 曲线 的绘制 以葡萄 糖浓度 为 自变量 ， 光密度 值为 因变量 ， 得到 多 糖 浓度 C和 吸光 度 O D值 的线 性 回归 曲 线 ， 其方程为 Y=0 0 0 5 8 x+0 0 0 1 3 ， R ：0 9 9 2 4 ( 图 1 ) 。 2 2 单 因素 实验结 果分析 2 2 1 浸提 温度 对香 菇粗 多糖得 率的 影响 设 定 热 水 浸 提 时 间 为 9 0 ra i n ，料 液 比 为 1 ：6 0 ， 分 别选择 提 取 温度 为 5 0 、 6 0 、 7 0 、 8 0 、 9 0 c c 进行 单 因素实验 ， 测定 吸光度 值 ， 计 算香 菇多糖 得 率。由图2可知 ， 当提取温度在 8 0 以下时， 随 着 提 取 温度 的升 高 ， 香 菇 粗 多 糖 得 率逐 渐 提 高 。 当提取 温度超 过 8 0 时 ， 容 易 引起 多 糖 的 降解 ， 多糖得率明显降低。 2 2 2浸提 时间对 香菇粗 多糖得 率 的影响 设 定 热 水 浸 提 温 度 为 9 0 ，料 液 比 为 6 0 ：1 ， 分别选择提取 时间为 3 0 、 6 O 、 9 0 、 1 2 0 、 1 5 0 m i n 进行单因素实验 ， 测定吸光度值， 计算香菇多 糖 得率 。 由图 3可 知 ， 当 提 取 时 间小 于 1 2 0 ra i n 时 ， 随着提取时间的延长 ， 香菇粗多糖得率逐渐提 高 。当提取 时 间 超 过 1 2 0 ra i n时 ， 粗 多 糖 得 率 呈 下降的趋势。 2 - 2 3料液 比对 香菇粗 多糖得 率 的影响 设定 热水 浸 提 时 间为 1 2 0 rai n ，浸 提 温 度 为 9 0 ， 分 别选 择 料 液 比为 1 ：3 0 、 1 ：4 0 、 1 ： 5 0 、 1 ：6 0 、 1 ：7 0进行单因素实验 ， 测定吸光度值 ， 计 算香菇多糖得率。由图 4可知， 当料液比从 3 0倍 增至 6 0倍时 ， 香菇粗多糖得率明显提高。当料液 比超过 6 0倍时 ， 粗多糖得率缓慢下降。加水量的 增加会大大增加能量的消耗。 Q O 5 0 0 4 03 02 Ol 0 褂 0 2 O 4 O 6 O 8 0 葡萄糖 浓度 ( ) 图 1 葡萄糖标准 曲线 温 度 ( ) 图 2 浸提温度对香菇粗多糖得率的影响 Fi g ur e 2 The e f f e c t s o f e x t r ac t i o n t e mpe r at u r e on t h e y i e l d r a t e o f c r ude po l ys a c c ha r i d e f r o m mus h- r0om 1 4 槲 1 2 l 0 8 0 2 5 5 0 7 5 1 0 0 1 2 5 1 5 0 1 7 5 时间 ( ra i n ) 图 3浸提时间对香菇粗多糖得率的影响 Fi g ur e 3 The e f f e c t s o f e x t r a c t i on t i me o n t he y i e l d r a t e o f c r ude p0 l ys a c c har i de f r om m u s hr o om 、 V 槲 料液比 图 4 料液比对香菇粗多糖得 率的影响 Fi gu re 4 The e ffe c t s o f m a t e r i a l l i qu i d r at e o n t he y i e l d r a t e o f c r u d e p o l y s a c c h a r i d e f r o m m us hr o o m 第 2期 魏桢元等 ： 响应面优化法 对香菇多糖提取 的工 艺研 究 1 3 2 3响应 面法 对 热水 浸 提 香 菇 多 糖提 取 条 件 的 优 化 在 单 因素 实 验 基 础 上 ， 以 浸 提 时 间 ， 浸 提 温 度 ， 料液比作为 自变量 ， 进 行三 因素三水平 B o x B e n h n k e n的 中心组 合 实 验设 计 ， 因 素水 平 表 如表 1所示 。浸 提 时 间 ( A) 、 浸 提 温 度 ( B) 和 料 液 比 ( C) 编 码 值 与 实 验 值 间 的 转 换 公 式 为 ： 4 = ( Z 一 8 0 ) 1 0 ， B =( Z 2 - 1 2 0 ) 3 0 ， C =( Z 3 6 0 ) 1 0。 以香 菇 多糖得 率 为 响应值 进 行 相应 分 析 实验 ，结 果 如表 2所示 。表 2中实 验 11 2为 析 因实 验 ， 1 31 5为 中心 实 验 。 1 5个 实 验 点 分 为 分 析 因点 和零 点 ， 其 中析 因点位 自变量 取值 在 A， B， C所 构 成 的三 维顶 点 ， 零 点 为 区域 的 中心 点 。零 点 实 验 重 复 3次 ， 用 以估 计 实验 误差 。 利 用统计 分 析软 件 D e s i g n - e x p e r t 对 所 得数 据 进行 分 析 ， 回归 分 析 结 果 见 表 3 。 因 子 经 回归 拟 合 ， 解得 回归方 程为 ： Y=1 0 6 A+0 1 9 B+0 6 0 C 一 0 01 3 AB +0 8 4 AC +0 73 BC 一3 2 5 A 一0 21 B 一 1 96C + 1 3 9 7 回归模 型 的 R 为 0 9 7 4 5 ， 说 明模 型 的拟 合 度很 好 ， 响 应 值 的 9 7 4 5 的 是 由于 所 选 变 量 引 起 ， 采用 F检验 方 法 对模 型 的显 著性 进 行 分 析 ， F 值 为 2 5 3 2 5 ， P值 CB， 同 时可 以看 出 B C，A C对 香 菇 多 糖 得 率 的交互 影 响显 著 ( P 0 0 5 ) 。 图 5 、 图 6 、 图 7为 因素 交互 作 用 的 响 应 面 和 等 高线 。从 图 中可 以看 出 ， 3个 响应 面均 为 开 口 向下 的凸行曲线 ， 说明响应值 ( 香菇多糖得率 ) 存 在极 大 值。3个 图 中 的 等 高 线 中 心 均 位 于 一 1 1 ， 说明提取 的最优条件存 在于所设计 的因 素水 平 范 围之 内。 表 1 B o x - B e n h n k e n中心组合实验设计 因素和水 平 Tab l e 1 Fa c t o r s a nd l e v e l s o f Box Be nhnke n d e s i gn 表 2 B o x - B e n h n k e n中心组合设计方案及实验结 果 Tabl e 2 Bo x Be nhnke n de s i g n a nd t he r e s ul t s o f t he e x oe r i m e nt s 表 3回 归 分 析 结 果 Tabl e 3 St a t i s t i c a l r e s ul t s of r e g r e on a na l y s i s F Va l u e DF 6 7 1 O 9 0 5 0 3 0 2 9 3 6 2 5 1 0 2 8 2 2 1 O 3 8 9 3 0 1 6 1 4 1 8 0 1 5 0 1 0 0 0 4 6 9 l l 7 4 6 2 5 3 2 5 9 O 5 3 0 7 51 0 3 O 1 0 2 0 2 9 3 9 9 4 7 6 2 51 00 0 2 1 2 8 2 9 5 8 7 2 1 O 71 4 2 3 8 9 3 l 3 2 2 4 3 O 1 6 5 3 8 l 4 1 8 4 81 6 3 0 0 2 9 0 0 3 4 1 4 4 0 0 2 3 、 、 、 、 、 、 、 、 1 1 2 2 8 2 4 1 l 1 O O 4 O 9 O O 0 8 0 0 O 2 0 8 O O O 6 O 0 O 0 O 8 0 0 0 0 0 O O O O 0 O 0 O O O m u o E 如 蓦虫 他 A B c 陇 1 4 辽 宁 农 业 科 学 2 0 1 0正 圈 5 Y=f ( A， B) 的 响应面图和等高线图 F i g u r e 5 R e s p o n s i v e s u rfa c e s a n d c o n t o u r s o f Y=f ( A， B) 图 6 Y= f f A， C J 的响应面图和等高线圈 F i g u r e 6 Re s p o n s i v e s u rfa c e s a n d c o n t o u r s o fY=f ( A。 C) 图 7 Y= f ( B， C) 的响应面图和等高线 图 F i g u r e 7 Re s p o n s i v e s u rfa c e s a n d c o n t o u r s o fY=f ( B， C) 图 5显 示 了 A 由 高水 平 到 低 水 平 变 化 过程中等高线的数 目明显多于 B， 说 明浸提温度 对 香 菇 多糖 得 率 的影 响很 显 著 。 由 图 6可 以看 出 ， 等高线呈 椭 圆形 ， 且椭 圆 的轴线与 坐标轴 之 问 的有较 大的 角度 ， 说 明 温度 与 料 液 比之 间存 在显 著的交互作用。对多元二 次 回归方程进行求偏 导 ， 可 以得到 ： Y=1 0 6 0 0 1 3 B一6 5 A十0 8 4 C ：Y = 0 1 9 0 Ol 3 A 一0 42 B +0 7 3C ；Y = 0 6 0 +0 8 4 A+0 7 3 B一3 9 2 C联立方程组 ， 解得热水 浸提香 菇 多 糖 最 优 条 件 的编 码 值 如 下 ： A = 0 1 3 8 ， B=0 0 0 2 ， C：0 1 6 9 。即在浸 提温度 为 7 8 6 ， 浸提 时 间为 1 2 0 mi n ， 料 液 比为 1 ：5 8 3 时 ， 模型预测香菇粗多糖得率最大值为 1 4 1 2 。 3 结论 通 过 B o x B e n h n k e n 设 计 和 响应 面分 析法 ， 利 用 D e s i g n E x p e r t 统 计 软 件 能 够 可 靠 地 进 行 优 化 实 验 以及 数据 处理 。 本实 验应 用这一 方法对 香菇 多糖提 取 的工 艺 条件 进行 了优 化 。在 单 因 素实 验 的 基础 上 ， 应 用 B o x B e n h n k e n设计三因素三水平 的实验 ， 确定出 香 菇 多 糖 提 取 的 优 化 工 艺 条 件 为 ： 提 取 温 度 7 8 6 ， 提取 时 间 1 2 0 m i n和 料液 比 1 ：5 8 3 ， 提 取得率为 1 4 2 2 及其多糖含量为 3 8 5 7 。 参 考 文 献 1 C h a n g S T Mu s h r o o m b i o l o g y ：t h e i m p a c t o n m u s h r o o m p r o - d u c t io n a n d mu s h r o o m p r o d u c t s J M u s h r o o m B i o l o g y a n d Mu s h r o o m P r o d u e ! s ， 1 9 9 3， 1 2 2： 32 0 2 王志明 ， 陈祥贵 香菇营养 成分 的酶解提取及 利用 J 四 川 I 工业学 院学报 ， 1 9 9 8 ， 1 7 ( 1 )： 4 6 4 9 3 Z H O U L D， Z H A N G Q H， Z H A N G Y T h e s h i i t a k e mu s h roo m d e r i v e d i mmu n e - s t i mu l a n t l e n t i n a n p r o t e c t s a g a i n s t mu rin e ma l a r i a b l o o d- s t a g e i n f e c t i o n b y e v o k i n g a d a p t i v e i mmu n e r e s p o n s e s J I n t J I mmu n o p h a r ma e o l ， 2 0 0 9 ， 9 ( 4 ) ： 4 5 54 6 2 4 C h i h a r a G， Ma e d a Y Y， Ha mu r o J ， S a s a k i T， F u m i k o F I n h i b i t i o n o f mo u s e s a r c o ma 1 8 0 b y p o l y s a c c h a r i d e s f r o m L e n t i n u s e d o d e s J N a t u r e ， l 9 6 9 ， 2 2 2： 6 8 7 6 8 8 5 F u me H， K i to h I P h a s e 1 1 1 一 s t u d y o n L e n t i n a n J a p a n e s e J 3 C a n c e r C h e mo t h e r a p y， 1 9 8 1， 8： 9 4 49 6 0 6 张惟杰 糖复合多糖生化研究技术 ( 第二版) M 杭州 ： 浙 江大学 出版社 ， 1 9 9 4 7 1 B o x G E P ， H u n t e r W G S t a t i s t i c s f o r E x p e ri m e n t s ：a n I n t m- d u c t i o n t o D e s i g n ，D a t a A n a l y s i s a n d Mo d e l B u i l d i n g M Ne w Yo r k：W i l e y， 1 9 9 0 Op t i mi z a t i o n o f Ex t r a c t i o n o f Le n t i n a n b y Re s p o n s e S u r f a c e M e t h o d o l o g y WE I Z h e n y u a n ， Z HONG Ya o g u a n g 一， L I U C h a n g j i a n g ( 1 C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y ， S h a n g h a i O c e a n U n i v e r s i t y ， S h a n g h a i 2 0 1 3 0 6 ； 2 C o l l e g e of F o o d S c i e n c e ， S h e n y a n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i ty， S h e n y a n g， L i a o n i n g l 1 0 1 6 1 ) Ab s t r a c t ：Re s p o n s e s u r f a c e me t h o d o l o g y( RS M)w a s a p p l i e d t o o p t i mi z e t h e h o t w a t e r e x t r a c t i o n s o f l e n t i n a n E x t r a c t i o n t e mp e r a t u r e， e xt r a ct i o n t i me a nd s o