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农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology2008,16(3):494500 *基金项目: 上海市科技兴农重点攻关项目(农科攻字 (2004) 第 73号)资助。 *通讯作者。Author for correspondence.研究员, 主要从事西甜瓜遗传育种研究。Email: . 收稿日期: 20070905 接受日期: 20071018 研究论文 应用 SSR 分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度 * 李菊芬 1 , 许 玲 1 , 马国斌 2 * (1. 华东师范大学生命科学学院, 上海 200062; 2.上海市农业科学院园艺研究所, 上海市设施园艺技术重点实验室, 上海 201106) 摘要: 以甜瓜( L.)杂交一代品种东方蜜 1号、 东方蜜 2号及其亲本和 7 个同母异父的杂交组合为实验材料, 利用SSR标记对甜瓜杂交种纯度进行了快速鉴定。结果表明, 应用筛选得到的 12 对东方蜜1 号 SSR特异性引物及3 对东方 蜜2 号SSR特异性引物可快速准确地鉴定出杂交种中混杂的母本自交系种子,且鉴定结果与大田鉴定结果基本一致。利用 SSR引物组合MS48+MS60和MS4+MS20分别可以把东方蜜 1号、 东方蜜2号与其各自亲本及同母异父的7个杂交组合完全 区分开。应用 SSR引物组合的方法不仅能够有效地检测出混杂在杂交种中的母本自交系种子, 也能检测出其它不明来源花粉 所导致的生物性混杂, 提高了甜瓜杂交种纯度检测结果的准确度。 关键词: 甜瓜;SSR标记; 杂交种纯度 中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号: 10061304(2008)03049407 Identification of Melon Hybrid Purity by SSR Markers LI Jufen 1 , XU Ling 1 , MA Guobin 2 * The hybrid purity of melon( L.) was tested by PCR assay based on simple sequence repeats (SSR) markers in two F 1 melon hybrids(Dongfangmi 1 and Dongfangmi 2) and their parental lines. And twelve pairs of SSR primers for Dongfangmi 1 and 3 pairs for Dongfangmi 2 were selected. Results showed that selfinbred seeds were effectively distinguished from F 1 hybrid seeds using these SSR primers, which was consistent with the results tested in field. Dongfangmi 1 and Dongfangmi 2 were identified from their parental lines and seven other uterine hybrid lines by multiplex primers MS48+MS60 and MS4+MS20, respectively. In conclusion, contamination of F 1 hybrid seeds caused by selfinbred and other unknown pollens can be effectively and more reliably detected by PCR assays with the multiplex SSR primers. melon ( L.) SSR marker hybrid seed purity 随着甜瓜 ( L.) 生产业的发展, 许 多甜瓜杂种一代品种已广泛用于生产,但是在人工 杂交制种过程中, 由于隔离不严或人工去雄不及时、 不彻底等原因,常混有母本自交系种子或由其它不 明来源甜瓜花粉所造成种子的生物性混杂,同时在 种子流通过程中也常有假冒现象发生,而给生产造 成重大损失。因此, 杂交种在包装销售前, 必须通过 纯度检测。 目前, 大田形态鉴定法是普遍采用的检测 方法 (梅 眉 和陆 璐, 2005) , 此方法虽然比较直观 可靠, 但费时、 费工, 成本也较高, 因此开发快速、 准 确和经济的实验室鉴定杂交种纯度的方法十分必 要。有关甜瓜杂交种纯度室内快速鉴定的方法已有 一些研究, 从早期的蛋白质 (马国斌等, 1999) 、 同工 酶 (马国斌, 2004) 、 RAPD (刘富中等, 2002) 和 AFLP (翟文强等, 2002)到目前的 SSR 标记(艾呈祥等, 2005) 等, 尽管方法不尽相同, 也各有其优缺点, 但所 有的关注点都集中在了杂交品种中可能混有的母本 自交系种子所造成的种子纯度问题,而对于可能存 在的由于不明来源甜瓜花粉所造成的生物性混杂以 及假冒所造成的种子质量问题, 却均未涉及, 而这些 第 3 期 李菊芬等:应用 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度 表 1 79 对 SSR 引物序列 Table 1 DNA sequences of 79 pairs of SSR primers 问题也同样是甜瓜杂交种生产和流通领域中最令人 担心的问题。本研究在筛选出能够区分杂交品种与 母本自交系的 SSR 标记后, 又对杂交品种和与其同 母异父的几个杂交组合进行了 SSR 标记分析, 以期 找到能够鉴别各类混杂的 SSR 标记,为进一步准 确、 快速的鉴定甜瓜杂交种纯度提供技术资料。 1 材料和方法 1.1 材料 供试甜瓜( L.)品种: 哈密瓜型甜 瓜新品种东方蜜 1 号和东方蜜 2 号及其父母本; 7 个和东方蜜 1 号同母异父的不同杂交组合; 7 个和 东方蜜 2号同母异父的不同杂交组合。均由上海市 农业科学院园艺研究所提供。 1.2 方法 1.2.1 甜瓜 DNA 的提取 以发芽 3 d 的甜瓜幼嫩 子叶为材料, DNA提取参考尿素提取法(Sun , 2000) , 略有改进: 称取子叶 0.05 g于 1.5 mL离心管 中,加入 200 滋 L 提取 缓冲液 (尿素 7 mol/L, TrisHCl 0.2 mol/L (pH 8.0) , EDTA 0.05 mol/L, 十二 烷基肌氨酸钠 2%) , 用小研棒迅速研磨成浆, 再用 400滋 L提取缓冲液冲洗; 加入 600 滋 L 酚 氯仿 异 戊醇 (25颐 24颐 1) 剧烈震荡 20 s, 12 000 r/min 离心 5 min, 取上清 (可重复抽提 1 次) ; 加入 1/10 体积 3 mol/L NaAc (pH 5.2) 和等体积预冷的异丙醇, 颠倒 混匀, 12 000 r/min 离心 5 min;弃上清,沉淀溶于 400 滋 L 灭菌 ddH 2 O 中,加入 40 滋 L 3 mol/L NaAc (pH 5.2) 和 1 mL无水乙醇轻轻混匀后, 12 000 r/min 离心 5 min; 弃上清, 70%乙醇洗涤, 室温干燥后溶于 50 滋 L TE 中; 加入 5 滋 L RNase A (10 mg/mL) , 37 水浴 40 min, 20 保存备用。 1.2.2 SSR 分子标记的 PCR 扩增与电泳检测 选 用 了来 自 属 的 79 对 SSR 引 物 序 列 : MS1 MS23 (DaninPoleg , 2001) , MS24 MS25 (Fazio 2002) , MS26MS30 (Katzir . , 1996) , MS31MS37(Jarret , 1997) , MS38 MS79 (Gonzalo ., 2005) (表 1) , 由上海赛百盛公 司合成。PCR 所需试剂均购于 TIANGEN公司。 SSR 反 应 体 系 (25 滋 L) : 10伊 buffer 2.5 滋 L, MgCl2 (25 mmol/L) 2.0 滋 L, dNTP(10 mmol/L)0.5 引物编号 Primer No. MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 MS10 MS11 MS12 MS13 MS14 MS15 MS16 MS17 MS18 MS19 MS20 MS21 MS22 MS23 MS24 正向引物(53) Sense primer(53) CGGCAAGACGATTGGCAGC TCAACTGTCCATTTCTCGCTG TTACTGGGTTTTGCCGATTT CAACCACCGACTACTAAGTC CAAAAGGTTTCGATTGGTGGG GCATAAAAGAATTTGCAGAC AAGCACACCACCACCCGTAA GAGGGAAGGCAGAAACCAAAG ATCATTGGATGTGGGATTCTC CAATCGCAGATACTTCCACG CGGATTGTACTTATTGCCAAG CTCCTTCAAACATTGTGTGTG GGAACAGACACCTCTTCTGAG TTAAATCCCAAAGACATGGCG ATTGCCCAACTAAACTAAACC CTTGTTTCGAGACTATGGTG ACGTGCTTCAGTAAACATG GCTCCTCCTTAACTCTATAC GTCTCTCTCCCTTATCTTCCA GACAGTAATCACCTCATCAAC GTTTGATAATGGCGGATTGT GTGGGTCATCATTATTGTTA TAGGGCAGGTATTATTTCAG TGTGATCAACCAACTTCA 反向引物(53) Antisense primer (53) ATCACCGTAGCGAAGCACC CCGTAAAGACGAAAACCCTTC AATTCCGTATTCAACTCTCC CGACCAAACCCATCCGATAA AAATGGTGGGGGTTGAATAGG AGAATTGAGAAGAGATAGAG GTGAATGGTATGTTATCCTTG GCTACTTTTGTGGTGGTGG ACAGATGGATGAAACCTTAGG TGCTTGTCCCAACGGTGTCAT CATGTGCATGTGTGCATGTAC GAGATAGGTATAGTATAGGGG TCCGTCTACAAGCGTGACTGT AGACGAAGGACGGTTAGCTTT CACAACACAATATCATCCTTG TTCAACTACAGCAAGGTCAGC CCGACATTGAAAACCAACTTC GCATTATTACCCATGTACGAG GATGGTGCCTTAGTTGTTCCG GGGAATGTAAATTGGATATG GTAGAAATGAAGGTATGGTGG GCTTTTAGCCTATTAAGTTGC ACGGACTGATTTAGTATAGGC GAATTATGGGTTCATTTT 495 农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年 MS25 MS26 MS27 MS28 MS29 MS30 MS31 MS32 MS33 MS34 MS35 MS36 MS37 MS38 MS39 MS40 MS41 MS42 MS43 MS44 MS45 MS46 MS47 MS48 MS49 MS50 MS51 MS52 MS53 MS54 MS55 MS56 MS57 MS58 MS59 MS60 MS61 MS62 MS63 MS64 MS65 MS66 MS67 MS68 MS69 MS70 MS71 MS72 MS73 MS74 MS75 MS76 MS77 MS78 MS79 ATTCAACATGCGTGCGTTCGTGCG TGGATGGATAAGGTGGTAAG TTGGGTGGCAATGAGGAA GAACTAAGACTCTCCAATTAA ATGAAGAAGGGATATTCAAAG TTCTCCATGTTTGGATTCTTT CACCCTCCTCCAGTTGTCATTCG GCCTTTGAAAGAGAGTTGCTCG CGCGCGTGAGGACCCTATA ACCCTCGCTGCTGTTATTCA GAGGCGGAGGAGTTGAGAG TTCTGCTCAGTTTCTTCCTAAT CTTTTTCTTCTGATTTGACTGG CCCTTCATTTTCATCATCC CTGAAAGCAGTTTGTGTCGA GTTAAAGGCTATGGTATAGAAC AAAACAAAAGCTCTCCACGA CACCTTAAAGTTTAGCCCC GCATTGCTCGATCAGTTTTAC AATGACACTGCCCACATTCT CCTCCGCCACATATTACAAT CCCCCATATTCATCAAAACT TTTTTGTCGTTATATGAGGG TATATTGGCTTTGGCTCTCG ACCAATCCATCACTCTCACT GAATGATTGGAGCAACCAGT GCTGTAAAACGAAACGGAGA CGGCAATCATCTTATCTTTC TAACTATGATGAAGAGTT AGCCAATGTGAAGGATGAACA GGAGGGAAAGGAAAGAGAGA CAGATTAGAAGAAAAAGAGG CTGTCTGCTATTCTCCACTTGG CCAATAATGTAATCGTCTTGG TAAAACACTCTCGTGACTCC CCCCAAGATTCGTATTAATC CCCACAAGAGAGAGAGAGAG TCTACTTCCATGAATCCATC CCACCAACATAACACACAAC CCACATTTGATGGAAATCTT CTTTTCTCTTCTTCTATTCTC GGAGACACAAGGAATATGTG AAGATCGCCTCTATCACAG TTAGGTGTATTTGATCTC CTCCGATCAATTTTACATCT TCTCTTACAACTCTTTGTCG GGAAGGAAATTAGCATGCAC TCAATTTTTGCCAAACAAGC ATCCAACTCGACCAAGAAAC TGGGTTTTCTTCTACTACTG CTTCACTAAAACTACAAGAG ATATTGATTGCTGGGAAAGG GAGAGAGAGAGAGAGATG GAGAGAGAGAGAGAGATCTAAAC CGAATCTCCGGAACAGACAC AATATCAACTTGTTCGATATCTTT TTCCCCTAGTCGCTCTCT ATATGATCTTCCATTTCCA ATGTCCCTAACTGCCAAACATA ACTCCATTGTTGCTAACCTTT ACCACAAATAATAATTCAACA AAGGTCAGCAAAGCGGCATAGG GCGCGTCCCTTTTTACCA AGCAATTGATTGAGGCGGTTCT TGTCCCACCCAACATTTCATT ACAAAACAACGAAACCCATAGC CATCCTCAAAAAAAGGCTAAG ACTGTTTATCCCGACTTCACTA GAAGACGGCAAATTGAGCT AAAGAAGGAAGAGGCTGAGA AGAATAAGGTCCACATAAGG CTTTCCTTTATTATGCCTACG AAAAATGCAATGAACTGAGCGC ACTCCGTCAAGATCCCAAAA AGGTTTTTCAATGGAGGGGA TTCATCTTGACACGTAAGAG CTTCCTTTTTTTCACACCCT GTTGCATAATGCTAATTTGG GATTCGTTATCTCGACCAAC GAAAGAATGGGGGAAAAGAG GCTTTTTGAATTTGTGCAGGG CGATCTTCTTTATTCTTCGCC AAGATTGAAGTGGGAAAATG TGCCAAACTATAATCACACTA TGCAATTAGCCTCTTCTCTA GGCAAGAAGATGGCAAAGAT AGCAGACAGCATATAAAGCT TGTATGCCACGTAGCGAAAC GTTCCAAACTTTCTACCAATCA GATCTGAGGTTGAAGCAAAG TGGTAGTAGAGATGATATAC GTGTGACAGGTAGATTGTTGG TAGAATGGTTAGGAAACCCT CTCTCACACTGTTGGGAAGA CATTTTATAGCTTATCTTCCG ATCCAAAAGGAATCGGAAAG ATAACAAAGGGGCATAACAC ATTTGTACTCCCAACGCATC AATTTTATGGCTCAAGGTTC GAATAAACTTGGTGTCCAAC GGTTCAAGGATTCATCGTTG GCCACTCTGTCTTTCTTCC CAAGGACACAGATTTAATAC CAGCTCTACAACAACATCTC TGCTTTTACTCTCATTCAAC TTCCAACTTATTCATCCCAC CTTTTTTGGCTTTATTGGGTC GGTTGGGTACTCCGAGTTA GTCATGTCCGGTTATCTTGT CCGTCTACAAGCGTGACTGTC 496 第 3 期 李菊芬等:应用 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度 滋 L, DNA 聚合酶 (2.5U/滋 L)0.4滋 L, 正反向引物 (10 滋 mol/L)各 0.5滋 L, 模板约 100 ng, 无菌三蒸水补 齐。反应程序: 预变性 94 , 3 min, 94 变性 30 s, 退火 4756 , 30 s, 72 延伸 1 min, 35 个循环, 72 终延伸 5 min。PCR 仪为 TC/H (北京博日科技有 限公司生产) 。扩增产物经 6.0%非变性聚丙烯酰胺 凝胶(Sambrook , 1995)电泳,电压 75 V, 90 min。采用 Glodview 染液 (取 5 mL Glodview, 用 1伊 TBE 稀释到 100 mL) 染色 10 min 后, 于紫外检测仪 下观察并拍照。 2 结果与分析 2.1 甜瓜杂交种及其亲本的 SSR 多态性分析 从 属的 79对 SSR 引物(编号 MS1 79) 中, 筛选出 12 对带型稳定并在东方蜜 1 号及其 亲本间具有多态性的特异引物, 分别为 MS3 、 MS4、 MS6、MS10、MS14、MS15、MS16、MS42、 MS43、 MS45、MS48 和 MS60。从 37 对 SSR 引物中 (编号 MS137)筛选出 3 对在东方蜜 2 号及其亲本间具 有多态性的特异引物, 分别是 MS3 、 MS4 和 MS20。 根据电泳图谱呈现的多态性,这些引物均能把杂交 品种与母本自交系种子区分开,其多态性图谱可以 分为 3 类: 双亲互补型 (图 1,A) , 偏父型 (图 1,B) 和 其它型(图 1,C) 。在东方蜜 1 号筛选得到的特异 SSR 引物中, MS6、 MS15 和 MS16 的图谱呈现其它 型 ,MS3、MS4、MS10、MS14、MS42、MS43、 MS45、MS48 和 MS60 均呈双亲互补型图谱。在东 方蜜 2 号的特异 SSR 图谱中, MS20 呈偏父型, 而 MS3 和 MS4均呈双亲互补型。 2.2 甜瓜杂交种纯度的鉴定 用双亲互补型引物 MS10 对东方蜜 1 号两批杂 交种 (每批各取样 100 株) 进行了 SSR 多态性鉴定, 结果显示 (图 2, A) , 两批杂交种的纯度分别是 96% 和 95%。 用双亲互补型引物 MS4 对这两批东方蜜 1 号杂交种再次进行鉴定,结果与 MS10 鉴定结果相 同 (图 2, B) 。而田间形态学鉴定 (各取样 150 株) 的 结果分别为 97.3%和 96%,这一结果与实验室 SSR 标记鉴定结果相比, 符合率达 98%以上。 用双亲互补型引物 MS4 对东方蜜 2 号杂交种 (取样 100 株) 进行了 SSR 多态性鉴定 (图 3) , 结果 显示其纯度为 100%, 田间形态鉴定 (取样 150 株) 结果也为 100%,表明田间检验与室内 SSR 标记快 速检验的结果一致。 2.3 甜瓜杂交种及其同母异父杂交组合的 SSR 分 析 图 1. MS4(A)、 MS20(B)和 MS16(C)引物的 SSR图谱类型 Fig.1. SSR profile amplified by MS4(A)、 MS20(B) and MS16(C) primers A.双亲互补型 (东方蜜 1号) B.偏父型 (东方蜜 2号) C.其它型 (东方蜜1号) 。1,母本 2,父本 3, 杂种F 1 。 A. F 1 hybrid shows complementary pattern of both parents (Dongfangmi 1) B. F 1 hybrid shows malespecific pattern(Dongfangmi 2) C. F 1 hybrid shows different band pattern with their parents (Dongfangmi 1). 1, female line 2, male line 3, F 1 hybrid. 图 3. 引物MS4对甜瓜杂交种东方蜜 2号的SSR检测图谱 Fig.3. SSR profile of the melon hybrids Dongfangmi 2 amplified by MS4 primer 1, 母本;2, 父本;315, 杂交种。 1,female line 2,male line 315,hybrid samples. 图 2. 引物 MS10 (A) 和MS4 (B) 对甜瓜杂交种东方蜜 1号的 SSR检测图谱 Fig.2. SSR profile of the melon hybrids Dongfangmi 1 amplified by MS10 (A) and MS4 (B) primers 1, 母本; 2, 父本; 315, 杂交种样本, 其中 5号 (A) 和14号 (B) 样本 为混杂的母本自交系种子。 1,female line 2, male line 315, hybrid samples, 5 (A) and 14 (B) represent female parent inbred lines. 497 农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年 图 5. 引物 MS4 (A) 、 MS20 (B) 和MS4+MS20 (C) 对东方蜜 2号与其同母异父的 7个组合的 SSR图谱 Fig.5. SSR profile of Dongfangmi 2 and its seven uterine hybrid lines amplified by MS4 (A), MS20 (B) and MS4+MS20 (C) primers M, marker; a、 b, 东方蜜 2号的母、 父本;D2, 东方蜜 2号; 17, 与东方蜜2号同母异父的组合。 M, marker a and b, Dongfangmi 2 female and male line D2,Dongfangmi 2;17, seven uterine hybrid lines of Dongfangmi 2. 表 2 东方蜜 1 号与其同母异父的 7 个不同组合的 SSR 带型分析 Table 2 SSR pattern analysis of Dongfangmi 1 and its seven uterine hybrid lines 组合 引物Primers HybridMS3MS14MS15MS6MS4MS10MS16MS42MS43MS45MS48MS60 1 2 3 4 5 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 用筛选出的 12 对特异性 SSR 引物分别对东方 蜜 1 号及其同母异父的 7 个不同组合进行 SSR 分 析。从表 2 中可以看出, 在 12 对 SSR 引物中, 没有 一对引物能够把东方蜜 1 号与其同母异父的 7 个不 同组合都区分开,只能与 7 个组合中的某些组合区 分开,而引物 MS43 则不能把东方蜜 1 号与 7 个组 合中的任意一个组合区分开。组合 3 和东方蜜 1 号 母本相同, 父本又是姊妹系, 两者亲缘关系极近, 12 对特异引物中唯有引物 MS60 能够把它们两者区分 开 (图 4,B) , 除组合 3 外, MS60 还能区分组合 2、 5、 6和 7。 引物 MS48 则能够把组合 1、 2、 4、 5和 6 与东 方蜜 1 号区分开 (图 4,A) , 从图 4A、 4B 中还可以发 现, 引物 MS48 和 MS60 的 SSR 扩增条带处于不同 位置, 尽管二者单独扩增时的退火温度不同, 但是将 2 对引物组合,以二者中较低的退火温度进行 SSR 扩增后可以看出 (图 4,C) , 东方蜜 1 号能够与其亲 本及同母异父的 7个杂交组合同时区分开。 用筛选出的 3 对特异性 SSR 引物分别对东方 蜜 2 号及与其同母异父的 7 个不同组合进行 SSR 分析。结果表明: 引物 MS4 能把东方蜜 2 号与组合 3、 4、 5、 6 和 7 区分开(图 5,A), 引物 MS20 则能把东 方蜜 2 号与组合 1、 2、 6 和 7 区分开 (图 5, B) , 应用 MS4 和 MS20 的引物组合则能够把东方蜜 2 号与 其亲本及同母异父的 7 个不同组合同时区分开(图 +, 与东方蜜1号带型不同; , 与东方蜜 1号带型相同。 +, different with the bands of Dongfangmi 1 , the same as the bands of Dongfangmi 1. 图 4.引物 MS48 (A) 、 MS60 (B) 和MS48+MS60 (C) 对东方蜜1号与其同母异父的 7个组合的 SSR图谱 Fig.4. SSR profile of Dongfangmi 1 and its seven uterine hybrid lines amplified by MS48 (A), MS60 (B) and MS48+MS60 (C) primers M, marker; a、 b, 东方蜜1号的母、 父本; D1, 东方蜜 1号; 17, 与东方蜜1号同母异父的组合。 M, marker a and b, Dongfangmi 1 female and male line D1, Dongfangmi 1 17, seven uterine hybrid lines of Dongfangmi 1. 498 第 3 期 李菊芬等:应用 SSR分子标记鉴定甜瓜杂交种纯度 5, C) 。 3 讨论 杂交种子的纯度鉴定是农作物种子质量检验的 一项重要内容。由于 SSR (simple sequence repeats) 标记具有多态性高、 操作简便、 稳定可靠等优点, 已 被应用于大豆 (关荣霞等, 2003; Meesang 2001) 、玉米(Wu , 2006) 、水稻(辛业芸等, 2005; Yashitola 2002)等重要农作物的种子纯 度鉴定。在其它作物上也有一些相关研究, Katsumi 针对日本草莓栽培品种 )开发出 4对 SSR 引物, 其中 2 对可区分 10 个日本主要的草 莓栽培品种 (Katsumi , 2006) ; Daniel (2004)在 一个 PCR 反应中利用 7 个 SSR 引物同时进行扩 增, 得到 18 种加拿大硬质小麦的特异图谱, 可用于 纯度鉴定及品种识别; Tommasini . (2003)利用 3 组 SSR 引物组合能够有效地把 10 个油菜品种区 分开。在甜瓜作物上, 国外研究者多利用 SSR 标记 进行不同甜瓜品种间的多样性分析及遗传图谱的建 立 (Staub ., 2000 LopezSese , 2002 DaninPoleg ., 2000) , 而用于甜瓜杂交种纯度鉴 定的研究报道至今尚未见到,国内在这方面虽已有 研究, 但均是利用单对 SSR 特异引物对杂交种纯度 进行鉴定 (艾呈祥等, 2005; 柳剑丽等, 2006) , 该方法 只能把 F 1 与其中混杂的母本种子区分开, 即能够有 效地检测出杂交种中混入的母本自交系种子,但均 未涉及其它不明来源甜瓜花粉造成的杂交种混杂及 人为掺假等种子质量鉴定问题。 本实验在利用单对 SSR 特异引物进行杂交种 纯度鉴定的基础上,又利用筛出的特异 SSR 引物, 对杂交种与其同母异父的 7 个杂交组合进行了分 析, 结果显示, 东方蜜 1 号和东方蜜 2 号利用筛出的 单对 SSR 引物只能与其各自同母异父 7 个杂交组 合中的某些组合区分开, 没有一对 SSR 引物能够把 杂交品种与 7 个不同组合都区分开。 由此不难看出, 利用单对 SSR 引物鉴定甜瓜杂交种纯度时, 对待测 杂交种中可能存在的其它不明来源甜瓜花粉造成的 杂交种混杂情况, 无法进行有效的检测, 从而导致鉴 定结果出现偏差。 在大田人工杂交制种条件下, 由于 隔离不严等原因造成蜜蜂等昆虫所带来的不明来源 的甜瓜花粉所导致的生物性混杂是不可避免的, 这 样在生产中利用单对 SSR 引物鉴定甜瓜杂交种纯 度就具有一定的局限性。 本实验利用特异 SSR 引物 组合 MS48+MS60,可成功地将东方蜜 1 号与其亲 本及同母异父的 7 个杂交组合完全区分开;利用 SSR 引物组合 MS4+MS20 能够将东方蜜 2 号与其 亲本及同母异父的 7 个杂交组合完全区分开。利用 SSR 引物组合的方法进行甜瓜杂交种纯度鉴定, 不 仅能够有效地检测出其中混杂的母本自交系种子, 还能很大程度的检测出其它来源花粉所导致的生物 性混杂, 提高了检测的准确度, 为甜瓜杂交种纯度鉴 定提供了较为科学的新方法。 参 考 文 献 Ai C X(艾呈祥), Lu L(陆 璐), Ma G B(马国斌) and Liu Z X (刘志昕). 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Purity identification of soy bean varieties with SSR technique(J). (分子植物育种), 2003,1(3): 357360 (in Chinese with English abstract) Jarret R L, Merrick L C, Holms T, Evans J and Aradhya M K. Simple sequence repeats in watermelon( (Thunb.) Matsum.& Nakai) (J). , 1997, 40: 436 Katsumi S and Keita H. Development and characterization of 499 农 业 生 物 技 术 学 报 2008 年 simple sequence repeats (SSR) as markers to identify straw berry cultivars ( Duch.) (J). , 2006, 75(5): 399402 Katzir N, DaninPoleg Y, Tzuri G, Karchi Z, Lavi U and Cregan P B. Length polymorphism and homologies of microsatellites in several cucurbitaceae species (J). , 1996, 93: 12821290 Liu F Z(刘富中), Liu W B(刘万勃), Song M(宋明) and Wang H S (王怀松). Study on the hybrid genetic purity determination in melon ( L.) by using RAPD (J). (中国蔬菜), 2002 (5): 79 (in Chinese with English abstract) Liu J L (柳剑丽), Zhou S C (周寿春), Song X H (宋晓华) and Wang J S (王建设). Purity test of melon hybrid with SSR molecular markers (J). 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