微生物法高产辅酶Q10的研究进展.pdf

综述与专论 生物技术通报 B l o T E c H N o L o G YB U L L E T I N 2 0 0 9 年第2 期 微生物法高产辅酶Q 。o 的研究进展 李焱生方建军钟卫鸿 ( 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州3 1 0 0 3 2 ) 摘要：辅酶Q ，。是呼吸链上的一种电子传递体，具有抗氧化功能。微生物法生产辅酶Q ，。具有产物活性高、原料 成本低并可以通过规模放大提高生产能力等优点。综述了微生物法生产辅酶q 。的生产茵种，以及能够提高辅酶Q 。产 量的各种不同的方法策略。 关键词：抗氧化辅酶Q 。电子传递体发酵呼吸链 A d v a n c ei nH i g h p r o d u c t i o no fC o e n z y m eQ 1 0 b yM i c r o o r g a n i s m s L iY a n s h e n g F a n gJ i a n j u nZ h o n gW e i h o n g ( C o e g eo f 历。地咖缸刎E n v i r o n m e n t a lE n g i n e e r i n g ，Z h e j i a n gU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y ，H a n g z h o u3 1 0 0 3 2 ) A b s t r a c t ： C o e n z y m eQ l o ( C o Q l o ) a sa ne l e c t r o na R T i e ri nt h er e s p i r a t i o nc h 血- iw i d la n t i o x i d a n ta c t i v i t y ，h a s e x t e n d e dt Ow i d ea p p h c a t i o mi nt h ef i e l d ss u c h 笛m e d i c i n e ，c o s m e t i ca n dh e a l t hp r o d u c t s T h ep r o d u c t i o no fC o e n z y m e Q 1 0b ym i c r o b i a lf e r m e n t a t i o nf e a t a r e sI l i j g I la c t i v i t ya n dl o wC O S t T h ey i e l do fC o Q ，oc a nb ei n c r e a s e db yf e r m e n t a t i o n s c a l e - u p T b A sp a p e rr e v i e w e d S e V e r a lk i n d so fm i c r o o r g a n i s m st h a th a v e b e e nu s e dt O p r o d u c eC o e n z y m eQ 1 0a n d v a r i o u ss 订a t e 百e st Oi m p r o v et h eC o Q l op r o d u c t i o ni nm i c r o b e s K e yw o r d s ： A n t i o x i d a n tC o e n z y m eQ 1 0E l e c t r o nc a n l e rF e r m e n t a t i o n R e s p i r a t i o nc h a m 辅酶Q 是一种天然存在的脂溶性醌类化合 物，主要存在于原核生物细胞质膜和真核生物线粒 体内膜中。结构上是由苯环和长度不同的类异戊二 烯侧链两部分构成。由于不同生物中聚异戊二烯焦 磷酸合成酶的编码不同。使得不同的生物体产生的 辅酶Q 种类各不相同，如酿酒酵母、大肠杆菌、弱 氧化葡糖杆菌中主要分别为聚六。八。十异戊二烯 焦磷酸合成酶编码基因分别为i s p B ，c o q l 和d d s A ，产物分别为C o Q 。，C o Q 。和C o Q 。0 【I J 。其中C o O 。有 着许多重要的生理功能。C o Q 。可以作为细胞呼吸 链的一部分参与细胞的能量代谢I ：1 ；作为一种重要 的抗氧化剂保护细胞膜中的磷脂和血清中低密度 脂蛋白免遭脂质过氧化损伤。最近有研究表明 C o Q 。还可以保护线粒体膜蛋白以及D N A 免受自 由基的氧化损伤例；另外，C o Q m 还可以参与基因的 表达调控【4 1 。这些重要的生理功能使得C o Q 。颇受 国内学者的关注，同时也使得C o Q 。的市场需求不 段增加，所以提高C o Q 。的产量显得尤为重要。 目前生产C o Q 。有3 种方法：动植物组织提取 法、微生物发酵法和化学合成法。目前国内主要采 取动植物组织提取法。国外多采用微生物发酵法 生产C o Q 舯微生物法生产C o Q ，。具有经济、不受原 料的限制、易大规模生产、分离纯化、产品活性好 等特点，因此颇受研究者的青睐。但是由于受菌 种、发酵工艺以及下游提取的工艺的限制，微生物 法生产得到的C o Q 帕的产量不高，目前还无法满足 工业化生产的要求。通过诱变育种、构建工程菌、 优化发酵工艺、优化提取纯化工艺等策略，能最大 限度地提高C o Q m 的产量，有望实现C o Q 的工业 化生产。 收稿日期：2 0 0 8 - 0 7 2 3 基金项目：浙江省生物化工重中之重学科开放基金 作者简介：李焱生( 1 9 8 6 一) ，男，江两九江人，硕士研究生，专业方向：应用微生物学与基因工程；E m a i l ：l i h u i y a 0 1 9 8 6 1 6 3 咖 通讯作者：钟卫鸿，T e l ：0 5 7 1 8 8 3 2 0 6 5 8 ，E m a i l ：w h z h o n g z j u t e d u c n 万方数据 6 0 生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n2 0 0 9 年第2 期 l C o Q ，。的生产菌种 能够产C o Q m 的微生物种类较多，真核和原核 微生物都能够作为C o Q 。的生产菌种。所涉及的微 生物超过3 4 个属，包括假单胞菌属( P s e u d om o n a $ 傩r 撕删口) 、土壤杆菌属( A g r o b a c t e r i u ms p ) 、氧化 葡糖杆菌属( G l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ) 、英膜红细菌属 ( R c a p s u l a t u s ) 、浑球红细菌属( R s p h a e r o i d e s ) 、脱氮 副球菌属( P a r a c o c l 2 3d e n i t n f w a n s ) 、热带假丝酵母属 ( C a n d i d at r o p i c a l i s ) 和脱氮假单孢菌属( P a r a c o c c u s d e n i t r i f i c a 珊) 等。这些菌种都可以直接从自然界中 筛选得到，但不同菌种的C o Q m 产量相差较大。 Y o s h i d a 等1 5 1 通过摇床培养试验鉴定了3 4 株细菌菌 株产C o Q 。的情况，其中2 9 株可以产C o Q m ，并且 A t u m e f a c i e n sK Y 一3 0 8 5 A r a d i o b a c t e rK Y 一3 0 8 6 和 R s p h a e r o i d e sK Y 4 11 3 所产的C o Q I o 超过6 0m g L 。 2 提高C o Q ，。产量的基本方法 影响C o Q 。产量的因素较多，一般从自然界中 筛选到的野生型菌种产量都比较低不能满足生产 的需要。通常可以利用各种手段对原始菌株进行遗 传改造，突破微生物自身的代谢调控机制，从而提 高微生物的产量。例如通过选育具有结构类似物抗 性、营养缺陷型突变株或将某些关键酶基因进行克 隆，构建目的工程菌株。再通过进一步优化生产菌 种的发酵工艺从而极大地提高原始菌种C o Q 。的产 量。 2 1 传统诱变育种 使用诱变手段对野生型菌株进行基因突变，再 通过适当的筛选方法。得到产量显著提高或者发酵 特性显著改善的突变株如营养缺陷型或抗结构类 似物突变株等。 Y o s h i d a t 5 1 发现与R s p h a e r o i d e sK Y 4 11 3 相比 用A t u m e f a c i e n sK Y 一3 0 8 5 作为C o Q l 0 的生产菌株 有很多不足如菌落光滑不易收集菌体发酵液的 黏度大，C o Q 。产量低。以N T G 为诱变剂，A t u 附f a c i e n sK Y 3 Q 8 5 为出发菌株。筛选到了一株菌落粗糙 的突变株A t u m e f a c i e n sA 9 ，且该突变株的培养液 黏度得到显著改善。再以A t u m e f a c i e n sA 9 为出发 菌株经过诱变。用乙硫氨基酪酸、道诺霉素、维生素 K 3 以及X g a J 作为筛选压力筛选到了一系列结构 类似物抗性突变株A t u m e f a c i e n sM 3 7 ，O 一1 3 ，A J 2 4 ，A P 3 7 和A U 一5 5 ，C o Q l 0 的产量较原始菌株A 。 t u m e f a c i e n sK Y - 3 0 8 5 均有提高。 戚薇等【6 1 以土壤杆菌( Ag r o b a c t e r i u ms p ) T L Y 2 4 为出发菌株，采用7 0 致死剂量的N T G 进行诱变 处理，筛选抗C o Q 。结构类似物维生素K 3 突 变株，定向选育到了2 株C o Q 。高产突变株土壤杆 菌R 2 1 2 2 和R 2 0 1 5 。其摇瓶发酵7 2h ，C o Q 。产量分 别为5 7 3m gL J 和5 9 9m gL ，较出发菌株提高 了3 5 7 和4 1 6 。 潘春梅等f 7 1 以放射型根瘤菌( R h i z o b i u mr a d i o b a c t e r ) W S H 2 6 0 为出发菌株。选择U V 射线和亚硝基 胍作为诱变剂，在筛选获得放线菌素D 抗性突变 株的基础上，进一步诱变处理。分别获得了放线菌 素D 和L 一乙基硫氨酸双抗性突变株、放线菌素D 和维生素K 3 双抗性突变株，以及抗放线菌素D 和 X g a l 利用能力提高的突变株。与出发菌株相比，突 变株C o Q 。的产量提高幅度达2 5 一3 7 。其中一株 放线菌素D 和L 乙基硫氨酸双抗性突变株W S H 2 E 2 5 ，胞内C o Q ，。含量和C o Q 。o 总产量分别达到2 8 6 m g ( D C W ) 9 1 和4 0 m gL _ 1 ，均比出发菌株提高了3 7 。 此外，芳香族氨基酸的结构类似物以及呼吸抑 制剂也可以作为选择压力从突变库中筛选出C o Q m 产量提高的正突变株I s I 。C h o i 等【8 】考察了溶氧水平、 叠氮化物、二硝基酚以及过氧化氢对A t u m e f a c i e n s A T C C 4 4 5 2 胞内C o Q 。o 含量的影响。试验发现当限 制溶氧水平或者添加电子流抑制剂时均能提高胞 内C o Q l o 含量。 2 2 代谢工程育种 代谢工程即利用重组D N A 技术通过改变细胞 内有关的酶活、酶量和输送体系、调节功能改变细 胞的遗传特性以改进微生物某些代谢活性最大限 度地提高目的产物产率的一门技术I 引。代谢工程研 究通常包括两部分：一部分是对细胞体系进行系统 分析。主要表现为对细胞代谢流代谢网络及代谢 控制分析；另一部分是根据分析结果对目的菌株进 行遗传改造，改变代谢流向，开辟新的代谢途径，构 建可用于工业生产的优良菌株 1 0 1 。 代谢流量分析( M e t a b o l i cF l 【A n a l y s i s ，M F A ) 是 通过对生物体内代谢流的分布及其变化规律的了 解，在一定的培养条件下计算流经各种代谢途径的 万方数据 2 0 0 9 年第2 期 李焱生等：微生物法高产辅酶Q 。o 的研究进展6 1 相关代谢物质流量的技术【1 1 1 。吴祖芳等 t 2 】分析了放 射型根瘤菌( R r a d i o b a c t e r ) W S H 2 6 0 1 生物合成辅 酶Q 。的代谢途径网络并在溶氧条件改变，向培 养基中添加玉米浆条件下对C o Q m 发酵细胞内代谢 途径流量变化作定量的分析。结果表明C o Q 。的生 物合成更大程度地取决于C o Q 。生物合成途径中催 化D P P 的合成和4 羟基苯甲酸( P H B ) 与D P P 的缩 合反应的两种关键酶的活性。 C o Q m 的生物合成途径中有两个很重要的关键 酶：4 羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶和聚 十戊二烯焦磷酸合成酶。这两种酶在不同的微生物 中由不同的基因编码。 4 羟基苯甲酸一聚异戊二烯焦磷酸转移酶催化 P H B 与P P P 的缩合反应，这是辅酶Q 生物合成途 径中的限速步骤。该酶对P P P 的专一性不强，在大 肠杆菌中由u b iA 编码。将u b iA 基因置于光合细 菌启动子的控制之下可以实现在光合细菌中的大 量表达。由于曲iA 基因表达产物取代或增强了光 合细菌内源性的4 羟苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转 移酶的活性，使重组光合细菌合成C o Q 帕的能力大 幅度提升【玎J 。 聚十戊二烯焦磷酸合成酶催化F P P 与若干 I P P 缩合成一定链长的P P P ，并控制着聚异戊二烯 侧链的长度。因此决定了辅酶Q 的种类。J u n g K u l L e e 等【1 4 l 将从A t u m e f a c i e n s 中分离到的编码聚十 戊二烯焦磷酸合成酶的基因d p s 克隆到大肠杆菌 中，发现含有出p 基因的E c o l i 除了产辅酶Q 8 以外 还产生了C o Q 帕，当d s p 基因发生突变后重组E c o l i 丧失了合成C o Q l o 的能力。T a k a h a s h i 等1 1 5 1 将来自P d e n t r f i c a n s 的聚十戊二烯焦磷酸合成酶克隆到E c o l i 中，重组E c o l i 不仅能够合成C o Q l 0 ，而且C o Q l o 的合成水平大于C o Q 。 另外，将C o Q 。合成途径中的多个酶基因同时 克隆到受体细胞中，可以强化C o Q 。生物合成的代 谢流，使得受体细胞合成C o Q 。的能力得到增强。 Z h a n g 等【怕】将来自A t u m e f a c i e n s 的咖s 基因分别与 来自酿酒酵母的c o q 2 ，来自S p o m b e 的p p t l 基因 以及来自E c o l i 的曲认、如i C 基因组成由单一启 动子控制的重组质粒，转化到A t u m e f a c i e n s 中，得 到含有4 种重组质粒的转化子( p B I V d p s ，p B I V d p s q ，p B I V d p s p 以及p B I V d p s c a ) 。试验发现含有 p B I V d p s c a 的重组A t u m e f a c i e n sC o Q l o 的产量较其 他重组子和非重组子都要高。在微氧补料分批发酵 时，含有p B I V d p s c a 的重组A t u m e f a c i e n sC o Q l o 含 量达到了3 0 8m gL ，较非重组A t u m e f a c i e n sC o Q l o 的产量和产率分别提高了8 8 9 和7 7 7 。 Z a h i r i 等1 1 7 1 将A t u m 皇f a c i e n s 的d d s A 基因引入 E c o l i 中，得到的重组Ec o l i 在初始p H 为7 0 的 2 Y T G 培养基上培养，C o Q o 的产量可以达到4 7 0m g ( D C W ) g 。在此基础上。再通过代谢工程的手段将 外源的M V A 途径引入大肠杆菌中使得C o Q ，。的产 量迸一步提高到l7 0 6 8 6m g ( D C W ) g 一。 Z h u 等【1 8 1 将参与辅酶Q 生物合成的各种酶基 因( u b i A C ，u b i B ，u b i G ，u b 珊和函p B ) 引人大肠杆菌， 使得重组大肠杆菌中辅酶Q 的产量是野生型细胞 的3 倍。 2 3 发酵条件的优化 生产菌种只有在最优的发酵工艺条件才发挥 其高产的潜能因此对生产菌种的发酵工艺的优化 也是实现高产的一条重要的手段。发酵工艺的优化 主要包括对产C o Q 。o 发酵培养基、培养条件以及培 养模式的优化三个方面。 H a 等【1 9 】对A t u m e f a c i e n sK C C M1 0 4 1 3 产辅酶 Q 。的培养条件进行的优化，发现在诸多影响因素 中，p H 和溶解氧是影响辅酶Q 。产量最关键的因 素。 W u 等f 加1 发现溶解氧的浓度对R r a d i o b a c t e rW S H 2 6 0 1 有较大的影响，只有当溶解氧的浓度适度 时( 4 0 ) 能够获得较高的C o Q m 含量和浓度，分别 能达到1 9 lm g ( D C W ) g 一和3 2 1m gL 。并在此基 础上采用了一种新的溶解氧控制的补料策略。从而 提高了R r a d i o b a c t e rW S H 2 6 0 l 的生长速度和C o Q l o 的产量。 H a 等【2 1 1 发现蔗糖的浓度对A t u m e f a c i e n sK C C M1 0 4 1 3 产辅酶Q 。有影响。在连续补料分批培养 过程中，当蔗糖的浓度从1 0gL 。1 增加到4 0gL - 时，细胞干重、辅酶Q 。的产率以及产量都会增加。 当使用恒定p H 控制的补料分批发酵模式时有利 于碳源浓度和渗透压保持在最低水平，使得C o Q m 的比产率，产量以及产率均有较大的提高，而且恒 万方数据 6 2生物技术通报B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n 2 0 0 9 年第2 期 定p H 控制的补料分批发酵模式易于放大。 P a r k 等l 笠】比较了含有来自G s u b o x y d a n s 聚十 戊二烯焦磷酸合成酶基因的重组大肠杆菌在分批 以及补料分批培养两种培养模式下产C o Q 。的情 况。试验结果表明重组大肠杆菌在补料分批培养时 能够获得较高的细胞密度。C o Q m 的产量较分批培 养要高。 辅酶Q ，。生物合成过程中需要很多前体物质， 比如供给侧链合成的前体茄尼醇以及供给醌环合 成的前体羟基苯甲酸和C o Q 。人为地在发酵培养 基中添加这些前体物也可以提高C o Q 。的产量。刘 萍等【1 通过研究发现向培养中添加茄尼醇、羟基苯 甲酸以及C o Q 。，C o Q ，。的产量均有提高，单独添加茄 尼醇，粟酒裂殖酵母的C o Q ，。能达到最大产量为 3 3 1m gL I ，比对照样品增加了9 1 。任何两种前 体物质共同添加都要比单独添加茄尼醇时产量低 茄尼醇和C o Q 。共同添加时，单位细胞胞外C o Q ，。的 产量达到最高( 1 3 5m gg - 1 ) ，比对照样品增加了 1 1 7 。 3 结论与展望 尽管通过诱变的方法获得了一系列产量提高 的突变株。但是这种方法缺乏定向性，需要设计合 适的筛子以提高筛选效率。突变株体内遗传物质结 构的改变往往使得突变株的生长受到影响。另外 能够在选择性培养基上生长的突变株不一定就是 正突变株所以需要采用高通量筛选策略来快速高 效地从突变库中筛选出产量显著提高的正突变株。 与诱变不同的是代谢工程可以对特定的生化 途径进行定向的遗传修饰。由于大肠杆菌遗传背景 的较为清楚，遗传修饰较容易以及易于大规模发酵 生产等原因，使得利用代谢工程手段对辅酶Q ，。生 物合成途径进行遗传修饰和改造的研究主要集中 在大肠杆菌中。但是E c o l i 代谢工程菌的C o Q ，。产 量有限，还不能满足工业化生产的要求。在构建工 程菌时，有许多重要的问题有待于解决，比如重组 大肠杆菌中C o Q 。的产量是否只受代谢流量的严格 限制。或是还有其他目前没有发现的生理因素的限 制。这就需要对C o Q 。生物合成的代谢调控机制和 代谢瓶颈做全面系统地研究。 最后，对C o Q 。o 下游提取、纯化工艺及其分析检 测技术进行研究，可能寻找新的最优纯化工序和高 灵敏度的检测手段，进一步提高辅酶Q 。o 产量。 参考文献 1 M e g a n a t h a nR F E M SM i c r o b i o l o g yL e t t e r s 。2 0 0 1 ，2 0 3 ：1 3 1 - 1 3 9 2M a k o t o ，K a w a m u k a i J o u r n a lo fB i o s c i e n e ea n dB i o e n g i n e e r i n g ， 2 0 0 2 ，9 4 ( 6 ) ：5 1 l 一5 1 7 3 E m s t e rL D a l l n e rG B i o c h i m i e ae tB i o p h y s i c aA c t a ，1 9 9 5 ，1 2 7 1 ： 1 9 5 2 0 4 4G r o n e b e r gD A e ta 1 1 1 h eI n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo fB i o c h e m i s t r y C e l lB i o l o g y ，2 0 0 5 ，3 7 ：1 2 0 8 - 1 2 1 8 5H a j i m eY o s h i d a JG e nA p p lM i e m b i o l ，1 9 9 8 ，4 4 ：1 9 - 2 6 6 戚薇，李静，等E _ q k 微生物，2 0 0 7 ，3 7 ( 6 ) ：1 2 1 5 7 潘春梅，李寅，堵国成，陈坚应用与环境生物学报，2 0 0 5 ，1 1 ( 3 ) ：3 6 3 3 6 7 8C h o iG S e la 1 P r o c e s sB i o c h e m i s t r y 2 0 0 5 ，4 0 ：3 2 2 5 3 2 2 9 9B a i l e yJ E S c i e n e e ，1 9 9 1 。2 5 2 ( 5 0 1 9 ) ：1 6 6 8 1 6 8 1 1 0 Y a n gS T 。“uX G 。Z h a n gY L B i o p r o c e s s i n gf o rV a l u e a d d e dP r o d u e t sf r o mR e n e w o b l eR e s o u r c e s ：N e wT e c h n o l o g i e sa n dA p p l i c a t i o n s E l s e v i e r ，2 0 0 6 ，7 3 1 1 8 1 1C o r m s s aS ，A o nM A ，I g l e s i a n sA A ，L l o y dD A nI n t r o d u e f i o nt oM e t a - b o h ea n dC e f i u l a rE n g i n e e r i n g S i n g a p o r e ：W o r l