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高产降胆固醇活性物质的红曲霉菌种选育研究 魏培莲1,周立平2,毛建卫1 (1. 浙江科技学院生物与化学工程系,杭州310012 ;2.浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州310014) 摘要:红曲霉出发菌株经紫外线(UV)、 硫酸二乙酯(DES)、 氯化锂(LiCl)等诱变剂反复诱变处理,获得供试红曲霉菌株10 株。用薄层层析法初筛得到可能产MonacolinK的菌株4株,再经高效液相色谱法对初筛菌株进一步进行检测,证实其中3株 具有较强的产MonacolinK能力,特别是诱变株M7的含量与出发菌株相比提高了41倍。 关键词:红曲霉;诱变育种;MonacolinK;薄层层析 中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:1006 - 8376 - (2002)03 - 0018 - 05 自从1979年日本国东京农工大学的Endo A 等1发现了红曲属(Monascus)的红色红曲霉(M. ruber)能够产生强力的降胆固醇物质Monacolin K之 后,国内外研究者纷纷掀起了降脂红曲霉的研究热 潮,发表了大量关于红曲霉的文章和专利。Monacol2 in K是某些红曲霉菌株在培养中产生的生理活性物 质,是胆固醇合成限制酶,故Monacolin K的存在能 显著降低人或动物的血脂浓度。其原理是HMG- CoA还原酶与Monacolin K的五碳酸部分结构相似, 因而具有竞争性抑制作用,从而降低胆固醇的合成。 目前,国内外已有几种基于降胆固醇红曲霉的药 物和保健食品上市,但在降胆固醇功能红曲霉的生产 中还普遍存在产量偏低的问题。究其原因,除了培养 工艺方面的不足之外,另一个很重要的原因就是缺少 优良的红曲霉生产菌株。本研究从这一目的出发,对 本课题组所保存的几株红曲霉菌株进行了反复的诱 变筛选,使原有菌株的Monacolin K产量大幅度提高, 并初步建立了Monacolin K的检测方法。 1 材料与方法 1. 1 材料 1. 1. 1 菌种 Monascus ruber MO(浙江工业大学红曲霉研究 课题组保存) 1. 1. 2 培养基,各种培养基主要成分的质量分数如 下: 收稿日期:2001 - 11 - 20 3 本课题得到浙江省科技计划项目基金资助。 作者简介:魏培莲(1976 - ) ,女,浙江科技学院教师,浙江大学博士研 究生,主要从事红曲霉的研究。 种子斜面培养基:麦芽汁1214BX,琼脂为1. 8 %2. 0 % ,pH5. 0。 平板培养基:麦芽汁琼脂培养基,麦芽汁12 14BX,琼脂1. 8 %2. 0 % ,pH5. 0。 液体种子培养基:大米粉3 %,MgSO47H2O 0.1 %, NaNO30.3 %,KH2PO40.15 %,pH5.66.0。 液体摇瓶培养基:大米粉12%,MgSO47H2O 0.1%, NaNO30.3%,KH2PO40.15%,pH5.66.0。 固体培养基:大米(杂交米或籼米 ) , 蛋白胨 4 % ,牛肉浸膏3 % ,黄豆粉3 % ,pH3. 54. 0。 以上培养基灭菌条件:121,0. 1 MPa ,30 min。 1. 2 方法 1. 2. 1 斜面菌种的活化 取冰箱保存的斜面菌种,接种麦汁试管斜面,置 32 温箱培养7 d ,备用。 1. 2. 2 斜面菌种的分离纯化 将活化的斜面菌种制备单孢子悬液,然后稀释 涂平皿,培养,待平皿上长出单个菌落,接种试管斜 面。如此反复若干次,直到提纯为止。 1. 2. 3 孢子悬液的制备 斜面菌株培养7 d ,用无菌水约10 mL (硫酸二 乙酯诱变用pH值为7. 0的磷酸缓冲液)洗下斜面红 曲霉孢子,倒入已灭菌装有2030颗直径为45 mm的玻璃珠的三角瓶中,振荡约5 min ,显微镜检 查,孢子分散即可。用脱脂棉过滤除去菌丝,制成孢 子悬浮液,稀释至浓度为105个/ ml ,冰箱保存备用。 1. 2. 4 孢子悬浮液计数法2 显微镜直接计数法:用血球计数板在显微镜下 直接计数。 平板稀释计数法:将孢子悬浮液分别稀释至不 同的浓度后倒平皿观察计数。 81 氨基酸和生物资源 Amino Acids B 苯、 甲醇、 氯 仿的体积比是216;C 正已烷、 丙酮的体积比是11;D 二氯甲 烷、 丙酮的体积比是41。 表4 Rf值的重现性 次数123456 溶剂前沿移动 距离/ cm 151515.215.11515.3 标准物质移动 距离/ cm 13.213.313.313.013.113.2 Rf值0.880 0.887 0.875 0.861 0.873 0.863 最大变异率1.6 % 注:Rf = 物质斑点移动的距离(浓度中心) 溶剂前沿移动距离 测Rf值时,使用同一批薄层,薄层厚度相同,展开剂液面恒定,温度 变化尽量小。 2. 2. 1. 4 薄层层析法初步定量结果 用薄层层析法进行定量可以选用薄层色谱扫描 仪,用数据处理机给出结果,这是在考虑包括斑点面 积和色度在内各种因素下给出的。因此在初步定量 Monacolin K时,可根据斑点面积和色度初步加以确 定。表5是2 mg/ mL标准样不同点样量下的结果。 表5 薄层层析法初步定量结果 点样量/ mL0.0050.0100.0150.0200.025 斑点面积最小小中大最大 颜色浅较浅较深深深 2. 2. 1. 5 固体发酵提取液层析结果 按材料和方法中薄层层析方法对各固体发酵提 取液进行层析,获得结果见表6 表6 固体发酵提取液层析结果 M0M1M3M7M8 Rf1-0.8670.8550.8810.873 Rf20.961-0.9780.9720.920 标准样0.9070.8670.8680.8810.867 斑点面积-较小小较大小 颜色-较浅极浅较深较浅 注:“-” 表示无相应斑点 测得的Rf值与某些文献中的数据相比差距较 大,可能跟层析板硅胶层较薄和展开剂易发挥有关。 由表6可初步确定Monacolin K含量大小。 2. 2. 2 高效液相色谱法检测 取5 mg Monacolin K,溶于50 mL甲醇中成浓度 为0. 1 g/L的溶液,以此作为标样。取5 g粉碎红曲 米,用30 mL甲醇浸泡提取12 h ,过滤,再用微膜过 滤,即得到进样分析样品溶液,按材料与方法中的色 谱条件进行进样分析,分析结果见表7。 表7 各菌株Monacolin K质量比 菌 株Monacolin K质量比/ (mg/ g) M00.050 M11.219 M30.435 M72.047 M81.638 表7表明4个诱变菌株Monacolin K的含量均有 不同程度提高,增幅最大为M7 ,是原出发菌株的41 倍。 3 小结 通过诱变筛选获得了一株高产Monaolin K红曲 霉菌株,并初步建立了Monacolin K的测定方法,薄 层层析法只能用于初步测定,用于精确测定还很不 完善,需要借助高压液相色谱法进行。另外,对于所 筛选得到的红曲霉菌株还有必要进行培养条件的优 化,因为培养条件不同对Monacolin K的产生量影响 很大。 致谢:浙江工业大学生物与环境工程学院97级毕业生做了大量 工作,特此致谢! 参考文献: 1 Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent pro2 duced by a Monascus speciesJ . J. Antibiotics , 1979 ,32 (8) :852854. 2 陈声明,刘丽丽.微生物学研究法M.北京:中国农 业科技出版,1996. 3 章名春.工业微生物诱变育种M.北京:科学出版 社,1984. 4 色谱分析M.北京:纺织工业出版社,1993. 12魏培莲,等.高产降胆固醇活性物质的红曲霉菌种选育研究 Breeding and Screening ofMonascusStrains Producing Blood2lipid2lowering Materials WEI Pei - lian1,ZHOU Li - ping2,MAO Jian - wei1 (1Department of Biology and Chemical Enginerring , Zhejiang University of Science and Technology , Hangzhou310012) (2Department of Biology and Environmental Enginerring , Zhejiang University of Technology , Hangzhou310014) Abstract : The original strain ofMonascuswas induced by UV radiation , DES and LiC1 and 10 strains were ob2 tained. 4 strains were found possible to produce Monacolin K by T LC , which were further evaluated by HPLC analysis. 3 strains were proved to produce higher Monacolin K, among them M7 was as high as 41 times of the original strain. Key words :Monascussp ; monacolin K; mutation breeding; T LC 一个活性多肽 肾上腺髓质素 朱赓伯,蒋滢,古桂雄,雷洁 (苏州大学医学院,苏州215007) 日本学者首次从人的嗜铬细胞瘤组织中分离出一种新的活性多肽,由52个氨基酸残基所组成,在 CYS162CYS21之间有一个二硫键,分子量为5732。其氨基酸残基序列为Tyr - Arg - Cln - Ser - Met - Asn - Asn - Phe - G ly - Leu - Arg - Ser - Phe - G ly - Gys - Arg - Phe - G ly - Thr - Val - G ln - Lys - Leu - Ala - His - G ln - Ile - Tyr - G ln - Phe - Thr - Lys - Asp - Lys - Asp - Lys - Asp - Asn - Val - Ala - Pro - Arg - Ser - Lys - Ile - Ser - Pro - G ln - G ly - Tyr - NH2 这个活性多肽具有重要的生物学功能 :(1) 具有明显的舒张血管、 降低血压作用,其舒张血管作用可能部 分是通过降钙素基因相关肽受体介导的,并依赖于血管内皮细胞,去除血管内皮细胞后,其舒血管作用明显 降低,其舒血管作用机制可能与内皮衍生舒张因子有关。(2)收缩血管,升高血压。在该肽合成时的前肽原 的153 - 185肽的主要作用与上述13 - 52肽段作用相反。该肽段对猫动脉具有明显的剂量依赖性收缩作 用。