瑞士乳杆菌高活力蛋白酶发酵条件的优化.pdf

2007, Vol. 28, No. 09食品科学生物工程356 瑞士乳杆菌高活力蛋白酶发酵条件的优化 张 莹，陈庆森 * (天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学生物技术与食品科学学院生生物工程系，天津 300134) 摘 要：本研究采用正交试验的方法对瑞士乳杆菌TS6024 发酵乳清蛋白相关发酵条件进行优化，以达到瑞士乳杆菌 分泌高水平蛋白酶能力的目的。实验结果表明，优化的发酵条件为：温度 35、发酵初始 pH6.5、接种量 2.0%、 静置发酵 16h 后，发酵液中生成游离氨基酸的水平达到 994.170 105mol/L，分泌蛋白酶的活力达到 62.136U。 关键词：正交试验；瑞士乳杆菌；蛋白酶活力；游离氨基酸含量 Study on Optimization of Fermentation Process Conditons of Lactobacillus helveticus Proteinase with High Activity ZHANG Ying， CHEN Qing-sen* (Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Department of Bioengineering, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China) AbstractAbstract ： The fermentation of Lactobacillus helveticus TS6024 was studied by orthogonal test in this paper. The purpose was to enhance the proteinase activity of Lactobacillus helveticus TS6024. The results showed that optimized fermentative condition, and the optimal culture temperature, the optimal initial pH, the quantity of inoculation, the optimal culture time and the volumes 357生物工程食品科学2007, Vol. 28, No. 09 瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)是人体肠道内 的一种益生菌，也是制作干酪制品中常用的乳酸菌发酵 剂，因此是一种使用非常广泛的菌种。研究发现该菌 是一种对营养需求非常苛刻的乳酸菌，但通常可从酸乳 中分离，是制干酪的引子，同型发酵产生 D L - 乳酸， 且食用安全1。目前相关的研究报道已经证实，利用瑞 士乳杆菌作为发酵剂，与传统发酵剂相比，该菌表现 出较强的蛋白水解能力，能水解乳蛋白产生各种氨基酸 并释放出具有生物活性的肽类产物。因此瑞士乳杆菌是 一种具有开发潜能的发酵剂。 近些年来，利用乳酸菌发酵牛乳生产的乳制品， 经国内外研究人员的功能评价证实其具有抗血压升高、 降低胆固醇、抑制肿瘤、免疫调节等作用。到目前为 止，就乳源降血压多肽的研究报道已有很多，但研究 主要集中在酶解动植物蛋白制备具抑制 A C E 活性的肽 类产品方面。有关微生物发酵法生产血管紧张素转化 酶(ACE)抑制肽和优化高水平表达蛋白酶活力的乳酸菌 仅有很少报道，主要是早在 1 9 9 4 年 N a k a m u r a 和 Yamamoto 两位日本学者的工作。Nakamura 研究了植 物乳杆菌发酵的酸牛乳中 A C E 抑制活性肽的分离纯 化，Yamamoto2-3则系统研究了用Lactobacillus helveticus CP790发酵的酸牛乳中降血压多肽的分离和纯 瑞士乳杆菌TS6024(Lactobacillus helveticus TS6024) 由本实验室筛选获得。 乳清粉由澳大利亚进口。 1.1.2培养基 瑞士乳杆菌 TS6024 斜面保藏培养基：牛肉膏 0.5%， 酵母膏 0 . 5 % ，蛋白胨 1 % ，葡萄糖 1 % ，乳糖 0 . 5 % ， NaCl 0.5%，琼脂 2%，调 pH 至 6.0。 发酵培养基：取一定量的乳清粉配制成发酵培养基。 1.1.3仪器 970CRT荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公 司；DL-6000B 型低速冷冻离心机 上海安亭科学仪器 厂；超高速冷冻离心机 美国 Sigma 公司；LRH-150 生 化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；MLS3780 高压 蒸汽灭菌锅 日本 SANYO 公司。 1.2方法 1.2.1高活力蛋白酶发酵条件的优化 1.2.1.1瑞士乳杆菌发酵利用乳清蛋白最适浓度的选择 选择高水平分泌蛋白酶的底物浓度对本研究至关重 要，试验采用测定乳清溶液浓度分别在 8 % 、9 % 、 10%、11%、12%(W/V)时，发酵液中游离氨基酸的含 量，从而确定乳清发酵液中产生高水平蛋白酶活力的最 佳 浓 度 2007, Vol. 28, No. 09食品科学生物工程358 1.2.2.2蛋白酶活力的定义 酶活力定义：在规定的条件下，瑞士乳杆菌发酵 乳清蛋白 1h 分解生成 0.01mol/ml 游离氨基酸的量为 1 个 活力单位。 1.2.3实验数据处理 本实验采用正交设计助手II(V3.1)软件进行数据处理 及 分 析 。 2结果与分析 2.1瑞士乳杆菌发酵乳清蛋白生产高水平蛋白酶的最适 浓度的研究 按1.2.1.1所建立的研究方法，对瑞士乳杆菌发酵乳 清蛋白产生高水平蛋白酶的最适浓度进行了研究，结果 见表 2 。 浓度在 1 0 % ( W / V ) 时，发酵液中游离氨基酸的含量最 高，即酶的活力最高，达到了 42.673U。因此，瑞士 乳杆菌发酵乳清蛋白产生高水平蛋白酶的浓度均采用 1 0 % 的乳清溶液作为发酵培养基。 2.2高活力蛋白酶发酵条件优化的试验结果 2.2.1正交试验结果分析 由表 3 中的实验结果可以分析得出： (1)从各因素极 差的大小来看，接种量对游离氨基酸影响最显著，其 次为装液量，再次为起始发酵液 p H 和发酵时间，发酵 温度对氨基酸的影响最小。根据 K 值可以分析得出在理 论上使游离氨基酸含量最高的发酵条件为：A(150ml)、 B(6.5)、C(2%)、D(16h)、E(35)； (2)由 16 组试验的 结果可以发现，游离氨基酸最高的发酵条件为：A (100ml)、B(6.5)、C(2%)、D(16h)、E(33)与极差对照 没有相应的组合，所以对于上述所得的发酵条件理论上 最优组合需要作进一步的发酵确证实验，以便获得最适 发酵条件组合。由表 4 方差分析可见，各因素的 F 值 F0 . 0 5，说明发酵温度、发酵时间、发酵培养基初始 p H 值、接种量和装液量对游离氨基酸的含量影响不显著， 故表 3 中无显著性标记。 2.2.2优化组合后发酵水平的验证 在上述正交试验优化发酵条件，选出发酵所得的酶 乳清溶液浓度游离氨基酸含量 (%, W/V) 荧光值 (105mol/L) 酶活力(U) 8533.699572.12335.758 9540.129580.65436.291 10617.083682.75642.673 表2 不同乳清溶液浓度时的游离氨基酸含量及酶活力 Table 2 Free amino acid content and enzyme activity at different whey concentrations 359生物工程食品科学2007, Vol. 28, No. 09 序号A(ml)BC(%)D(h)E()荧光值游离氨基酸含量(105mol/L)酶活力(U) 11006.52.01633795.467919.43357.464 21506.52.01635851.796994.17062.136 3200l5.02.51635752.320862.18753.887 表5 进一步优化发酵实验的结果分析 Table 5 Optimization result of further fermentation process 因素偏差平方和自由度F 比F 临界值显著性 装液量140367.68431.8123.290 起始 pH62965.63530.8133.290 接种量123605.20131.5953.290 发酵时间44220.82530.5713.290 发酵温度16271.08730.2103.290 误差387430.4315 表4 正交试验方差分析表 Table 4 Variance analysis of orthogonal test (150ml)、B(6.5)、C(2%)、D(16h)、E(35)。 3结论与展望 3.1结论 本实验以瑞士乳杆菌TS6024 为实验菌种进行发酵乳 清蛋白的条件研究，确定了发酵最适浓度为 10 %；采用 正交试验的方法，并利用正交设计助手II(V3.1)软件进行 数据处理及分析，确定了高水平发酵生产蛋白酶的最佳发 的降血压多肽产品，也可以将其制品作为功能因子制成 各类食品添加剂添加到食品中，产业化推广后，预计 将有良好的经济效益和社会效益。 本研究确定了高水平发酵生产蛋白酶的最佳发酵条 件，实现了提高瑞士乳杆菌利用乳清蛋白分泌高活力蛋 白酶和高水平 A C E 抑制肽的目标，为高水平生产 A C E 抑制肽奠定了基础。目前利用微生物发酵法生产具有 ACE 抑制活性的多肽产品，国内研究较少且不深入，特 别是高活力生产菌种的选育，A C E 抑制肽分离及鉴定、 结构及功能的评价等还需做进一步系统的研究工作，以期 能够在食