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6 8 微 生物学杂 志 2 0 1 1 年 1月第 3 l 卷 第 1 期J O U R N A L O F MI C R O B I O L O G Y J a n 2 0 1 I V o 1 3 1 N o 1 细菌通过聚酮合成酶途径合成 多不饱和脂肪酸的研究进展 万 霞 一,江木 兰 ( 1 中国农业科学院 油料作物研究所 , 湖北 武汉4 3 0 0 6 2 ; 2 农业部油料作物生物举重点开放实验室 , 湖北 武汉4 3 0 0 6 2 ) 摘要细菌利用聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸是近年发现 的新的脂肪酸合成途 径。这种途径 与常 规的由脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶引导的脂肪酸合成途径有 着本质上 的差别。总结 了近些年 细茵利 用 聚 酮合 成 酶合 成 多不 饱 和脂 肪 酸 这一 新 途 径 的研 究状 况 , 重 点 阐 明其 分 子机 制 , 并 对 其 研 究 趋 势 及 应 用 前 景 进 行 了展 望 。 关 键 词 细 菌 ; 聚 酮 合 成酶 ; 多不 饱 和 脂 肪 酸 中图分类号Q 9 3 9 1 文献标识码A 文章编号1 0 0 5 7 0 2 1 ( 2 0 1 1 ) 0 1 0 0 6 8 0 6 Adv a n c e d i n Bi o s y n t h e s i s 0 f PO l y u ns a t u r a t e d Fa t t y Ac i d s b y Ba c t e r i a l Po l y k e t i d e S y n t h a s e Pa t h wa y W AN Xi a 一J I ANG Mu l a n ( 1 O i l C r o p s R e s 1 n s t C h a A c a d o f A g r i c S c i W u h a n 4 3 0 0 6 2 ; 2 X e , L a b f o r B i o 1 S c i O i l C r o p s , Mi n i s t A g r i c 。W u h a n 4 3 0 0 6 2 ) Ab s t r a c t B i o s y n t h e s i s o f p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s( P U F As )i n b a c t e r i a b y p o l y k e t i d e s y n t h a s e p a t h w a y i s a n e w l y f o u n d wa y r e c e n t l y Th i s p a t h wa y i s f u n d a me nt a l l y d i s t i n c t f r o m p r e v i o u s l y r e c o g n i z e d c o nv e nt i o n a l pa t h wa y t h a t n e e d s f at t y a c i d d e s a l u r a s e s a nd e l o n g a s e s o f s a t u r a t e d f a t t y a c i d s S o me r e s e a r c h a d v a nc e s o n bi o s y n t h e s i s o f PUF As i n ba e - t e r i a b y p o l y k e t i d e s y n t ha s e pa t h wa y wa s s u mma r i z e d i n t h i s p a p e r a n d emp h a s i z e d o n r e s e a r c h s i t u a t i o n i n t h e mo l e c u l a r me c h a n i s m o f t h i s p a t h wa y,i n a d d i t i o n,t h e r e s e a r c h t r e n d s i n t h i s f i e l d a n d a pp l i c a t i o n p r o s p e c t o f t h i s p a t h wa y wa s a l s o s p e c u l a t e d o n Ke y wor ds ba c t e r i a;p o l y k e t i d e s y n t h a s e;p 0 1 y u n s a l u r a t e d f a t t y a c i d s 多不 饱和脂肪 酸是一类 含有多 个双键 的脂 肪 酸 。多不饱 和脂 肪 酸 不仅 是 细胞 膜 的重 要 组成 , 还是一系列具 有重要生 理活性 功能产 物 的重 要 前 体物质 。长链 多 不饱 和 脂肪 酸 一 般指 含 有 2 0个 以上碳原子 的多不 饱 和 脂肪 酸 , 主 要存 在 于 一些 海 洋鱼类 、 真 菌和藻类 等 真核 生物 中。上世 纪 8 O 年代末 , 研 究者发 现原核生物 中除 蓝细 菌以外 , 某 些细菌 也 能合 成 n - 3途 径 的 长 链 多 不 饱 和脂 肪 酸 。并且 这类 细 菌 往往 生 活在 比较 特 殊 的环 境 中 , 如低温深 海 中 和海 洋 鱼类 的 肠道 中。尤其 值 得关 注的是 , 这类 细 菌 产 生 的不 是 常见 的 中 长链 多不饱 和脂 肪酸 , 如 亚麻酸 和亚油 酸一类 , 而是 稀 有且具有高 营养价值 和生理 活性 的二十 二碳六烯 酸 ( D HA) 和 二 十 碳 五 烯 酸 ( E P A) u 。 一 般 认 为 , 多不饱 和脂肪 酸 是在 线 粒体 或 内质 网上 通过 一 系列 的脂 肪 酸 去 饱 和 酶 ( f a t t y a c i d d e s a t u r a s e ) 催化 的碳 链 脱饱 和 反 应 和 由脂 肪 酸 延 长 酶 ( f a t t y a c i d e l o n g a s e ) 催化 的延长 反应 而合 成 。但 近年 来 通过对产 生 D H A或 E P A的一类 海洋 细 菌进行 研 究后发现 , 除了这种 常规合成 途径外 , 还 存在一 基金项 目: 国家 自然科学基金( 3 1 0 0 0 7 8 ) ; 农业部油料作物生物学重点开放实验室开放课题( 2 0 1 0 1 2 ) ; 国家公益性科研院所专项资金( 2 0 0 9 0 3 ) 作者简介 : 万霞女, 助理研究员 , 博士。研究方向为微生物油脂和多不饱和脂肪酸代谢工程。E m a i l : m e l a n i n w x y a h o o c 0 1 n C r l 通讯作 者。T e l : 0 2 7 - 8 6 8 3 8 7 9 1 , E - m a i l : m l j i a n g o il e r o p s c a 收稿 13期: 2 0 1 0 1 2 2 0 ; 修 回日期 : 2 0 1 1 -0 1 - 2 0 1 期 万 霞等 : 细菌通过聚酮合成 酶途径合成多不饱和脂肪酸的研究进展 6 9 种独特 的不依 赖于脂 肪 酸去饱 和酶 和脂肪 酸延 长 酶的新 途 径 合 成 长链 多不 饱 和 脂 肪 酸 。在 这 一新途 径 中 , 均发 现一种 存在 于细胞 质 中、 由多 亚基 组 成 的 复 合 酶 聚 酮 合 成 酶 ( p o l y k e t i d e s y n t h a s e 。 P K S ) , 该 酶 与脂 肪 酸 去 饱 和 酶 几 乎 没 有 同 源 性 , 但 与 脂 肪 酸 合 成 酶 ( f a t t y a c i d s y n t h a s e , F A S ) 有相似 的保守 结构 域 , 因而 该途 径 被称 为 聚 酮合成酶途径( 简称 P K S途径 ) 。本文从聚酮合 成酶途 径 中关键 基 因的分 子克 隆与结 构功 能分析 两 方 面 阐 述 其 研 究 现 状 , 以期 为 相 关 研 究 提 供 参 考 。 1 P K S途径 中关键功 能基 因的克 隆 和异源表达 1 1 P KS途径 中关键功 能基 因的克 隆及 其类型 在 1 9 9 6年 日本 科 学 家首 次 报 导 了从 海 洋 动 物的肠 道 中新 分 离 到一 种 能产 生 E P A 的 海 洋细 菌 腐 败 希 瓦氏 菌(S h e w a n e l l a p u t r ef a c i e n s S C R C 2 3 7 8 ) , 该菌株 中 E P A 含量 占总脂 肪 酸 含量 的 2 4 4 0 , 并 且几 乎 没有 检 测到 C 1 8到 C 2 0 之 间 的多不饱 和脂 肪 酸 , 说 明 该 菌株 中存 在非 常 特别 的合 成 E P A机 制 。 随后 该 研 究 小 组 从 该 菌 株 中克隆得 到一 段 3 8 k b p的 D N A 片 断 , 该 片 断 含有 8个 大于 1 k b的开发 阅读 框 , 然 而 只有其 中 的 5个 开 放 阅读 框 是 合 成 E P A 所 必 需 的 。这 5 个开 放 阅 读 框 分 别 被 命 名 为 A、 加 B、 加 c 、 加 D和 p f a E 。随后 , 研究 者陆 续从 多 个可 以产 生 E P A或 D H A的细 菌 中发 现 与 p f a具 有 相 似性 的基 因。A l l e n等 从 深 海发 光 杆 菌 ( P h o t o b a c t e r i u m p r o f u n d u m S S 9 ) 中获 得 了大小 为 3 3 k b p编码 E P A合成 的基 因簇 p f a A、 加 B 、 p f a C 、 加 D, 但 不包 括 编码磷 酸泛 酰 巯 基 乙胺 基 转移 酶 ( p h o s p h o p a n t e t h e i n y l t r a n s f e r a s e ,P P T a s e )的基 因 加 。De l o n g 等 早 在 1 9 8 6年就分 离 到 l株可 以产 生 D H A的 海产 弧菌 ( V i b r i o m a r i n lz $M P 一 1 ) , 但 直 到 1 9 9 9年 , T a n a k a等 推 测 该 菌 株 以 P K S途 径 来 合 成 D H A, 并根据已测序的全基因组序列来设计引物, 最终 克隆得 到 包 含 p f a A、 p f B 、 咖 C和 p f a D基 因 簇 的 4 0 k b p的 D N A片段 。作 者分 析 由于没 有 克 隆到 p f a E , 因而该基 因簇 一直 未 能 在 大肠 埃 希 菌 中成功 表达 。此外 , 在 1株能 产 生 E P A且 嗜冷 的 希 瓦 氏菌 ( S h e w a n e l l a s p G A- 2 2)中, 虽然 也发 现 了 P K S合 成 途 径 , 但 仅 克 隆 得 到 A 和 屈C 2 个基 因 片断 。 由于 此 扩 增 过 程 中 用 到 的简 并 引物是 根据 腐败 希瓦 氏菌 S C R C 2 3 7 8和 深海 发光 杆菌 S S 9及 海 产弧 菌 M P 一 1中已 报道 的 加序 列 来设 计 的 ,因 此 可 能 由 于 希 瓦 氏 菌 GA一 2 2 中 p f a B、 加 D和 加 E基 因 与其他 来 源的基 因 同源性 不 高 , 而未能通 过 简并 引物 扩增 的方 法 获得 完 整 的 p 基 因序 列 。 近 年来 , 随 着越 来 越 多海 洋 细 菌基 因组 测序 的完 成 , 人 们发 现 无论 是 已报道 能 产 生 长链 多不 饱 和脂肪 酸的 海洋 细 菌 , 或是 推 测 能产 生 长 链多 不饱 和脂肪 酸 的海洋细 菌 均含 有类 似 于 系列 的基 因序列 。根据 加系列基 因 的排列方 式 , P K S 合 成途 径 的关 键基 因大致 分为 3种类 型 。第 1 种 类 型 最 重 要 的 特 征 是 同 一 基 因 簇 中包 括 所 有 加 A、 加 B、 p f a C 、 p f a D和 de e 5个关键 基 因 , 这 种 类 型 主 要 分 布 在 奥 奈 达 希 瓦 氏 菌 ( S h e w a n e l l a o n e i d e n s i s MR 1 ) 、 冷 红 科 尔 韦 尔 氏 菌 ( C o l w e l l i a p s y c h r e r y t h r a e a 3 4 H ) 以 及 腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8为代 表 的海 洋 细菌 中。尽 管在 腐 败 希 瓦 氏菌 S C R C 2 3 7 8的 p f a基 因簇 中 p f E与 其他 4 个基 因并 非连续 排 列 , 而 是 间隔 了 2个 似乎并 不 相关 的 开 放 阅 读 框 , 但 该 基 因 簇 仍 归 于 这 一 类 型 。第 2种 类 型与第 1种 类 型 的差 异 不大 , 也 包 括 5个完 整的 系 列基 因 , 但 E与前 4个 基 因不 在 同 一基 因簇 中 , 例 如 海 产 弧 菌 M P 1的 p f E与 其余 4个 加系 列 基 因不 在 同 一 基 因簇 中 , 但功 能上还 是 体 现互 补 性 。第 3种类 型 在 1株 假 交 替 单 胞 菌 ( P s e u d o a l t e r m o n a s s p S t r a i n D S 一 1 2 ) 中被发 现 , 加系列 基 因位 于 同一 基 因簇 , 但 只包 括 p f a i、 p f a n、 p f a C和 D 4个 基 因 , 而 p f e E整 合 到 p f a C基 因 的序 列 中形 成 p f a C E, 执 行 双 功 能 。此 外 , 加 B与 p f a C E之 间还 被 一个 功 能 不 相 关 的 开 放 阅 读 框 所 隔 开 ( G e n B a n k A B F 0 0 1 3 0 ) 。 1 2 P KS途 径 中关键基 因的异 源表达 尽管越 来越 多海 洋细菌 中参与长 链 多不 饱 和 脂 肪 酸合成 的 P K S途 径关 键基 因 被 分析 和克 隆 , 但 将这类 基 因在异 源微生 物 中成 功表达 并获 得最 终 产物 E P A或 D H A的范例 并不 多见 。据 推测 造 成 这一 困难 主要有 两点原 因 , 一 是 由于完 整 的 加 7 O 微生物学杂志 3 1 卷 基 因簇 一般都 有 3 0 k b p左 右 的大小 , 成 功转 化异 源微生 物的几率 相对 较 小 ; 二 是 目前 已获得 的完 整 的 加基 因簇并 不多 。 日本一 科 研小 组首 次报 道将来源 于腐败希瓦 氏菌 S C R C 2 3 7 8中包 含 完整 p f a 基 因簇 的 3 8 k b p片段转 入 1株原 核光 合 细菌 聚球 藻 中, 获 得 了能 够 产 生 E P A 的 基 因工 程 藻 株 。经过 初步 的发 酵条 件优 化 , 该菌 株 可产 生干 重最高为 0 6 4 n l g g的 E P A 。随后 , 同样来 自 于腐败希 瓦氏菌 S C R C 2 3 7 8中3 8 k b p的片段 还被 分别 转 入 大 肠 埃 希 菌 J M1 0 9 以 及 大 肠 埃 希 菌 D H 5 c t 。不 同培养 条 件 下 , 重 组 大肠 埃 希 菌 产 生 E P A 的 含 量 可 占 总 脂 肪 酸 含 量 的 6 3 2 2 3 , 1 1 。此外 , 来 自于 奥 奈 达 希 瓦 氏 菌 MR 1 的加 基因簇被克隆并在大肠埃希菌 中表达, 重 组细菌产生 E P A的含量仅占到总脂肪酸含量的 0 6 9 。但将该加基因簇放到含有 l a c Z启动子 的多拷贝质粒 p B l u e s e r i p t S K(十) 中再转入大肠 埃希菌, 重组菌株 E P A的含量提高到占总脂肪酸 含 量 的 7 5 H 。将 来 自于 另 一 株 可 以合 成 E P A的希 瓦 氏菌 B R 一 2的 p f a基 因簇 直 接在 大 肠 埃希 菌 X L - B l u e M R 中 表达 , 就 可 检 测 到 重组 菌 株 E P A 的 含 量 占 到总 脂 肪 酸 含 量 的 7 5 。 目前所有 的报道都是将 基 因簇转 入原核生 物 , 并使 之产 生长 链 多不 饱 和脂肪 酸 。在今 后 的 研究 中 , 可 以尝 试将 这类 基 因进 行一 定 的修 饰 或 改造后 , 转入模式 真核生物如毕 赤酵母 、 酿酒酵母 以及拟南芥中, 合成这类稀有的长链多不饱和脂 肪 酸。 2 P K S途径 中关键基 因的结 构及其 功能 2 1 PKS途径 中关键基 因的结构分 析 从 目前 已报 道的结果 可以看 出 , 加 基 因簇 的 存在 是海洋细 菌通过 P K S途径 合 成 E P A或 D H A 的必需 条件 。进 一步对这 类细 菌 中 加基 因簇 进 行分析发 现 , 尽管 p f a基 因簇 的 基本 框 架 结 构 相 似 , 但某些结 构 域 还是 有 许 多 独 特之 处 。在 第 l 类 和第 2 类 的 基 因簇 中 , 加 A一 般包 括 3 酮 脂酰合成 酶 ( 3 一 k e t o a c y l s y n t h a s e ) 、 丙二 酰辅 酶 A: 酰基载体 蛋 白酰 基 转 移 酶 ( m a l o n y l c o e n z y m e A: a c y l c a r r i e r p r o t e i n a c y h r a n s f e r a s e )以 及 3 一 酮脂 酰 A C P还原 酶 ( 3 一 k e t o a c y l A C P r e d u c t a s e ) 的典 型 结 构域 , 因 而 被 认 为 是 编 码 一 个 多 功 能 的 蛋 白。 p f a G一 般 包 括 2个 3 - 酮 脂 酰合 成 酶典 型结 构 域 的重复 序 列 以及 23个 3 一 羟 癸 酰 A C P脱 水 酶 ( 3 - h y d r o x y d e c a n o y l A C P d e h y d r a t a s e s ) 典 型结构域 的重复 序列 。据报 道 , 奥奈 达 希 瓦 氏菌 MR - l 、 腐 败希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8和 深 海 发 光 杆 菌 S s 9中 加 c的第二 个类 似 3 一 酮 脂 酰 合成 酶 的编 码 区 被 证 实 是 一 种 碳 链 延 长 因 子 ” 。值 得 注 意 的 是 , 目前发现所有负责 E P A合成的 c中均有 3 个类似于 6 A的3 一 羟癸酰 A C P脱水酶的典型结 构域 , 而所 有 负 责 D H A合 成 的 C 中均 只有 2 个 3 一 羟癸 酰 A C P脱水酶 的典型结构 域 , 而另外 一 个处 于 中间位 置 的结构 域 却 和 b Z A具 有 同源 性 。加 B和 加 D编 码 的蛋 白一般 包括 3 一 酮脂 酰 合成酶、 酰基转移酶( a c y h r a n s f e r a s e ) 以及烯酰还 原酶( e n o y l r e d u e t a s e ) 的典型结构域 ” 。 目前 仅在产 生 D H A 的海 产 弧 菌 MP 一 1 副和冷 红 科 尔 韦尔 氏菌 3 4 H 中发现 P f a B蛋 白含有 典 型 的 3 一 酮 脂酰合成 酶结构 域 。海产 弧菌 MP 一 1的 P f a B尽 管 含有典型 的 3 酮脂 酰合 成 酶结 构域 , 却 惟 独缺 少一段包 括 活性 位点 在 内 的序 列 。假 交 替 单 胞 菌 D S 一 1 2中 加基 因簇 的 结构 比较 独 特 , 不 同 于以上任何 一种情 况。该 菌株的 P f a B蛋 白具有 2 个 3 酮脂 酰合成 酶的典型结 构域 , 而 P f a C E蛋 白 同时具有磷 酸泛酰巯基 乙胺基 转移 酶和 2个 3 一 羟 癸酰 A C P脱水 酶的结构 域。并且 , 存在 于 p f a C E 基 因下游 的 加 D基 因中 , 包含一段 与烯 酰还原 酶 ( e n o y l r e d u c t a s e ) 同源 的序列 。 在 基因簇中, 相对于 p f a A B C D基因而言, 目前对 加 E的研究最 为透彻。参 与 E P A或者 D H A合成 的 E基 因 , 又 称 为磷 酸 泛 酰巯 基 乙 胺基转 移酶基 因 , 一 般被 认 为 是一 个 大 的基 因家 族。依据推测的蛋白质大小和核心区结构组成可 将 这个家族 归为 2种类 型 的 S f p型的磷 酸泛 酰 巯 基乙胺基转移酶基因家族。第 1种具有 P o 、 P 1 a 和 P 1 b 3个 核心 区 , 主要 负 责 E P A和 D H A 的合 成 ; 第 2种具有 l A、 P 1 a 和 P 1 b 3个 核心 区 , 主要 负责多聚酮和非核糖体肽的合成, 且在结构上类 似于第 1种类 型 。例如 , 在基 因组 已经 测序 的 深 海发 光 杆 菌 S S 9中 , 分 析 E基 因 ( G e n B a n k : C A G 2 3 6 8 5 ) 的结 构属于典 型 的第 1类 s f p型 磷酸 1 期 万霞等 : 细菌通过聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸的研究进展 7 l 泛酰巯 基 乙胺 基转 移酶基 因。 2 2 P KS途径 中关键 基 因的互 补功能分析 目前 , 对 以腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8为 代 表 的合 成 E P A 的细菌 和 以海 产弧 菌 MP 一 1 为代 表 的 合成 D H A的细 菌研究 较 为清楚 , 因此大部 分 的研 究是 以这 2株 细 菌为 模型 来分 析 P K S途 径 中 加 系列基 因 的互 补功 能 。最初研究 人员 发现腐 败希 瓦 氏菌 S C RC 2 3 7 8中的 p f a AB C D 4个 基 因在 大肠 埃 希菌 中表 达 , 重 组 菌 株 不 能 合 成 E P A, 但 将 来 自海产弧 菌 MP 一 1中 8 6 1个碱基对 组成 的 da E基 因和来 自腐败希 瓦 氏菌 S C R C 2 3 7 8中的 p f a A B C D 4个基 因在 大 肠埃 希 菌 中共 表 达 时 , 重组 菌株 产 生 了约 占总脂 肪 酸 成 分 1 2 的 E P A 。这 一 互 补 试验 有力证 实 了 E基 因编码 的磷 酸 泛 酰巯 基 乙胺 基转移 酶是 P K S途径 介导 n 一 3类 多不饱 和脂 肪酸合 成 的必 需 酶 。 但将 p f a A基 因 的活 性 中心 突变后 , 再 来重 复 以上 互补 实验 , 发 现无论 有 元 加 E基 因存在 , 重组 菌株都 不能 合成 E P A。以 上 实验说 明 加 A基 因 的功 能在 E P A合 成 中也 是 必 需 的 。若 将 腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8中 p f a B C D E 4个 基 因和 海 产 弧 菌 MP 一 1中 p f a AB C D 4个基 因共表 达时 , 重 组 菌株 既可 以合 成 E P A 又 可 以合成 D H A 。 随后 由于从 深海发 光杆 菌 S S 9中未克 隆得 到 p f a E基 因, 因此研 究人 员 将来 自于 枯草 芽胞 杆 菌 ( B a c i l l u s s u b t i l i s ) 和 1 株 希瓦 氏菌( S h e w a n e l l a s p S C 2 A) 中 的 加 E基 因 与深 海 发 光 杆 菌 S S 9中 的 p f a A B C D 4个 基 因 在 大肠 埃 希 菌 中共 表 达 , 但 重 组 菌株 未 能 合 成 E P A 8 1 。 分 析 原 因 可 能 是 由于 枯 草芽胞 杆 菌 和 希 瓦 氏菌 S C 2 A 中 的 咖 E基 因 均 属于第 2类 的 s f p型磷酸 泛酰 巯基 乙胺基 转 移 酶 基 因。近 2 a , 由于深海 发光杆 菌 S S 9的基 因组 测 序完成 , 已有 研究 人 员 从该 菌株 中克隆 得 到 全 长 为 6 9 0 b p的 p f a E基 因 , 并 与海 产 弧菌 MP l中 的 p f a A B C D 4个基 因 在 大肠 埃 希 菌 中共表 达 , 最 终 也实现 了重 组 菌 株 合 成 D H A, 并且 D H A 的含 量 占到 总脂 肪 酸 含 量 的 2 2 1 。深 海 发 光 杆 菌 S S 9中 加 E基 因则 属 于典 型 的第 1类 S f p型 磷酸 泛酰 巯基 乙胺 基转 移酶基 因 。 最 近 , 日本 北 海 道 大学 的学 者 又在 研 究 P K S 途 径关键 基 因的功 能方 面取得 了突破性 进展 。他 们 将来 源于 海 产 弧 菌 MP 一 1中 负 责 合 成 D HA 的 p f a A B C D E 5 个 基 因 与 来 源 于 腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8中负 责合成 E P A的单 独 的 p i c A、 咖 B 、 p i n G、 加 D和 p f a E 5个 基 因分 别连接 并在 大 肠埃 希菌 中进行 共 表 达 。结果 发 现 , 只 有 当来 源 于海 产弧 菌 MP 1中 p f a AB C DE 5个 基 因 与来 源 于 腐 败希 瓦氏菌 S C R C 2 3 7 8中的 加 B共 表 达 时 , 重 组 菌株 可 以 同 时 合 成 E P A 和 D HA 。 而 海 产 弧 菌 MP 一 1中 p f a AB C DE 5个 基 因 与 腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8中其 他 基 因共 表 达 时 , 重 组 菌 株 都 不 能 同时合 成 E P A和 D H A。该 实验说 明 p f a B是产 生 E P A最 为关键 的基 因 。在此 基础 上 , 他 们还 设 计 了 一 个 有 趣 的实 验 , 将 来 源 于 腐 败 希 瓦 氏 菌 S C RC 2 3 7 8的p f a AB CD E 5个 基 因与海产 弧菌 MP - 1中的 da b在 大肠 埃希 菌 中共表 达 , 结 果重 组 菌 株 仅 能 产 生 E P A; 而 若 将 来 源 于腐 败 希 瓦 氏 菌 S C R C 2 3 7 8的 p f a A C D E 4个 基 因与海产 弧菌 M P 1 中的 da B在 大肠 埃希菌 中共 表达 时发 现 , 重 组菌 株 不 仅 能 产 生 E P A 还 能 产 生 D H A 。 由此 推 测 , 负责 E P A合成 的 加 B基 因 比负 责 D HA合成 的 加 B基 因 合 成 效 率 更 高 , 又 或 者 在 E P A 和 D H A合 成过 程 中 , P f a蛋 白复 合 物存 在 特 定 的底 物竞 争 机 制 。但 无 论 是 哪 种 可 能 , 都 不 能 否 认 加 B基 因是 决 定 P K S途 径合 成终 产 物 十 分 关 键 的基 因。 3 P K S途 径研 究展望 E P A和 D HA这 一类 具 有重 要 生 理 活性 功 能 的稀有 多不饱 和脂 肪 酸主要 来源 于海洋 鱼类 。但 由于环境 污染对 鱼类 的毒 害 以及海 洋鱼类 产量 的 不稳 定等 因 素 , 造成 E P A和 D HA这类 多不 饱 和 脂肪 酸产 量有 限 因而 价格 昂贵 。通 过 P K S途 径合 成 E P A或 D H A, 相对 于 传统 的脂 肪酸去 饱和 酶 和脂肪 酸延长 酶合成 途径 而言 , 具 有 以下 优势 : 首先 , 经 由 P K S途 径合 成 的多 不饱 和脂 肪 酸具 有 高度 的单 一 性 , 如腐 败 希瓦 氏菌 S C R C 2 3 7 8 、 冰海 希瓦 氏菌 ( S h e w a n e l l a g e l i d i m a r i n a A C A M 4 5 6 T ) 等 仅合成 E P A而不合 成 D H A, 而海 产 弧菌 MP 一 1等 细菌仅合 成 D H A而 不合成 E P A。少数例外 , 如从 海洋鱼类 肠道 中分离 到的 1株未鉴 定种属 的细 菌 S C RC 2 1 4 0 6、 细 菌 1 6 C 1以及 弧 菌属 的 1株 细菌 1 “ 3 6 1 5 可 同时产 生 E P A和 D H A, 但 往往 D HA 的含量 ( 约 占 总脂 肪 酸 含 量 的 5 ) 远 高 于 E P A 微生物学杂志 的含量 ( 约 占总脂 肪 酸含 量 的 l ) 。至 目前 为 止 , 尚未 发现 P K S代谢途 径 除 E P A 和 D H A 以外 的长链脂肪 酸等前 体 物或 中 间产 物 出现 , 而经 由 真 核生物 中常规 途径合成 的多不饱 和脂 肪酸 不仅 有终 产物还 有多 种前 体 物质 存在 。其 次 , P K S途 径合 成多不饱 和脂 肪酸 的过 程不依赖 于氧分子 的 存在 。无论 在有 氧条 件 还是 厌 氧条 件下 , 这类 细 菌都可以通过此途径来完成多不饱和脂肪酸的合 成 过程 ; 与此 不同 , 真 核生物只能在 有氧条件下 通 过 常规途径来 合 成各 类 多不饱 和脂肪 酸 。最后 , 经由 P K S途径合成的多不饱和脂肪酸需要更少 的还原 能 量 , 如 N A D P H。尽 管 细 菌通 过 P K S途 径合成多不 饱和脂 肪 酸有 以上 优点 , 但 同时也 有 一 定 的局 限性 。绝 大 部分 利用 P K S途 径来 合成 多不饱 和脂肪酸 的细菌都 是从 海水 中或 海洋生物 中分离得到的海洋细菌。因此, 这类细菌几乎都 在低温条 件下生 存 , 并 且 也 只能在 较 低 的温度 下 合 成多不饱 和脂 肪 酸 。温 度一 旦超 过 一定 范 围 , 虽 然有些细菌仍 可 以生长 , 但 已不再 合 成 多不 饱 和脂肪 酸 。另外 , 这 类 细 菌往往 是 嗜盐 菌 。有研 究者发现 这类 细 菌 主要分 布 在 6个属 中, 这其 中 仅 2株细 菌冷海希 瓦 氏菌 ( S h e w a n e l l a f r i g i d i m a r i - n a ) 和 日本 希 瓦 氏 菌 ( S h e w a n e l l a j a p o n i c a ) 不 嗜 盐 , 但 这 2株菌仍 然在一定浓 度 的 N a C 1 存 在条 件 下生 长较好 。这 一现象提示 , 今后 可利用 遗 传 修饰或定 向进化 等手段来改变 这类细 菌合 成多不 饱和脂肪酸 的反应 条 件 , 如构 建耐 高 温或 耐低 盐 浓 度的工程菌 株 , 使其更适 合于应用 研究 。 迄今为止 , 研究 者们 已逐 步 深入 了解 以海 洋 细 菌为代 表 的原 核 生 物如 何 通 过 P K S途 径来 合 成 E P A和 D H A这 类 多不 饱 和脂 肪 酸 , 但 具体 机 制方面仍 有许 多不 解之 谜 。譬如 , 海 洋细 菌 都是 通过 p f a A B C D E基 因簇 这一 固定 模式 来合成 E P A 或 D H A, 并且不 同来 源 的 p f a A B C D E基 因 之间 也 具有很高的相似性, 但最终合成的多不饱 和脂肪 酸却不一样 , 说 明一 定还 存在 某 种未 知机 制 来决 定最终 的产 物 合成 。依 据 已有 的研 究结 果 , 推 测 可能是 P f a系列 蛋 白的相互 作用 来影 响最 终产 物 的合成 , 但这 一 推测 还需 更 多 的实验 来证 实 。此 外 , 研究 者们发 现一 种 细胞 内 中链脂 肪 酸合 成 的 抑制剂 浅蓝 菌 素 可 以促 进 许 多 海 洋 细 菌 中 E P A 和 D H A的合 成 。 目前 已经 证 实脂 肪 酸合 成 基 因簇 ( 6 ) 是参 与细胞 内 1 8碳 以内 中链脂 肪酸 合成 的关键 基 因 。因此 , 下一步 的研究方 向可 以利用 已经 建立 的 P K S途径 p f a A B C D E基 因簇以 及 -厂 乜 6 基 因簇的体外 重组 体 系来 研 究海 洋细 菌 中 P K S途 径 与 中链 常 规 脂 肪 酸 合 成 途 径 问 的 相 关 系。 参 考文献 : 1 D e l o n g E, Y a y a n o s A B i o c h e m i c a l f u n c t i o n a n d e c o l o g i c a l s l g n i fi c a n c e o f n o v e l b a c t e r i a l l ip i d s i n d e e p s e a p r o k a r y o t e s J Mi c r o b i o l o g y , 1 9 8 6 , 5 1 ( 4 ) : 7 3 0 - 7 3 7 2 Wa t a n a b e K, l s h i k a w a c O h t s u k a I , e t a 1 L ip i d a n d f a t t y a c i d c o mp o s i t i o n s o f a n o v e l d o c o s a h e x a e n o i c a c i d pr o d u c i n g ma ri n e b a c t e ri u m J 】 L i p i d s , 1 9 9 7 , 3 2 ( 9 ) : 9 7 5 - 9 7 8 3 Y a z a w a K P r o d u c t i o n o f e i c o s a p e n a e n o j c a c i d f r o m m a ri n e b a e t e r i a J L i p i d s , 1 9 9 6 , 3 1 : 2 9 7 - 3 0 0 4 A g u i l a r P, M e n d o z a D C o n t ro l o f f a t t y a c i d d e s a t u r a t i o n : a me c h a n i s m c o n s e r v e d f r o m b a c t e ri a t o h u m a n s J M o l M i c ro b i o l 。 2 0 0 6。 6 2 ( 6): 1 5 0 7 1 5 1 4 5 R u s s e l l N, N i c h o l s D P o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s i n ma ri n e b a c t e ri a a d o g ma r e w r i t t e n J M i c r o b i o l o g y , 1 9 9 9 , 1 4 5 ( 4 ) : 7 6 7 7 7 9 6 S i n g h A, Wa r d O M i c r o b i a l p r o d u c t i o n o f d o e o s a h e x a e n o i e a c id ( D HA, C 2 2 : 6 ) J Ad v A p p l Mi c r o b i o l , 1 9 9 7 , 4 5 : 2 7 1 - 3 1 2 7 A l l e n E, B a r tl e t t D S t r u c t u r e a n d r e g u l a t i o n o f t h e o me g a - 3 p o l - y u n s a t u r a t e d f a t t y a c id s y n t h e s i s g e n e s f r o m t h e d e e p s e a b a c t e - r i u m P h o t o b a c t e r i u m p r o f u n d u m s t r a i n S S 9 J Mi c r o b i o l o g y , 2 0 0 2, 1 4 8( 6): 1 9 0 3 - 1 91 3 8 T a n a k a M, U e n o A , K a w a s a k i K , e t a 1 I s o l a t i o n o f c l u s t e r e d g e n e s t h a t a r e n o t a b l y h o mo l o g o u s t o th e e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d b i o s y n t h e s i s g e n e c l u s t e r f r o m th e d o c o s a h e x a e n o i e a c i d-p r o d u c i n g b a c t e r i u m m 面 ma r i n u s s t r a i n MP I J _ B i o t c c b n o l L e t t , 1 9 9 9, 21 : 9 3 9- 9 4 5 9 G e n t i l e G, B o n a s e r a V, A mi c o c。 e t a 1 S h e w a n e U a s p G A - 2 2 , a p s y c h r o p h i l i e h y d r o c a r b o n o e l a s t i c a n t a r c t i c b a c t e riu m p r od u c i n g p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s J J A p p l Mi c rob io l , 2 0 0 3 , 9 5 ( 5): 1 1 2 4 - l 1 3 3 1 0T a k e y a m a H, T a k e d a D, Y a z a w a K, e t a 1 E x p r e s s i o n o f t h e e i c o - s a p e n t a e n o i c a c i d s y nth e s is g e n e c l u s t e r f r o m S h e wa n dl a s p i n a t r a n s g e n i c ma ri n e c y a n o b a c t e r i u m,S y n e c h o c o c c u s s p J Mic r o b i o l o g y , 1 9 9 7 , 1 4 3 ( 8 ) : 2 7 2 5 - 2 7 3 1 1 1 O r i k a s a Y, N i s h id a T, Ya m a d a A。 e t a 1 C h a ra c t e r iz a t i o n o f e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d b i o s y n t h e s i s g e n e c l u s t e r f r o m S h e wa n e l l a s p s t r a i n S C R C 一 2 7 3 8 J C e l l Mo l B i o l , 2 0 0 4 , 5 o ( 5 ) : 6 2 5 -6 3 0 f 1 2 L e e S , J e o n g Y, K i m D, e t a l , E i c o s a p e n ta e n o i c a c i d( E P A)b i 1 期 万霞等 : 细菌通过聚酮合成酶途径合成 多不饱和脂肪酸的研究进展 7 3 o s y n t h e t i c g e n e c l u s t e r o f S h e wa n e l l a o n e i d e n s MR 1: c l o n i n g, h e t e r o l o g o u s e x pr e s s i o n , a n d e f f e c t o f t e mp e r a t u r e a n d g l u c o

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