盐生隐杆藻藻胆蛋白的分离纯化和特性研究.pdf

1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 药 物 生 物 技 术 Pharmaceutical Biotechnology 2004 ,11(1) :3741 盐生隐杆藻藻胆蛋白的分离纯化和特性研究 欧 瑜,董 剑,吴梧桐 (中国药科大学生物制药学院,江苏 南京210009) 摘 要 盐生隐杆藻的水溶性色素提取物经硫酸铵沉淀、DEAE2Sepharose Fast Flow、 羟基磷灰石和 Sephacryl S2200柱层析,纯化出两种藻胆蛋白:藻蓝蛋白 (C 2 PC) 和别藻蓝蛋白(APC) ,纯度(A620/A280)分别为5. 5和5. 0。紫外2可见分光光度计测得C2PC和APC的最大可见吸收峰分别为617 nm和651 nm ,其室温荧光发 射峰分别为645 nm和664 nm。SDS2PAGE显示,C2PC和APC均有和亚基。C2PC的和亚基分子质量分 别为15 667 u和18 197 u;APC的和亚基分子质量分别为14 894 u和17 378 u。根据SDS2PAGE推算,C2 PC和APC单体的分子质量分别为33 864 u和32 272 u ,质谱测得C2PC和APC单体的分子质量分别为38 014 u 和36 432 u。经等电聚焦测定C2PC和APC的等电点分别约为4. 6和4. 8。氨基酸分析结果表明,C2PC和APC 分别含有17种氨基酸。 关键词 盐生隐杆藻;藻胆蛋白;藻蓝蛋白;别藻蓝蛋白 中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:100528915(2004)0120037205 藻胆蛋白(phycobiliprotein)是存在于某些藻类 (主要是蓝藻和红藻)藻胆体(phycobilisomes)中的 一类色素复合蛋白,在藻细胞中主要起捕获和传递 光能的作用1。藻胆蛋白可作为天然色素用于染 料、 化妆品和食品工业,还可用于免疫检测、 荧光显 微技术和流式细胞仪技术方面的生物化学示踪 物2。从80年代初,日本人Iijima发现藻蓝蛋白 具有增强机体免疫力的活性以来,人们不断发现了 藻蓝蛋白的抗肿瘤、 抗氧化等其它重要活性3 ,4。 盐生隐杆藻属蓝藻门(Cyanophyta)色球藻目 ( Chroococcales ) , 是盐田常见微藻,生长迅速且不 易被污染。盐生隐杆藻富含多糖和蛋白质,笔者发 现其藻胆蛋白含量丰富,但目前国内外尚未见报 道。本研究以盐生隐杆藻为材料,分离纯化到藻蓝 蛋白和别藻蓝蛋白,并研究了其分子和光谱特性, 为进一步研究其活性奠定了基础。 1 材料与方法 1. 1 实验材料 盐生隐杆藻由本实验室保存。 1. 2 盐生隐杆藻的培养 按文献5的方法,光照通气培养20 d。每升 可获取1520 g湿重藻细胞。 1. 3 藻胆蛋白粗品的制备 40 g盐生隐杆藻(湿重)用蒸馏水洗涤2次,悬 浮于50 mmol/ L磷酸盐缓冲中,反复冻融后用超 声波发生器冰浴中超声破细胞,4 离心(10 000 g 10 min) ,去细胞碎片获上清。在上清中加入固 体硫酸铵至25 %30 %饱和度,充分沉淀4 离心 (10 000g10 min) ,上清加入固体硫酸铵至 55 % 60 %饱和度,4。C静置过夜,离心,收集蓝色沉 淀,溶解于少量磷酸盐缓冲(10 mmol/ L ,pH值 7. 0 ,0. 1 mol/ L NaCl)中,并在此缓冲中充分透析, 透析液过滤即为上柱样品。 1. 4 藻胆蛋白的色谱分离 藻胆蛋白粗品上样于磷酸盐缓冲液(10 mmol/ L ,pH值7. 0 , 0. 1 mol/ L NaCl)平衡的DEAE2 Sepharose Fast Flow柱(2. 6 cm20 cm) ,用含0. 1 1 mol/ L NaCl的磷酸盐缓冲进行梯度洗脱。收 集的样品透析后上样于上述同样缓冲平衡的羟基 磷灰石柱(1. 6cm10 cm) ,10300 mmol/ L磷酸 盐缓冲 (pH 值7. 0 ,含0. 1 mol/ L NaCl)梯度洗脱。 收集 的 样 品 固 体 硫 酸 铵 沉 淀 透 析 后,上 样 Sephacryl S2200柱(1. 6cm80cm) ,洗脱液为 10mmol/ L ,pH值7. 0的磷酸盐缓冲(含0. 2 mol/ L NaCl)。 73 收稿日期:2003209206 修回日期:2003210207 作者简介:欧瑜,1967年12月生,女,江苏盱眙人,中国药科大学博士后,主要从事生化药物的开发研究。 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1.5 藻蓝蛋白 (C 2 PC) 和别藻蓝蛋白(APC)的纯 度的HPLC鉴定 纯化的C2PC和APC分别上样于HPLC Su2 perdex 75预装柱,100 mmol/ L磷酸盐缓冲液 (pH 值 7. 0) 洗脱,流速1 ml/ min ;纯化的CPC 和APC分别上样于HPLC Resource Q 1 ml预装 柱,100 mmol/ L磷酸盐缓冲液 (pH 值7. 0 ,含0. 1 mol/ L NaCl)为初始缓冲,0. 11 mol/ L NaCl梯度 洗脱。 1. 6 SDS2PAGE 参照文献6 ,4 %浓缩胶,12 %分离胶,考马斯 亮蓝染色。 1. 7 等电聚焦 平板电泳采用Phamacia公司的phastGel IEF39 ,具体操作参照phastsystem仪器手册说 明,考马斯亮蓝染色。圆盘电泳参照文献的方法, 聚焦完毕后切下胶条的兰色条带,用10 mmol/ L KCl抽提1 h ,酸度计测定的pH值即为样品的等 电点。 1. 8 氨基酸组成分析 纯品分别经酸解,于HP1050型高效液相色谱 仪测定。 1. 9 光谱分析 样品溶于100 mmol/ L pH值7. 0的磷酸盐缓 冲,吸收光谱用紫外可见分光光度计扫描;室温荧 光发射光谱用荧光分光度计测定,激发波长分别为 365 nm和580 nm ,狭缝10 nm。 1. 10 质谱测定分子质量 彻底脱盐后的冻干样品,用1946A MSD(美国 安捷伦公司)四极杆质谱仪测定 2 实验结果 2. 1 藻胆蛋白的分离纯化及纯度鉴定 盐生隐杆藻的水溶性蛋白提取液经硫酸铵分 级沉淀后上样于DEAE2Sepharose Fast Flow柱,梯 度洗脱时首先有一深蓝色主峰出现,为藻蓝蛋白, 后又有一淡蓝色峰,为别藻蓝蛋白,换用高盐后洗 脱出杂蛋白峰(图 1) 。收集的藻蓝蛋白经羟基磷 灰石柱层析,在50100 mmol/ L磷酸盐浓度时洗 脱出深蓝色主峰,再经Sephacryl S2200柱层析得 到一对称的主峰,即为藻蓝蛋白纯品;别藻蓝蛋白 经羟基磷灰石柱层析,在150200 mmol/ L磷酸 盐浓度时洗脱出淡蓝色主峰,再经Sephacryl S2200 柱层析得到一对称的主峰,即为别藻蓝蛋白纯品。 各级分离提纯结果,总结如表1。 Fig 1 DEAE2Sepharose FF column chromatography of puri2 fied C2PC and APC fromA phanothece halophytica Tab 1 Purification of C2PC and APC fromA phanothece halophytica Step Absorption ratio of CPC (A620/A280) Absorption ratio of APC (A650/A280) Extract1. 00. 6 Salting out1. 91. 2 Chromatography on DEAE2Sepharose FF 4. 02. 3 Chromatography on hydroxylapatite 5. 03. 7 Chromatography on Sephacryl S2200 5. 55. 0 分离的C2PC和APC经HPLC Superdex 75凝 胶层析和Resource Q柱层析均得到单一的对称峰 (图2和图 3) 。 Fig 2 Superdex 75 column chromatography of purified C2PC and APC fromA phanothece halophytica 83 药物生物技术第11卷第1期 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. Fig 3 Resource Q column chromatography of purified C2PC and APC fromA phanothece halophytica 2. 2 藻胆蛋白的光谱特性 纯化后的盐生隐杆藻C2PC和APC经紫外可见 分光光度计扫描,最大吸收峰分别位于617 nm和 651 nm(图4) ;激发波长365 nm时,室温荧光发射峰 分别为654 nm和669 nm(图5) ,激发波长580 nm 时,室温荧光发射峰分别为645 nm和664 nm。 Fig 4 Absorption spectra of C2PC and APC fromAphanothece halophyticadissolved in phosphate buffer solution(pH7.0) 2. 3 藻胆蛋白的生化特性 纯化后的盐生隐杆藻藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白 经聚丙烯酰胺凝胶电泳得到单一条带。12 %的 SDS2PAGE显示(图6) ,藻蓝蛋白由和两种亚 基组成,以标准分子质量蛋白(分子质量分别为 14 400 u ,20 100 u ,31 000 u ,43 000 u ,62 000 u , 97 400 u)做比较,测得分子质量分别为15 667 u Fig 5 Room2fluorescence emission spectra of CPC and APCfrom Aphanothece halophyticadissolved in phosphate buffer solution (pH value7.0) . Excition wavelength was 365nm. Lane1 ,4 :Marker (14. 4 ,20. 1 ,31 ,43 ,62 ,97. 4ku) ;Lane2 ,5 :C2PC; Lane3 ,6 :APC Fig 6 SDS2PAGE of purified C2PC and APC fromA phan2 othece halophytica. 和18 197 u ,别藻蓝蛋白主要由和两种亚基组 成,分子质量分别为14 894 u和17 378 u。由以上 亚基推算藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白单体的分子质量 分别为33 864 u和32 272 u ,由质谱测得分子质量 分别为38 014 u和36 432 u(图7和图 8) 。C2PC 93欧 瑜等:盐生隐杆藻藻胆蛋白的分离纯化和特性研究 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 和APC的平板等电聚焦结果见图9 ,等电点分别 约为4. 6和4. 8 ,圆盘等电聚焦的结果相同。酸解 样品后氨基酸分析结果表明,C2PC和APC分别含 有17种氨基酸。 Fig 7 Electrospray ionization2mass spectrum of C2phycocyanin monomer fromA phanothece halophytica.The molecular mass of andsubunit is derived from the deconvoluted spectrum Fig 8 Electrospray ionization2mass spectrum of Allophycocyanin monomer fromA phanothece halophytica.The molecular mass of andsubunit is derived from the deconvoluted spectrum Lane1 :APC ,Lane2 :Marker(pH 8. 65 ,8. 45 ,8. 15 ,7. 35 ,6. 85 ,6. 55 , 5. 85 ,5. 2 ,4. 55 ,3. 5) ,Lane3 :C2PC Fig 9 Isoelectric focus of C2phycocyanin andAllophy2 cocyanin fromA phanothece halophytica Tab 2 Amino acid composition of C2PC and APC from A phanothece halophytica Amino acid C2PC (pmol/ l) APC (pmol/ l) Amino acid C2PC (pmol/ l) APC (pmol/ l) Asp529475Cys2Cys1743 Glu441350Val167248 Ser155154Met9413 His4371Phe8045 Gly219250Ile152160 Thr157143Leu291214 Arg163144Lys7065 Ala410307Pro550160 Tyr119121TrpNDND 3 讨 论 蓝藻的藻胆蛋白主要包括藻蓝蛋白和别藻蓝 蛋白,其中藻蓝蛋白为C2藻蓝蛋白,某些蓝藻还存 在少量藻红蛋白1。从目前的文献报道看,对于藻 胆蛋白,蓝藻中研究最多的是螺旋藻(Spirulina ) , 其它的还有鱼腥藻(A nabaena sp) 、 念珠藻(Nostoc sp) 、 聚球藻(Synechococcus sp) 、 聚胞藻( Syne2 chocystis)、 隐球藻(A phanocapsa)、 层理鞭枝藻 (Mastigocladus laminosus)、 优雅粘囊藻(Myx2 osarcina concinna)等,但尚未见有关盐生隐杆藻 (A phanothece halophytica)藻胆蛋白的报道。本文 通过对藻胆蛋白分离方法的改进,成功地从盐生隐 杆藻中分离纯化到藻蓝蛋白 (C 2 PC) 和别藻蓝蛋白 (APC) ,其纯度达到一般的认可标准 7 。和大多数 蓝藻一样,盐生隐杆藻的C2PC的量较多,APC的 量较少。 天然的C2PC和APC的每个单体均含有两个 亚基,发色团均为藻蓝素,即分子质量约600u的开 链四吡咯环化合物。C2PC有3个发色团,即 2 Cys84、 2 Cys82和 2Cys155,APC有2个发色团,即 04 药物生物技术第11卷第1期 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 2 Cys84、 2Cys84,通常从藻体分离出的C2PC和 APC稳定聚集态是( )3,当浓度过低,或外界条件 变化,如低离子强度、 极端pH ,三聚体会解聚成单 体,其光谱特性也随之变化2 ,8 ,9。分离的盐生隐 杆藻C2PC和APC ,其光谱特性和已报道的蓝藻基 本一致。 用SDS2PAGE和质谱测定的C2PC和APC单 体的分子质量有些差别,与其它的蓝藻如螺旋藻等 也不完全一致,这可能是不同的实验方法及实验中 的误差造成。 从C2PC和APC的氨基酸组成来看,C2PC所 含的酸性氨基酸 (Asp 和 Glu) 与碱性氨基酸 (Arg 、 Lys和 His) 之比略高于APC ,因此其pI值应略低 于APC ,这与实验的测定值相符。另外,值得一提 的是,用标准等电点蛋白做对照测得的C2PC和 APC的pI均与圆盘等点聚焦的结果一致,因此对 于色蛋白,直接测定聚焦后色带的pH值,不失为 一简捷的方法。 参考文献 1 Padyana AK,Bhat VB ,Madyastha KM ,at al. Crystal structure of a light2harvesting protein C2phycocyanin fromSpirulina platensisJ .Biochem Biophys Res Commun, 2001 ,282 :893. 2 王仲孚,赵谋明,彭志英,等.藻胆蛋白研究 J .生命的化学, 2000 ,20(2) :72. 3 Vernon TOI ,Glazer AN. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and moleculesJ .J Cell Biol,1982 ,93(3) : 981. 4 Glazer AN. 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Purification and Characterization of Phycobiliprotein fromAphanoth2 ece Halophytica OU Yu ,DONGJian ,WU Wu2tong ( Department of Biopharmary , China Pharmaceutical University , Nanjing210009, China) Abstract Two types of phycobiliproteins ,C2phycocyanin(C2PC) and allophycocyanin(APC) were separated from crude extracts ofA phanothece halophyticasuccessively by solid ammonium sulphate precipitating , DEAE2Sepharose Fast Flow chromatography ,hydroxylapatite chromatography and Sephacryl S2200 chromato2