羊肚菌胞外多糖免疫活性研究.pdf

中国食用菌2 0 0 9 ，2 8 ( 3 ) ：4 7 - - 4 9 E D I B L EF U N G lO FC H I N A C N 5 3 - - 1 0 5 4 Q I S S N10 0 3 8 310 羊肚菌胞外多糖免疫活性研究冰 张利平1 ，陈彦1 料，王子尧1 ，祝庆军1 ( 1 安徽大学生命科学院，安徽合肥2 3 0 0 3 9 ；2 安徽医科大学基础医学院安徽合肥2 3 0 0 3 2 ) 摘要：从羊肚菌发酵液中提取多糖并分析其基本生化特征，研究羊肚茼胞外多糖对小鼠免疫功能的影响，结果表明， 羊肚茵多糖为蛋白多糖，其总糖含量为8 5 3 、蛋白含量为8 5 、酸性多糖含量为2 5 ，该多糖可促进小鼠胸腺指数 和脾指数提升，增加血清溶茵酶含量，提高巨噬细胞吞噬能力。并能在体外促进T 淋巴细胞增殖及巨噬细胞N O 量增 加，作为一种蛋白多糖，羊肚菌多糖可以显著增强小鼠的非特异性免疫及细胞免疫。 关键词：羊肚菌；多糖；免疲调节；巨噬细胞：淋巴细胞 中图分类号：$ 6 4 6 9 文献标识码：A 文章编号：1 0 0 3 3 3 l O ( 2 0 0 9 ) 0 3 - - 0 0 4 7 帕 I m m u n o l o g i c a lA c t i v i t i e so fP o l y s a c c h a r i d ef r o mM o r c h e l l ae s c u l e n t a ( L ) P e r s Z H A N GU - p i n g 2 ，C H E NY a n l ，W A N GZ i - y a o 。Z H UQ i n 2 - - j u n l ( 1 S c h o o lo f l i f eS c i e n c e ，A n h u iU n i v e r s i t y ，H e f e iA n h u i2 3 0 0 3 9 ； 2 P r e c l i n i c a lM e d i c i n eC o l l e g eo fA n h u iM e d i c a lU n i v e r s i t y H e f e iA n h u i2 3 0 0 3 2 ) A I 搭 t r a e t ：T h ee f f e c to fp o l y s a c c h a r i d e sf r o mM o r c h e l l ae s c u l e n t a ( L ) P e r u ( M E P ) o ni m m u n o l o g i c a lf u n e t i o nw a si n v e s t i - g a t e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tM E P i sak i n do fp m t e o g l y c a n I th a sat o t a ls u g a ro f8 5 3 a n dt h ep r o t e i nl e v e lr e a c h e d8 5 T h ec o n t e n to fM d u m n i ca c i di nM E Pi s2 5 ME Pc a ni n c r e a s et h el e v e lo ft h y m u si n d e xa n ds p l e e ni n d e x ，t h ec o n t e n to f 8 , r u ml y s o z y m e a n dc a np r o m o t ep h a g o c y t o s i sa n dN Ol e v e lo fm a c m p h a g e I tc a na l s oe n h a n c ep r o l i f e r a t i o no fT l y m p h o c y t ei n v i t r o A sap r o t e o g l y c a n ，M E Pc a l le n h a n c en o n s p e c i f i ci m m u n i t ya n dc e l l u l a ri m m u n i t yi nm i c e K e yw o r d s ：M o r c h e l l ae s c u l e n t a ( L ) P e t s ；P o l y s a e c h a r i d e s ；I m m u n o l o g i c a lr e g u l a t i o n ；M a c r o p h a g e ；L y m p h o c y t e 羊肚菌隶属子囊菌亚门、盘菌纲、盘荫日、羊肚菌 科、羊肚菌属。 本草纲目有对羊肚菌化痰理气、补 肾、补脑提神等功效的描述同时现代研究也发现羊肚菌 富含稀有氨基酸等营养成分。具有增强免疫力口l 、抗疲劳、 抗肿瘤、对急性肝损伤彳f 保护作用等H 保健效果：但对于 羊且f 菌的具体活性成分及j 七作_ f j 机理的研究目前仍不多 见，这在一定程度I ：限制了羊肚菌的应用和开发。 本研究着重关注羊肚菌的活性成分鉴于多糖是真菌 类常见的免疫活性组分选取羊肚菌5 6 9 作为实验对象 研究其多糖组分在体内外对动物免疫功能的影响为羊肚 菌活性研究的深化及应用奠定基础。 l 实验材料 1 1 实验材料 羊肚菌5 6 9 采购于广东省微生物研究所菌种保存中 心；昆明种小鼠体晕( 2 0 2 ) g ，雌雄不拘，清洁级 由安徽医科大学实验动物巾心提供。 1 2 实验试剂 R P M I l 6 4 0 千粉培养基购于美国G i b c o 公司：新生牛 血清购于美I qH y c l o n e 公司；- 甲基哑砜( D M S O ) 购于美 陶A m e r s c o 公司：溶菌酶试刺盒购于南京建成乍物T 程研 究所；刀移蛋自( C o nA ) 、脂多糖( L P s ) 及噻唑蓝 ( M 1 T r ) 均为美国S i g m a 公司产品。其余试剂均为国产分析 纯。 1 3 实验仪器 U V 一2 1 0 0 紫外，可见光分光光度计( 尤尼柯上海仪器 有限公司) ；C K X 4 1 倒置显微镜( 日本O l y m p u s 公司) ； C O 1 5 0 二氧化碳堵养箱( 美国N B S 公司) ；S u n r i s e 酶联 免疫检测仪( 瑞卜T e f - a n 公司) 。 I A 羊肚菌多糖分离及纯化 羊肚菌经P D A 培养基、种子培养基、发酵培养基依 次扩大培养后收集发酵液，将发酵液以O 2 2 恤m 的滤膜过 滤后经旋转蒸发仪器浓缩，浓缩液4 醇沉2 4h 后离心 项目来霹：安徽省自然科学基金资助( N o 0 7 0 4 1 3 1 4 3 ) ， 作者简介：张利平( 1 9 8 1 一) 女硕十在读研究方向为糖分子生物学与糖r 程。E m a i l ：z l p 0 5 6 3 s i n a 咖 通讯作者：陈彦男硬导。E - m a i l ：j e s w a h u e d u c n 收稿日期：2 0 0 9 ) 2 2 6 万方数据 4 8 中同食用菌E D I B L EF U N G IO FC H I N A V 0 1 2 8 N o 3 f 1 0r a i n 。60 0 0r r a i n 叫) 收集沉淀l ”。沉淀溶干水后以S c r a g 试剂去除蛋白质并透析去除小分子，冷冻干燥得到羊肚菌 粗多糖。将粗多糖溶解于适量p H7 2 ，0 0 2t o o l L 一的P B S 溶液中。过D E A E S e p h a r o s eF F 柱( 2 6c m x 5 0c m ) ，并以 1t o o l L 。N a C I ( p H7 2 O 0 2t o o l L “的P B S 配制) 洗脱， 流速为lm L r a i n 一苯酚一硫酸法跟踪检测收集含糖部分。 冻干得淡黄色粉末为羊肚菌胞外多糖( M E P ) 。 2 实验方法 2 1M E P 理化性质检测 检测M E P 在水及乙醇、丙酮等有机溶剂巾的溶解性； 斐林试剂反应；F e C ! ，反应；M o l i s h 反应；硫酸一咔唑反 应；苯酚一硫酸法检测总糖含量；考马斯亮蓝法测蛋F 1 含 量；硫酸一咔哗法测糖醛酸含量；检测M E P 水溶液在1 9 0 n m 。7 0 0n m 波长范闻内的吸收峰1 6 1 。 2 2 体内免疫活性检测 将小鼠随机分为3 组每组1 0 只。其巾阴性对照组 每F 1 腹腔注射生理盐水0 2m L ；M E P 低剂量组和岛剂培 组每天分别给予1 0m g k g 一、2 0m g kg - J 药蛙均为腹腔 注射给药1 0d 后进行免疫功能检测m 2 2 1 M E P 对小鼠睥脏指数和胸腺指数的影响 末次给药1 2h 后处夕匕小鼠称体重及胸腺、脾脏质 量，以胸腺、脾脏质量( m g ) 和体质量( g ) 之比乘以1 0 3 作为胸腺指数和脾指数，观察M E Px 寸J , 鼠免疫器官自无 明显刺激作用。 2 2 2M E Px , t d , 鼠I f 【清溶菌酶的影响 小鼠眼球摘除取血30 0 0r m i n 一离心1 0r a i n ，取O 2 m L 血清检测I f I 【清溶菌酶含量 2 2 3M E P 对巨噬细胞存噬能力的影响 小鼠处死前3 0m i n 腹腔汴射lm L5 鸡血悬液轻 揉腹部。，处死小鼠后制备腹腔液涂片，3 7 恒温干燥3 0 m i n 后片I 比例l ：l 的丙酮、甲醇溶液I 古1 定1 0m i n ，G i m e s a 染液染色1 0r a i n 后蒸馏水漂洗、晾十，往艟微镜下观察。 每张标本片汁数1 0 0 个巨噬细胞计算卜噬细胞的吞噬白 分率及乔噬指数其中存噬率为吞噬鸡红细胞的巨噬细胞 在所存f i 噬细胞巾所占的比例，吞噬指数为存噬鸩红细胞 的所有巨嘴细胞平均乔噬的细胞数| 8 I 。 2 3 小鼠脾淋巴细胞分离及培养 小鼠断颈处死后无菌取脾制成细胞悬液。3 7 培养 2h 3h 去除贴擘细胞收集未贴壁细胞悬液即得纯化的 脾脏淋巴细胞。培养2 4h 后，采用尼龙毛( 聚酰胺纤维) 法分离T 淋巴细胞及B 淋巴细胞，而后片JP R M l l 6 4 0 ( 含 l O F C S ) 堵养液将细胞桁度调至约I 1 0 6 个m I ，培养 基中分别加入刀L ，蛋F 1 及脂多糖，终浓度各为l Op g m L - 。 2 4 脾淋巴细胞转化实验 纯化的淋巴细胞、T 淋巴细胞和B 淋巴细胞分别接种 于9 6 孔培养板。加M E P 使多糖终浓度分别为1 0 斗g mL _ I 、 3 0 峙m L 、5 0 斗g m L 、1 0 0o , g m 1 ，每个浓度没置5 个复孔同时没阴件对照孔。3 7 。5 C O ：培养4 8h ，每 个培养：f L ) m 入l O 斗L 四氮唑盐( M 1 T r ) 5m g m L _ 继续培 养4h ，离心弃上清每孔加入1 0 0w LD M S O ，摇床低速 震荡1 0r a i n 后以酶标仪检测符孔A w ， 2 5M E P 对巨噬细胞一氧化氮的影响检测 向小鼠腹腔| f I 注射5m L 无菌P B S 腹部按摩5r a i n 后将小鼠处死抽取腹腔液离心，收集巨噬细胞加入 P R M1 1 6 4 0 使细胞悬浮，3 7 培养2h 后去除培养基并以预 冷的P B S 洗去悬浮细胞。重新加入新的堵养基后，以细胞 刮刀刮取贴壁的巨噬细胞使之重新悬浮并调整细胞密度在 每毫升1 0 ，c e l l s 。将H 噬细胞接种于4 8 孔板，加入M E P 使其终浓度分别为1 0 “g m L 、3 0 斗g m L 、5 0 g mL _ l 、 1 0 0 “g m L - - ，每个浓度设5 个复孔，同时设置阴性对照 孔。4 8h 后每孔取1 0 0 斗L 上清液检测N O 含量。 2 6 数据分析 实验数据采用S P S S l 3 0 统计软件统计处理，组问差 异以p O 0 5 表爪差异显著p O O l 表示差异极显著。 3 结果及分析 3 1M E P 理化性质检测 M E P 町溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂；与斐 林试剂及F e C I ，反应为阴性说明j 不含单糖和多酚类物 质：M o l i s h 反应为阳件表明其为典型的糖类物质；硫酸一 咔唑反应显阳性表明j e 含有糖醛酸；对M E P 的紫外扫 描娩爪其尤蛋白吸收峰及核酸吸收峰表明其不含蛋门及 核酸等杂质：经检测M E P 总糖含馈为8 5 3 、蛋白含量 为8 5 、酸性糖含瞳为2 5 为蛋f 1 多糖。， 3 2M E P 对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响 M E P 埘小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响见表l 。 表lM E P 对小鼠免疫器官重址的影响( n = l o ) 注：与对照组相比 0 0 5 ，+ 0 O I 。 腹腔注射M E P 可显著升高小鼠脾脏和胸腺的晕量， 和对照组相比差异檄显著。表明M E P 有较明显的免疫促 进作朋： 3 3M E P 对小鼠血清溶菌酶的影响 M E Px t , l 、鼠血清溶菌酶的影响见表2 。 裹2M E P 对血清溶蕾的影响加= lo ) 注：与对照组相比 0 0 5 O 0 l 。 溶菌酶是参与机体1 乍特异性免疫的重嗄绀分M E P 对血清溶茼酶活力的显著促进，表明了它能激活并提高小 鼠的非特锌性免疫反应 3 4M E P 对巨噬细胞吞噬能力的影响 M E P 对臣噬细胞芊宇噬能力的影响I 见表3 。 和I f 照组卡H 比低剂k tM E P 可显著促进臣噬细胞的 吞噬率和存噬指数，而高剂h tM E PI f 这二者钉极显著的 促进作用表明M E P 可促进小鼠非特异性免疫的增强。 3 5 淋巴细胞转化实验 万方数据 第2 8 卷第3 期 张利平等：羊肚菌胞外多糖免疫括性研究 4 9 袭3M E P 对巨噬细胞吞噬率的影响( n = l o ) 组别 给药址，m g k g 一1 存噬率吞噬指数 注：与对照组相比 O 0 5 ，p o o l 。 M E P 对脾脏淋巴细胞增殖率的影响地表4 。 对脾脏细胞多糖的M 1 r r 实验表明M E P 对B 淋巴细 胞无明娃促进作蹦，而对纯化的淋巴细胞和T 淋巴细胞均 有非常明显的增殖促进作用。以上的实验结果表明M E P 在体外有较为明显的细胞免疫活性。 同时研究发现M E P 在体外对细胞作用时，并非浓度 越高越佳。而是存在一个最佳作用浓度为5 0 嵋m L ，该 褒4M E P 对脾脏淋巴细胞增殖率的影响( n = 5 ) 组别给药垡t r g mL _ I纯化的淋巴细胞A mT 淋巴细胞A mB 淋巴细胞A 。 对照组 给药组I 给药组2 给药组3 给药组4 0 1 0 3 0 5 0 1 0 0 0 2 3 I ( 1 0 1 2 O 2 8 9 o 0 0 6 。 0 31 4 ：t - 0 0 0 8 。 O 39 I 口O 0 0 3 ” 0 1 3 2 2 0 0 ll 。 O 2 3 5 o 0 15 0 3 2 4 i - 0 0 1 0 。 0 4 l O o 0 0 9 。 0 4 3 6 M ) 7 。 O 3 7 2 o 0 0 8 。 0 2 3 0 0 0 0 9 O 2 3 5 o 0 1 3 O 2 3 3 _ + 0 O c r 7 O 2 4 2 土0 ( ) 【) 6 0 2 4 3 o 0 0 7 注：与对照组相比印 0 0 5 印 o O l 。 现象符合多糖的常规活性特点：多糖一般有一个最佳剂量 值。超过或低于最佧剂量，多糖的活性都会降低，这一点 和常规免疫渊节药物是不h d 的I I o l ， 3 6M E P 对巨噬细胞N O 的影响 M E P 对巨噬细胞N O 的影响见表5 。 寰5M E P 对巨噬细胞N O 的影响( n - I O l 注：与对照组相比 0 0 5 ”P 0 O l 。 作为一种露要的效应分子，N O 在活化的巨噬细胞抗 肿瘤及抗菌活性的发挥巾都起着重要作用，它可以增强眄 噬细胞的存噬能力及非特异性免疫，表5 显示M E P 可增 加巨噬细胞N O 产量，其最佳作用浓度为3 0 斗g m L 。町 以推测M E P 是通过激活巨噬细胞内的信号转导途径来 影响细胞N O 产量的。 4 讨论 羊肚菌在中医历史上的应用南来已久，但对作为其重 要活性成分的多糖组分的研究仍然有待深入。本实验对羊 肚菌多镛住体内和体外的免疫调节作用进行r 研究发现 其在体内n 增加胸腺指数及脾指数、F 噬细胞吞噬指数： 在体外可提高T 淋巴细胞增殖牢，这表明羊肚菌多糖对T 淋巴细胞增殖及R 噬细胞的吞噬能力有明显的促进作用。 同时，羊月t 菌多糖在体外可以日J j 显增加n 噬细胞N O 的含 量。由此可见无论是体内实验还是体外实验羊肚菌多 糖对于机体免疫能力都钉明显的增强作用。此外羊肚菌 多糖在体内可提岛畹清溶菌酶含量。溶菌酶还可与带负电 荷的病毒蛋r 直接结合使病毒失活是机体非特异性免疫 的重要组成鄙分。，羊肚菌多糖对血清溶菌酶含蜮的提升改 善r 机体的免疫能力同时也是其F 身免疫活性的又一体 现。综七所述羊肚菌多糖具有显著的免疫活性主要表 现在对细胞免疫的增强和对非特异性免疫的促进这两方 面。 同前羊肚菌的药理活性已经受到人们的重视并已有 相关保健品J | 市。但南于对其主耍作j j 机理的研究仍仃在 局限，其应用也受到一定的限制，具有良好药理活性的羊 肚荫多糖也l l i 】样有待进一步丌发应用。本实验将进一步深 入研究羊且1 菌多槠的组成及结构以便深入揭，J ；其作H j 机 理并促进J f 发应用。 【参考文献】 l lJ 李华包海鹰李玉羊肚黹研究进展【J 】菌物研究，2 0 0 4 ，2 ( 4 ) ：5 3 6 0 【2 l 孙晓明，张卫明羊肚菌免疫调节作用研究【”巾国野生植物资 源2 0 0 I 2 0 ：1 2 1 3 1 3 1 乍娟，F 臻，姚良同，等羊肚菌多糖研究进展【J 】微生物学杂 志，2 0 0 5 2 5 ( 4 ) ：8 9 - 9 1 【4 1 孙玉军陈彦，周丽伟羊肚菌胞内多糖对小鼠急性肝损伤的影 响【J 】巾困食丌J 菌，2 0 0 8 2 7 ( 2 ) ：4 l - 4 5 【5 】C h e nI t a i x i a , Z h a n gM i n ，X i eB i j u n C o m p o n e n t sa n da n t i o x i d a n ta c - t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d ec o n j u 弘t ef r m n 妒”nt e aL J J F o o dC h e m i s t r y ， 2 0 0 5 ，9 0 ：1 7 2 1 1 6 1 孙玉军，陈彦周f I | i 伟羊肚菌胞内多糖M E P - 的分离纯化及其 性质分析lJ 1 食J 谩j 发酵T 业。2 0 0 7 3 3 ( 1 2 ) ：4 4 4 7 【7 1 李俊，黄艳。廖日权等罗汉果多槠对小鼠免疫功能的影响【J 1 巾瑚药理学通报2 0 0 8 2 4 ( 9 ) ：1 2 3 7 - 1 2 4 0 1 8 1W a n gJ i n g