摄食人工和天然饵料刺参消化道海藻多糖酶活力的比较.pdf

摄食人工和天然饵料刺参消化道 海藻多糖酶活力的比较 安军 于书渤 大连水产学院农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室 (116023) E-mail：anjun1978 yushubo1979 摘 要：摘 要：采用盐析的方法从摄食人工和天然饵料刺参消化道中提取海藻多糖酶，利用 3，5- 二硝基水杨酸（DNS）法分别测定褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶的活力。结果表明，摄食人 工和天然饵料刺参的消化道中均存在褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶，并且每种酶的活性没有 明显的差别，褐藻胶酶活最高，卡拉胶酶和琼胶酶的活性几乎相等。 关键词:关键词: 刺参；褐藻胶酶；卡拉胶酶；琼胶酶 引引 言言 刺参是北方,特别是大连、山东等地的主要养殖种类，近年来刺参养殖业得到了迅速的 发展。随着海参养殖规模的不断扩大，其有限的天然饵料已不能满足实际生产的需要。因此 应用人工配合饵料投喂海参已成为一种必然的趋势， 但由于海参营养学研究目前尚处于起步 阶段，养殖饵料的配制缺乏依据标准，人工饵料只有成分与配比的合理，才能被很好的吸收 和利用。海参的天然及人工饵料中，海藻多糖是其主要的能量来源，有必要对其消化道中的 海藻多糖消化酶进行分析与测定。 有不少以藻类为食的动物， 从它们的消化道中可获得海藻解壁酶， 用于海藻细胞的解离， 获得其单细胞和原生质体 1， 唐延林首次发现并使用海螺酶分离培养了圆紫菜的原生质体2。 海参的食性较广，海藻也是其主要的食物。目前海藻解壁酶的来源主要包括石鳖，鲍鱼，海 兔以及螺类等 3,5，而来源于棘皮动物海参的海藻解壁酶尚未见报道。作者以摄食人工和天 然饵料刺参为材料， 采用盐析的方法提取其消化道的粗酶液， 利用 3， 5-二硝基水杨酸 （DNS） 法测定褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶的活性，为海参人工饵料配制以及拓展海藻解壁酶的酶 源生物提供理论依据。 1.材料和方法材料和方法 1.1 材料处理材料处理 2005 年 4、5 月份从大连拉树房投喂人工配合饵料和摄食天然饵料的两个养殖厂采集规 格大小一致的海参，用保温瓶尽快带回实验室，置于冰盘内剖解，取其消化道，用预冷的蒸 馏水冲洗干净，置于低温冰箱存放备用。 1.2 酶液的提取酶液的提取 用玻璃匀浆器将样品充分研磨，加入适当倍数的预冷蒸馏水，于 4、4500rmin 离心 - 1 - 30min，取出上清液在冰浴搅拌下加入固体硫酸氨至饱和，均匀溶解后静置 30min，于 4、 4500 rmin 再次离心 15min，弃去上清液，将沉淀物转移到半透膜袋中，扎好后放入冰浴 的蒸馏水中透析，每隔 2-4 小时换一次水，用 10的氯化钡进行检测硫酸氨，直到硫酸氨 透析完为止，最后将透析好的酶液用预冷的蒸馏水定容至 25ml，放入 4冰箱备用。 1.3 酶活力的测定酶活力的测定 利用 3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力6，7。褐藻酸酶以葡萄糖制备标准曲 线，琼胶和卡拉胶以半乳糖制备标准曲线，分别以缓冲液制备不同的酶解底物，设置 3 个平 行，40反应 30min，水解产物的还原糖用 DNS 法来测定，并以 1ml 的灭活酶液代替酶液做 为空白对照。三种酶活力的测定的条件见表 1 表 1 三种酶活力的测定条件 Tab.1 The requirements for determining enzyme activity 酶 底物 缓冲液 褐藻胶酶 1褐藻酸钠溶液 巴比妥钠-盐酸缓冲液,PH=7.6 卡拉胶酶 0.5卡拉胶溶液 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,PH=7.4 琼胶酶 0.5琼胶溶液 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液,PH=7.4 2. 结果结果 摄食人工和天然饵料刺参消化道中褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶活力测定结果见表 2 和表 3。 表 2. 摄食人工饵料刺参肠道中褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶酶活力 (uml) （平均值标准偏差） Tab.2 Activites of algalase, carrageenase, agarase extracted from digestive tract of Apostichopus japonicus eating artificial diets（AverageStandard deviation） 1 2 3 褐藻酸酶（n=3） 140.814.21 178.61 7.82 150.20 6.34 卡拉胶酶 （n=3） 25.10 2.01 20.781.91 18.301.62 琼胶酶 （n=3） 18.601.69 21.111.98 20.52 1.86 注：表中的 1、2、3 代表试验重复次数 表 3. 摄食天然饵料刺参肠道中褐藻胶酶、卡拉胶酶、琼胶酶活力 (uml) （平均值标准偏差） - 2 - Tab.3 Activites of algalase、carrageenase、agarase extracted from digestive tract of Apostichopus japonicus eating natural diets（AverageStandard deviation） 1 2 3 褐藻酸酶（n=3） 135.625.31 192.568.83 143.076.56 卡拉胶酶 （n=3） 25.342.96 29.003.21 21.251.82 琼胶酶 （n=3） 20.002.35 19.251.67 18.921.82 注：表中的 1、2、3 代表试验重复次数 由表 2 和表 3 可知摄食人工和天然饵料刺参消化道内均存在褐藻胶酶、 卡拉胶酶、 琼胶 酶，并且每种酶的活性没有明显的差别，褐藻胶酶活最高，卡拉胶酶和琼胶酶的活性几乎相 等，仅为褐藻胶酶的 1/5-1/10。 3.讨论讨论 一些海洋动物通过其消化道中的海藻多糖酶来利用海藻资源获得能量8，海藻多糖酶 的活力与酶源动物的食性密切相关。 植食性的朝鲜花冠小月螺的海藻多糖酶的活性大于兼食 性的单齿螺， 后者大于肉食性的犹荔枝螺9。 刺参胃含物中植物的重量占绝对的优势10， 张宝琳等检查了灵山岛海岩礁区的 20 头刺参的胃含物，发现藻类出现的几率是 10011， 本研究表明，摄食含有褐藻（鼠尾藻）的人工配合饵料和摄食天然饵料的刺参消化道中均存 在褐藻胶酶、 卡拉胶酶、 琼胶酶， 并且每种酶的活性没有明显的差别， 褐藻胶酶的活性最高， 说明海参摄食有一定的选择性，刺参喜欢摄食褐藻如：鼠尾藻等。孙奕等对刺参肠道内微生 物的组成及其生理特性进行了系统研究， 结果表明， 刺参肠道内具有降解褐藻胶活性的细菌 占细菌总数的 90以上12，说明细菌在海参消化的过程中也起了一定的作用，可以协助 刺参降解褐藻多糖。总之，海参能够很好的利用褐藻多糖，所以在生产实践中，海参的人工 饵料中有较高含量的鼠尾藻粉。 海参消化中有很高活性的褐藻胶酶， 表明褐藻胶酶在海参消 化生理学上的重要性。因此我们建议可以研制褐藻多糖功能性饵料，来提高饵料的利用率， 减少污染。 动物源海藻解壁酶是复合酶，主要成分有纤维素酶，褐藻酸酶、琼胶酶、-葡萄糖苷 酶、壳多糖酶等13，其活力及成分与动物的种类密切相关1 。刘万顺等研究了紫贻贝、 滨螺消化酶对三角褐指藻和啤酒酵母的去壁作用,制备出大量酵母原生质体和去除大部分三 角褐指藻细胞壁的细胞14。 余长缨等从石鳌和帽贝的消化腺中提取了混合消化酶， 通过对 19 种青岛海滨常见藻类酶解效果的比较发现，该酶对各种藻类均有一定的解离作用，尤其 对红藻效果好，对绿藻次之3。Clark 对新西兰鲍的内脏消化酶也进行了研究，测定了内 脏中 14 种多糖酶的活力，指出这些酶作为商业酶制剂的可能性。九孔鲍的内脏器官中也存 在着较高活力的褐藻胶酶、琼胶酶等消化酶7。据作者所知，目前动物源海藻解壁酶主要 - 3 - 来源于软体动物， 而棘皮动物海参的海藻解壁酶未见报道，然而，由于软体动物普遍个体 小，食性窄，分布不集中，生物量小，限制了动物源海藻解壁酶的广泛应用。作者研究表明， 刺参消化道中均存在褐藻胶酶、卡拉胶酶 和琼胶酶，可以作为一种新的海藻解壁酶酶源生 物进行深入的研究，有望获得具有更高酶活力和更大应用价值的海藻工具酶。 参考文献：参考文献： 1赵杨，张娜等.三种螺类来源的海藻解壁酶活力比较J厦门大学学报（自然科学版），2005，44（2）： 276278. 2 唐延林. 紫菜营养细胞和原生质体分离和培养J. 山东海洋学院学报，1982，12（4）:3750. 3 余长缨，沈颂东等. 从石鳖(Chiton sp.)和帽贝(Patella sp.)中提取海藻解壁酶的初步研究J.海洋通报， 2000，19（5）：9296 4 胡远皆.鲍鱼酶的制备和应用试验J.水产科技情报，2000，27（6）:256-258. 5 朱仁华.海螺酶解壁作用的研究J.山东海洋学院学报 ，1983，13（4）：4856. 6 中山大学生化教研室（主编）.生化技术导论M.北京：人民教育出版社，1978.5355. 7 吴永沛，何碧烟.九孔鲍褐藻酸酶、琼胶酶及纤维素酶的提取纯化J.海洋科学，2002，26（3）：47. 8 Lange B, Wingender J.Tsuruga H. Cloning and sequencing of a Delaya marina gene encoding for alginate lyaseJ. Arch. Microbiol. 1989, 152: 302-310. 9 朱仁华.三种海螺消化酶分解海藻胞壁的比较研究J.生物化学与生物物理进展，1982，2：4345. 10 常亚青等. 海参、海胆生物学研究与养殖M. 北京：海洋出版社，2004，9798. 11 张宝琳，孙道远等. 灵山岛浅海岩礁区刺参食性初步分析J.海洋科学，1995，（3）：1133. 12 孙奕等.刺参体内外微生物组成及其生理特性的研究J.海洋与湖沼，1989,20(4):300-307. 13 韩宝芹，刘万顺等.海藻解壁酶研究进展J.海洋科学，1997，3：4749. 14 刘万顺、李濒等. 海洋无脊椎动物消化酶的研究.紫贻贝、日本蟳、滨螺消化酶的初步分析及其应用 J.山东海洋学院学报 1988，18(1):5461. - 4 - Comparison of activities of polysaccharolytic enzymes from digestive tracts of Apostichopus japonicus eating natural and artificial diets AN jun，YU Shu -bo Key Laboratory of Mariculture and Biotechnology Agriculture Ministry, PRC,Dalian Fisheries University (116023) Abstract Algalase, carrageenase and agarase were extracted from digestive tracts of Apostichopus japonicus eating natural and artificial diets. The activites of them were determined with the method of 3，5dinotrosalicylic acid （DNS ）.The results indicate algalase, carrageenase and agarase exist in digestive tracts of Apostichopus japonicus eating natural and artificial diets and the activity Of each polysacc