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文档简介

2 0 1 2年第 4 l 卷第 2期 , 中 国 南 方 树 4 7 , J 一 、 t ; 研究简报 柑 桔 类 果树 1 l , 一 株产 生柚果汁脱 苦酶的青霉菌的筛选及初步鉴定 洒 威, 焦 迎 春, 尹 瑶, 元王 涛 ( 青海大学生物科学系 , 西宁 , 8 1 0 0 1 6 ) 摘要: 对堆积腐烂的唁溪蜜柚果皮富集的天然菌株进行分离, 以丙酮提取瑁溪蜜柚囊衣粉所得苦 味物为唯一碳源进行初筛, 以选择性液体发酵培养中对柚皮苷、 柠碱 、 诺米林等 3种苦味物质的分 解状况进行复筛, 从 2 9株产生脱苦酶的真菌中复筛出了5株脱苦能力较强的真菌。其中, 编号为 3 3 2 l的菌株具有较强的脱除蜜柚果汁苦味 的能力, 对柚皮苷、 柠碱和诺米林的分解率分别达 7 O 、 2 7 和 1 4 。经形态鉴定和营养缺陷培养鉴 定, 初步认 定该菌株为常现青霉 P e n i c i l l i u m f r e q u e n t a n s 。 关键词 : 真菌 ; 鉴 定; 脱苦 ; 柚 皮苷; 柠碱 ; 诺米林 中图分类号: T S 2 0 1 3 ; S 6 6 6 3 文献标志码 : A 文章编号: 1 0 0 7 1 4 3 1 ( 2 0 1 2 ) 0 2 0 0 4 7 0 3 柑桔果汁、 果酒等的加工中脱苦是重要的一环。 柚类果肉或果汁中的主要苦味物质柚皮苷 ( n a r i n g i n ) 、 柠碱( Y t 檬苦素 l i mo n i n ) 和诺米林( n o mi l i n ) 均 可通过微生物产酶将其分解为不苦的物质L 1 - 3 。相 对于目前脱 除柑桔类水果苦 味的 环糊精 包埋 法 4 、 树脂或活性炭等吸附法l_ 6 。 、 代谢法_ 8 物理脱 苦和代谢脱苦法等, 酶法 7 - 8 脱苦具有专一性强、 脱 苦效果好、 对营养成分无破坏 、 不影响( 或改变) 柑桔 汁风味、 成本低等优点, 是最理想和最具产业化应用 前景的方法。本文对前期分离获得的瑁溪蜜柚脱苦 酶生产真菌株进行复筛, 并用传统的真菌鉴定方法 对脱苦效果较好的菌株进行初步鉴定。 l 材料与方法 1 1 试验材料 菌种: 堆积腐烂的瑁溪蜜柚果皮富集 的天然菌 株, 经平板划线分离获得纯培养后 , 以苦味物粗品为 碳源配制选择性培养基 , 根据微生物的生长及菌落 的形态进行初筛获得。 主要试剂 : 柚皮苷 、 柠碱 和诺 米林标 准品 ( s i g ma 公司) , 甲醇、 乙腈 ( 色谱纯、 美国 TE D I A公司) , 丙 酮、 石油醚等( 分析纯) 。 主要仪 器: 1 5 2 5型高效液 相色谱 ( Wa t e r s公 司) 、 S y mme t r y C 1 8柱( 4 6 mmX1 5 0 mm, 3 5“ m) ( Wa t e r s公 司) 、 S NL 2 1 6 V 型 真 空 冷 冻 干 燥 机 ( T h e r r n o S a v a n t ) 、 D】 旧 5 - 2 2 3 J P 2 5显微 镜 ( 厦 门 Mo t i c 光学显微镜有限公司) 、 5 4 1 5 D小型高速离心 机( E p p e n d o r f C o I ) 、 AL P高压灭菌锅 ( AL P ) 、 S W- C J 一 1 2 F D型垂直净化工作 台( 上海浦东伟普净 化设备厂) 、 双层全温度培养摇床( 2 z 海智城分析仪 器制造有限公司) 、 F P G系列人工气候生化培养箱 ( 宁波莱福科技有限公司) 、 Y X Q- Z S - 3 0 S 1 1 立式压 力蒸汽灭菌器( 上海博迅实业有限公司) 等。 基础分 离培 养基: 马 铃薯 2 0 0 g L, 葡萄糖 2 0 g L , 琼脂 2 0 I , 自然 p H值l g 。 斜面保 存培养 基: 马铃薯 2 0 0 g L, 葡萄糖 2 0 g L , 琼脂 2 0 g L , 自然 p H值。 选 择 性 液 体 发 酵培 养 基 : Mg S O 47 H2 O 5 g L, K2 HP O 4 1 0 g L, K C1 5 g L,K N03 3 g L, N a C 1 2 g L , 苦味物丙酮提取液 1 0 mI I , 酵母膏 1 g I , p H值 6 0 。 选 择 性 固体 平 板 培 养 基 : Mg S O47 Hz O 收稿 日期 : 2 0 1 11 2 1 5 ; 修 回日期 : 2 0 1 20 1 1 1 基金项 目: 青海省科技厅科技成果转化项 目( 2 0 1 1 一 N一 5 1 2 ) 资助。 作者简介: 洒威( 1 9 6 7 一 ) , 男, 山东人, 本科, 副教授, 研究方向: 植物营养学。E - ma i l : s a w e i 3 6 9 9 s o h u c o rn 通信作者: 焦迎春( 1 9 7 3 一 ) , 女, 河北人, 硕士, 教授, 研究方向为微生物与微生物工程。E - m a i l : j y e _ 2 2 1 6 3 c o m。 4 8 中 国 南 方 果 树 2 0 1 2 年第 4 1 卷第 2期 _5 g L, K2 HP 0 4 1 0 g L, K C 1 5 g L , K NO a 3 g L, N a C l 2 g L , 苦味物丙酮提取液 1 O n 1 L L, 酵母膏 1 g L, 琼脂 2 0 g L , p H值 6 o 。 鉴定用培养基 ( 人工合成 培养基) : Mg S O4 7 Hz O 5 g L, K2 HP 0 4 1 0 g L, KC 1 5 g L , KN Oa 3 g L, Na C l 2 g L, 酵母膏 1 g L, 琼脂 2 0 g L, p H 值 6 0 。 1 2 试验方法 苦味物提取与浓缩: 取一定量的瑁溪蜜柚囊衣 粉料于索氏提取器中彻底脱脂, 再用丙酮浸提, 将丙 酮提取液减压浓缩获得苦味物浓缩液 ” 。 菌种富集与筛选分离: 瑁溪蜜柚皮腐烂液暴露 在空气中, 使菌种充分富集, 取菌株生长富集样品 3 g , 与 3 0 mL已灭菌的生理盐水混合后摇床振荡 3 O 分钟 , 连续稀释至稀释 1 O 倍, 然后吸取 0 2 m L所 需浓度的菌悬液, 注入分离培养基上, 均匀涂布后将 培养皿倒置于 2 8电子恒温培养箱 中, 培养 2 4 天。肉眼观察培养所得菌落的形态, 再用平板划线 法分离 , 直到获得纯菌种, 并在斜面保存培养基上 保存。 菌种初筛 : 将所分离得到的菌株接种于以苦味 物浓缩液为菌体生长的唯一碳源的选择性固体平板 培养基上, 2 8培养 5 天, 观察菌体生长情况。通 过菌落形态初步鉴定出真菌, 再接种于斜面保存培 养基上保存。 菌种复筛 : 将初步筛选出来的真菌菌株接种于 选择性液体发酵培养基中进行试管发酵, 同时作平 行和空白对照, 2 8、 1 6 0 转 分摇床发酵培养 5 天, 发酵液进行真空冷冻干燥后 , 加入 1 mL乙腈溶解, 再经 C e n t r i f u g e 5 4 1 5 D高速离心机离心( 1 0 0 0 0 转 分 , 2 O分钟) , 并经过针头式滤膜过滤后于-2 0保 存 , 以备测定 3 种苦味物的分解状况。 柚皮苷、 柠檬苦素和诺米林的检测方法 : 高效液 相色谱法。 菌株鉴定 : 根据相关文献鉴定方法 , 用接种针 挑取少量孢子 , 用点接法接种于P D A培养基平板中 央, 2 8 恒温培养, 1 2 小时观察一次, 观察记录菌落 形态、 色泽及其生长速度。利用营养缺陷型的培养 基进行培养, 采用载玻片培养和玻片扦插法 “ 观察 其菌体有性和无性繁殖方式。对菌株细胞进行染 色、 制片和显微观察。 2 结果与分析 2 1 菌种的筛选 f 能在以苦味物浓缩液为唯一碳源的选择性固体 平板培养基上生长的, 从菌落外观大致判断为真菌 的菌株有 2 9株 将这些菌株接种于选择性液体发 酵培养基中培养 , 用高效液相法检测发酵液中的苦 味物的含量的结果显示, 所选真菌大部分菌株对柚 皮苷的分解能力都很强, 培养 5天后有 1 3株真菌对 柚皮苷的分解率都达到了 1 0 0 ; 对柠碱和诺米林 的分解率较低, 都在 4 O 以下( 见表 1 ) 。 表 1 玷溪蜜柚果汁脱苦酶产生真菌菌株的复筛结果 菌种号 柚皮苷分解率柠碱分解率诺米林分解率 菌种号 柚皮苷分解率柠碱分解率诺米林分解率 2 1 1 0 0 9 7 6一 p - 4 3 5 0 1 2 2 9 9 7 7 1 6 一 p 2 1 8 5 5 0 1 2 2 2 9 7 1 6 21 6 - p 2 - 2 2 3 7 4 6 2 3 4 1 9 2 7 2 2 7 一 p 3 9 1 0 0 7 3 3 8 1 0 0 3 5 7 一 p 3 1 5 1 0 0 1 8 1 5 3 3 一 I 1 0 0 1 9 2 5 7 一 p 3 1 8 i 0 0 1 3 1 6 3 3 3 2 6 2 1 2 8 7 一 p 3 2 2 1 0 0 3 4 4 3 3 3 5 2 O 2 7 3 2 7 - p 3 - 2 6 1 0 0 2 4 3 0 3 3 8 i 0 0 3 2 35 7 一 p 3 2 7 9 8 1 4 2 2 3 3 1 8 1 0 0 7 1 3 7 一 P3 3 O 9 O 8 1 6 3 3 2 1 i 0 0 3 7 3 O 7 一 p 3 4 0 1 0 0 5 3 3 3 2 5 2 6 1 5 1 1 7 一 p 3 5 0 1 0 0 8 1 5 6 一 p _ 7 5 1 1 0 2 8 一 p 2 一 1 0 1 4 4 3 3 6 - p - 1 4 5 2 7 2 8 - p 2 1 1 0 4 2 i 2 6 - p - 2 2 5 1 I 2 注: 以上数据为 3 次平行试验的平均值。 2 0 1 2年第 4 1 卷第 2 期 中 国 南 方 果 树 4 9 从上述 2 9 个菌株中选出对 3种苦味物分解能 力较强的 5个菌株进一步比较 , 以确定其对苦味物 质分解的稳定性。试验结果显示, 除 3 - 3 5以外 , 其 他菌株均对柚皮苷有较强的分解力 ; 对另外两种苦 味物, 则以 3 3 2 1的优势较大。综合脱苦能力, 以 3 3 2 1菌株较强( 见表 2 ) 。 表 2 脱苦能力较强的真菌菌株 脱苦能力的进一步比较 菌种号 柚皮苷分解率柠碱分解率诺米林分解率 注: 以上数据为 4 次平行试验的平均值。 2 2 3 - 3 2 1 菌株的初步鉴定 试验中未拍摄到该菌株的有性世代特征, 未发 现其有性世代 , 根据文献E 9 , 鉴定 3 3 2 1菌株为半 知菌类( F u n g i I mp e r f e e t i ) 。 该菌株在 P D A培养基上培养 2天, 可以形成单 菌落 , 菌株生长良好, 菌落较大, 呈圆形 , 表面突起呈 毛绒状, 边缘粗糙, 菌落初为白色, 后变青色 , 菌丝体 表面会出现粉状的颗粒, 并掉落在倒置的培养皿盖 内表面, 由此判断其繁殖器官为分生孢子或粉孢子, 菌丝体绒毛状。培养 5天后 , 菌落外观上无太大变 化。根据文献 9 , 鉴定此菌 株应属于丛 梗孢 目 ( Mo n i l i Me s ) 。 对菌株进行染色、 制片和显微观察发现, 菌株 3 - 3 2 1的菌丝体有隔膜 , 光滑; 分生孢子梗疏松, 分 生孢子和孢子梗鲜色, 即青色; 分生孢子无隔膜, 呈 球形或拟卯圆形等; 该菌株孢子梗长, 与分生孢子明 显不同; 孢子梗稍微分枝, 分生孢子聚成头状且串 生; 孢子梗顶端稍微膨大 , 且轮轴状分枝大小不等, 孢子近于球形; 分生孢子和帚状枝外无胶质覆被, 基 部无环状加厚, 瓶形小梗排列成特有的轮轴状, 顶宽 而短, 孢子丛常带绿色, 孢子梗基部无厚壁足细胞。 将这些特征与文献 9 3 第 5 0 2页检索表中的描述进 行对照, 由“ 分生孢子球形或亚球形” 鉴定此株菌为 丛梗孢科(Mo n i l i a c e a e) , 单孢亚科 ( Ame r o s p o r o i d e a e o f Mo n i l i a c e a e ) , 曲 霉 族 ( As p e r g i l l e a e ) , 青霉属 ( P e n i c i l l i u m L k e x F r ) , 常现 青霉 P f r e q u e n t a n s 。 3 结论 通过筛选得到实验室编号为 3 3 2 1的菌株, 该 菌株对柚中的 3 种苦味物柚皮苷、 柠碱和诺米林均 有较强的分解率, 分别为 7 O 、 2 7 和 1 4 , 通过初 步鉴定 , 该菌株为丛梗孢科( Mo n i l i a c e a e ) , 单孢亚科 ( Ame r o s p o r o i d e a e o f Mo n i l i a c e a e ) , 曲 霉 族 ( As p e r g i l l e a e ) , 青霉属 ( P e n i c i l l i u r n L k e x F r ) , 常现 青霉 P f r e q u e n t a n s 。 参考文献 1 3 H a s e g a w a S Me t a b o l i s m o f l i n o n o i d s : l i m o n i n D - r i n g l a c t o n e h y d r o l a s e a c t i v i t y i n P s e u d o m o n a s J J A g r i c Fo o d Ch e m,1 9 7 6 , 2 4: 2 41 r 2 Ha s e g a wa S Re d u c t i o n o f l i mo n i n b i t t e r n e s s i n c i t r u s j u i c e s wi t h Ar t h r o b a c t e r g l o b i f o r mi s c e l l s i mmo b i l i z e d i n a c r y l a mi d e g e l r j J Ag r i c F o o d Ch e m, 1 9 8 3,3 1: 1 7 8 1 3 Ha s e g a w a S L i m o n o i d d e b i t t e r i n g o f c i t u s j u i e e s e r a b y i mmo b i l i z e d c e l l o f c o r y n e b a c t e r i u m f a s c i a n s - J J Fo o d S c i ,1 9 8 5,5 O:3 3 0 3 3 2 E 4 3 王志国微生物与柑桔汁脱苦 J 食品科学, 2 0 0 0 ( 1 1 ):1 0 - 1 4 r s W o n t a n a n o v a E, B a s i l e A,C a s s a

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