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3 4 0 2 0 0 6年 l 2月 第 1 卷 第 6 期C h i n J y c 塑 ! ! : : 垒 论 著 一 种适用于 P C R反应 的酵母菌 、 无绿藻及丝状 真菌 D N A提取方 法 刘素玲 冉玉平 曾蔚 张浩 代亚玲 李 明远 贾文祥 ( 1 华西医院皮肤性病科 ; 2 华西基础与法医学院微生物学教研室; 四川大学, 成都 6 1 0 0 4 1 ) 【 摘要】 目的介绍一种从酵母 、 无绿藻及丝状真菌中提取 D N A以用于 P C R反应的方法。方法所用菌种包括临床分离 的未知菌株和保藏菌株共2 3株: 未知酵母菌( 5株) 、 真皮毛孢子菌( 1 株) 、 糠秕马拉色菌( 1 株) 、 季也蒙念珠菌( 5株) 、 未 知丝 状真菌( 6株 ) 、 无绿 藻( 1 株 ) 、 烟 曲霉 ( 2株 ) 、 拟青霉菌 ( 1 株 ) 、 茎点霉 ( 1 株 ) 。用溶细胞 酶 ( 1 y t i c a s e ) 结合 B i o s p i n真菌 基因组 D N A提取试剂盒提取基因组 D N A, A 2 6 0 A 2 8 0检测纯度并计算质量浓度, 用真菌通用引物 I T S 1 I T S 4扩增真菌核糖 体基因( r D N A) 内转录间区I T S基因, 经 P C R扩增检验所提取的 D N A质量。结果成功提取所有2 3株真菌基因组 D N A, 其 纯度及质量浓度能满足 P C R反应的要求。结论用溶细胞酶结合 B i o s p i n真菌基因组 D N A提取试剂盒从酵母菌 、 无绿藻 及丝状真菌提取 的 D N A可用于 P C R反应 。 【 关键词】 D N A提取; 真菌; D N A提取试剂盒; 溶细胞酶 【 中图分类号】 R 3 7 9 【 文献标识码】 A 【 文章编号】 1 6 7 3 3 8 2 7 ( 2 0 0 6 ) 0 6 - 0 3 4 0 - 0 3 DNA e x t r ac t i o n f r o m y e a s t s, Pr o t ot h e c a a n d f da m e nt o us f un g i f o r PCR L I U S u l i n g , R AN Yu p i n g , Z EN W e i , Z HANG Ha o , DAI Ya - l i n g , U Mi n g y u a n , J I A We n - x i ang ( 1 D e p a r t m e n t o f D e r ma t o v e n e r e o l o g y , 耽 C h i n a H o s p i t a l ; 2 D e p a r t me n t of Mi c r o b i o l o g y , S c h o o l of B a s i c a n d F o r e n s i c Me d i c i n e , S ich u a n U n i v e r s i t y , C h e n d u 6 1 0 0 4 1 , C h i n a ) 【 A b s t r a c t 】 Ob j e c t i v e T o i n t r o d u c e a D N A e x t r a c t i o n m e t h o d f r o m y e a s t s , P r o t o the c a a n d f i l a m e n t o u s f u n gi f o r P C R Me t h o d s C l i n i c a l i s o l a t e d a n d s t o r ed s t r a i n s i n c l u d i n g u n k n o w n y e a s t s( 5 s t r a i n s )and fi l a me n t o u s f n gi ( 6 s t r a i n s ) , T r i c h o s p o r o n d e r ma t i s ( 1 s t r a i n ) ,Ma l a s s e z i a f u rf u r( 1 s t r a i n) ,P a e c i l o m y c e s( 1 s t r a i n) ,P h o ma( 1 s t r ai n ) ,P r o t o t h e c a( 1 s t r a i n ) ,C a n d i d a g u i l l i e r m o n d i i ( 5 s t r ai n s )and A s p e r g i l l u s , u mi g a t t t s ( 2 s t r a i n s )w e r e t e s t ed L y t i c ase c o mb i n ed w i t h B i o s p i n F u n g u s G e n o mi c D N A E x t r a c t i o n K i t w e r e u s e d t o e x t r a c t t h e D NA a c c o r d i n g t o t h e ma n u f a c t u r e r p r o t o c o 1 T h e DNA p u ri t y w a s c h e c k e d b y an aly z e s t h e r a t i o o f A 2 6 0 A 2 8 0 a n d i t s c o n c e n t r a t i o n Was c a l c u l a t ed T h e u n i v e r s al f u n g al p r i me r s I T S 1 I TS 4 we r e u s e d for P CR r e a c t i o n t o a m p l i f y I T S r e g i o n o f ri b o s o m e R N A g e n e( r D N A) , b y me ans o f t h e g ai n e d D N A as the t e m p l a t e s Re s u l t s A U o f 2 3 t e s t e d f u n g i g e n o mi c D NA c o u l d b e e x t r a c t e d s u c c e s s f u l l y an d the r a t i o o f A 2 6 0 A2 8 0 r an g e d f r o m 1 6 t o2 0 Al l o ft h e P CR p r o d u c t s a p p e a r ed c l e ar DNA b an d s a f t e r e l e c t r o p h o r e s i s Co n c l u s i o n s C o mb i n a t i o n o f l y t i c ase w i t h B i o s p i n F u n g u s Ge n o mi c DNA E x t r a c t i o n K i t i s a c o n v e n i e n t an d f e as i b l e w a y t o e x t r a c t g e n o mi c DNA f r o m y e ast s , P r o t o the c a a n d fi l am e n t o u s f u n g i f o r P C R r e a c t i o n 【 Ke y wo r d s 】 D N A e x t r a c t i o n ; f u n g i ; D N A e x t r a c t i o n k i t ; l y t i c a s e C h i n J M y c o l , 2 O O 6 , 1 ( 6 ) : 3 40 3 4 2 真菌的分类鉴定已深入到分子水平 , 各种 P C R 技术、 限制性片断长度多态性分析、 D N A序列分析 都需要高质量 的真菌基因组 D N A。真菌 D N A提取 方法很多 , 主要区别是破壁方法的不 同 , 以及破壁 基金项 目: 国家 自然科学基金项 目( 3 0 5 7 0 0 9 5 ) 作者简介 : 刘素玲( 1 9 7 1 ), 女( 汉族 ) , 博士在读 E - ma i l : s u l i n g l i u 1 2 6 c o rn 通讯作者 : 冉 玉平 , E - m a i l : r a n y u p i n g h o t m m1 c o rn 后分离核酸 、 蛋 白质方面的差异 。破壁方法包括液 氮冷冻研磨 、 酶裂解和氯化苄等化学裂解法 。核酸 分离方法包括经典 的酚 、 氯仿抽提 , 以及 商品化的 纯化柱 、 纯化膜分离法等 。 目前氯化苄、 十六烷基三 甲基溴化铵 ( C T A B) 法在真菌 D N A提取 中应用较 广泛 , 但上述方法存 在试剂毒性大、 耗时等缺点。一种快速、 高效且适 用于酵母菌和丝状真菌基因组 D N A的方法提取是 维普资讯 真菌分子生物学 研究需解决 的 墨 问题 率研究 采用溶细胞酶结 合 B i u s p i n真 茼牡因蛆 D NA提取 试剂盒 提取酵 母 菌和丝状 卣基因组 1 ) A , 简 便高 效 , 提取的 真菌 DN A适台 于进一 步的 P C R 压应 现 介绍 如 1材料与方法 l _ 1 菌株来源 本 真菌实验室保 存菌株及临 床分离标 本共 2 3 株 : 临床分离 求知酵母茼 YJ 、 Y 2、 Y 3、 Y 4 Y 5, 真拔 毛孢 子菌 (T r h h o s p o r , m d e r l rc I m )l株 、 糠 秕 拉 色茼 (Mr U a s s e z ia i r l株 、季 也 蒙 念 珠 菌 【Ca n d i d a g u i l l ie r mo n d i i ) 5株 、 临床分离未 =1_i 丝状 菌 F I 、 F 2 F 3、 、 、 F 6 尤 绿藻 (P r o t o 1 ? e c f t 株 、 烟曲霉 (4 s l w r g i f h s J h mi g a t u s) 2株 拟 青霉茼 (, 】 i l o my c e s) 1株 、 苇点霉 (P k u m 株除糠 秕马拉 色菌用禽 蓑籽 油沙堡弱培 养堆 外其 余均 用沙堡弱培养基培养 l _ 2试剂 溶细胞酶( L y ti c a s e ) 陷自美隔 S i g mn公 司 B i o s p i n真菌基因组 D 提取 试 剂盒 c B i, ,s t fi n F u n g u s G e n m n i c DN A E x t r a c l【i o n K i t 1响 白 L f本 B io F l u x公 司 引 物 对:I I (5 - q 、C C GT 4 GG T GA AC C T - G C GG - 3 )和 I 【 f 5 T C C T C C GC r r A 1 T r G AT A r _ G C - 3 ) 由上海 申能 悼彩 生物 公 司合 成 P c R p fu Mi x购 自广东东盛生 物公 司 1 3基因组 D NA提取 取沙堡弱琼脂 斜面培 养 5 7 d茼搭 2菌环 约 3 0 m g 一 加 入 0 5 l l p H 7 0磷酸钠 缓 冲随 再加 入 7 5 U溶细胞酶 3 7 水浴 】 h 离心去 青液后参 照 B io s p i n真菌基因组 I ) N A提版 试剂盒 兑叫操作 : 加 裂 解 液 4 0 0 la 1 6 0 T :水 措 3 0 rai n J J【 八 缓 冲 液 6 0 0 p I 去除 杂质 f 在适 当的盐 行受 I H条件下 , D N A 被吸附于 B io s p i n 膜上 ) , 进一 步洗涤 、 洗脱 即呵完 成 D N A提取 1 4 DN A纯度 及质量浓度检测力法 取 少量 提取 的 D N A稀 释 】 0倍 在紫外分光 光 度 仪下 测 定 波 长 2 6 0 n m 秆I 2 8 0 n m 的 光 吸 收 值 c A 2 6 0 A 2 8 0 ) j : 计算 A 2 6 0 A 2 8 0比值以及丰 H 应附 质量 浓度 值 D N A质 量浓度 ( n i l )=A 2 6 0 x 5 (7 稀 释倍 数 1 5 D NA凝 胶电泳 的检测 采用真 菌 转 录 间隔 国用 引物 I T S 1 , I T S 4 别提取 的 D N A做 R r 增 , 反 应 总 f杠积 5 0 Ia I : I ) N A摸板 2 1 l f u Mix ( d A I P、 -I C 1 l J 、 I ; T P、 【 T T P及 p f u D N A聚 合酶 j 合物 1 2 5 , 反 向 ( 物 符 ! I ( 1 0 l=L M) 去离子 水 I 9 l 夏? 越条件 : 9 4 : 预 蕾性 5 m, 9 4 4 5 s 5 8 4 5 , 7 2 6 0 s 3 0个循 环 7 : : 延忡7II1 增产 物经 I! 嘶琼 脂 盼f 乜泳分 离, 澳 化乙锭染色 , 任紫外 光灯 FI, j- 得 到 3 0 0- I O O O b p范 围的扩增 片段 此 片段 就 是 真 茼内转 录问 隔 I S t 一 5 8 I 5 2区基 DN A的扩增 片段 2 结果与分析 2 l DN A纯度 占 乏 质 量浓度 值 DN A纯 f r 的 A 2 6 0 A 2 8 0比值 为 l 6 5I 8 5, 高于 l 8【1 能 有 RN污染 雠于 】6 5则 叮能 有蛋 白质 酚类等污 染li io s p in真 菌 基因组 D N4提 取 试 剂禽所提取 的 D NA A 2 6 0 A 2 8 0值均 介于 1 6 2 0之Ih J , tll 提取 11 A溶 于 1 ) A l】 I 】骼I溶液 f f 得 到 1 ( ) o 1溶 被 其 浓 度 在 5 0 l O 0 ix ml之 J 3 On ig菌最平均提取 I () g I ) NA 2 2 将提取 的 D NA( 5 t * 1 ) 洋晶 缓 1 卜 液 ( 1 ) 泄 合加人0 8 晤 琼脂 糖电泳 【 l 也 1 0 (】 , - O n i in ) 浪 乙锭染色 庄紫 J l、 )匕灯下 观察 吧部分条带 模糊 部 分未见条惜 2 3 真 菌内转 录 隔区j j l I H引物 I 【1s l I T S 4做 P C R产物 电 泳 J i彳澳 已 锭 染 色, 往紫 外 光 下 见 DN A 条带清晰 无非特 舜 P l- 4 s、 j 条 带, 说明 已J殳功 提取 P CR已扩增! 1 其蔺基I 强组 D b , _ (见l薯 j 闰 1 川 1 i - r l N 4 0 物 盯挺取 妯锌 阿琳 i 蚀 I C l 1 扩 拘 2 I t 1 翌 1 2 *琼脂 晴I 淋站 芊f l 倒 H V , r k e l I 1 1 ( w J ( ) 严I l 1 向2 1 1 1 7 5 0 5 0 0 2 5 0 1 ( H _ I i p I 4手 1 6 : 木妇I 母株 、 1、 、 2、 Y 3、 、 4 Y 5; 5: 真血毛抱子 莉; 7: 懈 耻 批 邑 ; R1 2: 季 蒙 尚忠 蛛 阔 ; 1 3 1 8 : 束 壮 诗 株 、 、 1 q :尢绿 : 2 ( ) 干 2 2: 旌l 采抒离 t 罔 罐 : ! I : 临昧 圩岛拟 面 3: 点毒 Fi g 1 l l I mI d i s l P CR _ l j i l i e d p ml l u L b 、I J i m r u ( - I j r n ng aDNan d P l 、 r 1 1 l r I : Ln kn I J wn、 I I i r I Y2, 3 , 1 4 、 51 l a n e s i 6I T r i , b , f m l - I fi l l “( I 5 r ,l t a l a s s e z i a l b , 1 i l tI I 1 C a a d r a g u t l l i e r mo n I i i 1 】 i 8 I 2) t l n k t l o W l l fi l a m , , r , t , i i h f u l i g i F I F 2 1 - 31 Z 4F 51 ; 6 l a l I 3 I 8 ) P , t c l a n e 1 9 1 A a l r g i l l l : s I f I I ,I f J 1 n I 2 0 2 2 , mi l m r cI l 1 r 2I1Pb (1 a n 2 3) 维普资讯 3 42 3讨 论 2 0 0 6年 1 2月 第 1卷 第 6期C h i n J M y c o l , D e c 2 o 0 鱼 : 真菌细胞壁主要 由几丁质为主构成细胞壁骨 架, 而基质则为细胞壁上的填充物 , 包括葡 聚糖 、 甘 露聚糖和糖蛋 白。细胞壁 中的各种组分之 间紧密 结合 , 使细胞壁具有一定强度。在细胞 D N A提取 过程 中, 真菌较细菌或其他组织 细胞 D N A提取 的 不同在于其破壁的过程 , 只要使细胞壁有一定程度 的破坏 , 核酸才能有效释放。由于不同种属的真菌 细胞壁结构及培养条件 的差异性 , 提取 D N A的方 法常不同, 即使采用类似方法提取出的不 同种属真 菌的 D N A也有一定差异。在基因工程菌里 氏木霉 菌染色体 D N A提取研究 中, 分别采用冷冻研磨和 氯化苄法去壁 , S D S和 C T A B法破膜 , 用氯化苄 和 S D S法提取的 D N A含杂蛋 白较 多, 而用冷冻研磨 C T A B法提取 的 D N A完整且纯度高。另一研究采 用 C T A B、 S D S - C T A B和氯化苄等 3种 方法提取 了 l 0株不同青霉菌株 的 D N A, 结 果显示氯化 苄法 比 C T A B法和 S D S - C T A B法更适合于青霉 D N A的提 取 。根据酶解法破壁得原生质体 的结果 , 我们采用 酶解法溶细胞酶破壁 , 再用试剂盒裂解液进一步裂 解, 最后通过去除杂质的 D N A纯化过程 , 完成真菌 D N A提取 。此方法适合 于 5 0 mg以下少量 真菌标 本的 D N A提取, 由于经过纯化步骤, 具有较高纯 度。A 2 6 0 A 2 8检测结果及 P C R反应 均证实所提 取真菌 D N A能满足 P C R扩增条件。D N A提取过 程约需 2 h , 只需离心机等简单设 备即可完成 , 易于 操作 , 人为影响因素少, 结果稳定 , 可用于丝状真菌 和酵母菌 , 为真菌的分子生物学研究提供了一种适 合于 P C R反应 的简便 、 可靠的 D N A提取方法。 我们 所研究 的临床 分 离株 , 提取 D N A后 做 P C R反应 , 将进行后续的分子生物水平研究。该研 究 尚未包括一些常见菌株如白念珠菌 、 隐球菌等 , 有待于进一步扩大菌种范围。至近期 , 文献检索尚 未见该试剂盒应用研究的相关报道。 2 3 参 考 文 献 江洁 , 杜连祥 , 路福平 , 等 基因工程 菌里 氏木霉染 色体 D N A 的提取方法 生物技术 。 2 0 0 4, 1 4 : 2 4 - 2 6 崔丽霞 , 韩建荣 青 霉 D N A提取 方法 比较研 究 山西大学 学 报 ( 自然科学版), 2 0 0 4 , 2 7: 1 8 5 1 8 7 冉玉 平, 罗汉超 , 李志玉 含菜子油培养 基对花斑癣致 病真菌 的培养研究 中华皮肤科杂志 , 1 9 8 7 , 2 0 : 4 - 7 收稿 日期 【 本文编辑】 2 0 o 6 - 0 9-07 王飞 ( 上接第 3 7 3页) 1 1 wh i I e T C,H o l l e ma n S 。D y F 。 e t a 1 R e s i s t a n c e m e c h ani s ms i n c l i n i c a l i s o l a t e s o f C an d i d a a l b i c a n s An t i mi c rob Ag e n t s Ch e m o t h e r , 2 0 0 2。 4 6 ( 6 ) : 1 7 0 4 1 7 1 3 1 2 P e r e a S, L o poz R i b o t J L ,K i r k p a t r i c k WR e t a 1 P r e v al e n c e o f mo l e c u l a r mec h a n i s ms o f res i s t a n c e t o a z o l e an t i f n n g a l a g e n t s i n C a n d i d a a l b i c a n s s t r a i n s d i s p l a y i n g h i g h l e v e l fl u c o n a z o l e r e s is t - a l i c e i s o l a t e d f r o m h u ma n i mmu n o d e fi c i e n c y v i ru s i n f ec t e d P a t i e n t s An t i mi c rob Ag e n t s C h e mo t h e r ,2 0 0 1,4 5:2 6 7 6- 2 6 8 4 1 3 J G o l d man G H, d a S i l v a F e r r e ir a ME。 d o s R e i s M a r q u e s E e t a 1 Ev a l u a t i o n o f fl u c o n a z o l e r e s i s t an c e me c h an i s ms i n C0 n d i d 0 a l b i c a n s c l i n i c a l i s o l a t e s f r o m HI V i nfe c t ed p a t i e n t s i n Br a z i l Di a g n Mi c rob i o l I nf ect D i s , 2 0 0 4, 5 0 ( 1 ) : 2 5 - 3 2 1 4 L i x, B r o wn N。 C h a u A S e t a1C h ang e s i n s u s c e p t i b i l i t y t o p o s a c o n a z o l e i n c l i n i c al i s o l a t e s o f Ca n d i da al b i c a n s J An t i mi c rob C h e m o t h e r , 2 0 0 4 , 5 3( 1 ) : 7 4 - 8 0 【 l 5 Ma e b a s h i K,K u d o h M。N i s h i y a m aY e t a1P r o l if e r a t io n o f i n - t r a c e l l u l ar s tr u c t u re c o r r e s p o n d i n g t o r e d u c e d a f fi n i t y o f fl u c o n a z o l e f o r c y t o c h rome P- 4 5 0 i n t wo l o w s u s c e p t i b i l i t y s t r a i n s o f Ca n d i d a a l b i c a n s i sol a t e d f r o m a J a p ane s e AI DS p a t i e n t Mi c ro b i o l I m mu n o l , 2 0 0 3 , 4 7( 2 ) : 1 1 7 1 2 4 1 6 王文莉 ,王端礼 , 李若瑜 ,等白念珠菌对唑类 药物耐药机 制研究中国皮肤性病学杂志 ,1 9 9 9,1 3 ( 1 ) : 3 - 5 1 7 K a k e y a H, Mi y a z a k i Y,Mi y a z a k i H e t a 1 G e n e t i c a n a l y s i s o f 1 8 1 9 2 O 2 1 【 2 2 2 3 a z o l e r e s i s t an c e i n t h e Darl i n g t o n s t r a i n o f Ca n di d a a l b i c a n s A n t i mi c rob A g e n t s C h e m o t h e r , 2 0 0 0, 4 4 ( 1 1 ) : 2 9 8 5 -29 9 0 Ka k e y a H ,Mi y a z a k i T,Mi y a z a k i Y 。e t a 1 Az o l e res i s t an c e i n C a n d i d a s p p N i p pon I s h i n k i n G a k k a i Z a s s h i , 2 0 0 3 , 44 ( 2 ) : 8 7 9 2 B e l l a mi n e A ,Le po s h e v a GI ,W a t e r ma n MR F l u c o n a z o l e b i n d i n g an d s t e rol d e me t h y l a t i o n i n t h r e e C YP 5 l i sof o r ms i n d i c a t e d i f

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