木聚糖酶生产工艺研究进展及性能优化.pdf

同斟工业 2 0 1 1 年第 3 2 箜算 靼 贺 丹艳罗 永发 1 前言 以植物性饲料为主的配合饲料 ， 其原料 中往往含 有较多的非淀粉多糖( N S P ) ， 尤其是谷类作物及其副 产品。而对于单 胃动物而言， 其消化道缺乏消化 N S P 的酶， 因此， 此类物质被认为是一种重要的抗营养 因 子。阿拉伯木聚糖是小麦类饲料中的主要 N S P ， 其可 以通过结合大量的水分 ( G e i s s m a n n等 ， 1 9 7 3 ) 增加消 化道食糜的粘性 ， 降低食糜混合均匀性 、 饲料通过速 率和肠道氧化作用， 从而造成微生物大量繁殖并在小 肠 中发酵( P r e s t o n等 ， 2 0 0 1 ) 。为了消除木聚糖的抗营 养作用 ， 木聚糖降解酶被广泛应用于生产 ， 尤其是在 国外 ， 木聚糖酶的生产已比较成熟。文中在前人研究 的基础上综述 了木聚糖酶生产工艺的最新研究进展 、 产酶条件的优化及其分子改造手段， 以期为木聚糖酶 的生产 、 性能优化提供一些参考。 2 木 聚糖酶 的生产工 艺 2 1 木 聚糖酶 木聚糖酶是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖 的一类酶的总称。 糖苷键的彻底水解需要一系列主链 和支链酶 的共 同作用 ，内切一 1 ， 4 一 B 一 木聚糖酶 ( E C 3 2 1 8 ) ， 13 - 木糖苷酶( E C 3 2 1 3 7 ) 和外切一 1 ， 4 一 B 一 木 聚糖酶是降解主链最主要的酶 ( P a u l a s a P e r e i r a 等 ， 2 0 0 3 ) 。内切一 1 ， 4 1 3 一 木聚糖酶以内切方式作用于木聚 糖主链 内部的 B 一 1， 4 一 木糖苷键 ，使木聚糖降解为短 链 的低聚糖 ； 3 - 木糖苷酶是外切糖苷酶，通过催化低 聚木糖的还原末端来释放木糖残基( M o t o k i Wa k i y a m a 等， 2 0 1 0 ) 。外切一 1 ， 4 一 B 一 木聚糖酶( E C 3 2 1 9 2 ) ， 主要 作用于木聚糖 和木寡糖的非还原端 ，产物为木糖 。 木 聚糖的结构及酶作用位点如 图 1 所 示( J o s e l e n a ， 1 9 9 2) 1 a A A !t：二 e 3 3 三 0x y 悯 4 I 纠q f 纠 4 碍l 瑚 4 酬 。 4 伊l二 4 I 辨- ,t l p ! ： 4 酬 脚 - 4 x y p !- , t 1 p I 一 内 切 一 1 ， 4 一 p 一 木 聚 糖 酶 ( E c 3 2 1 _8 ) I p 一 木 聚苷酶 ( E c 3 2 1 3 7 ) - d 一 葡萄糖醛酸酶( E c 3 2 1 ) -, t l p 4 州 l O t L - 阿拉伯呋喃糖酶 ( E C 3 2 1 5 5 ) +阿魏酸 酯酶 ( p C o u m) 乙酰酯酶( E C 3 1 1 6) 或 者 乙酰木 聚糖 酯酶 图 1 木聚糖的结构及 酶作 用位点 另外 ， 根据氨基酸序列相似度 ， 可将木聚糖酶分 贺丹艳， 华南农业大学动物科学学院， 5 1 0 6 4 2 ， 广州市天 河 区五 山路 。 罗永发 ， 单位及通讯地址 同第一作者。 收 稿 日期 ： 2 0 1 0 1 2 1 3 为F 1 0 家族和 G 1 1 家族。 F 1 0 家族分子量高( 3 0 k D a ) ， 等电点低 ， G 1 1 家族分子量低 ( 1 9 2 5 k D a ) ，等电点 高 。 与 G 1 1 家族相比， F 1 0 家族有更好的催化功能和 较低的底物特异性( P B i e l y 等 ， 1 9 9 7 ) 。 2 2 产酶菌种 近年来 ， 多种木聚糖酶陆续从微生物中被分离出 来 ， 其 中包括细菌 、 放线菌 、 真菌以及某些酵母( S u n n a 贺丹艳 等： 木聚糖酶生产 工艺研 究进展及性能优化 等， 1 9 9 7 ) 。多数细菌和真菌分泌胞外木聚糖酶，将木 对于低分子量木聚糖酶的纯化来说 ， 可能是限制其 回 聚糖水解为单糖，单糖再进入微生物细胞供代谢用。 收率的主要因素。P a u l a S P 等( 2 0 0 2 ) 在纯化 B a c i l l u s 也有一些微生物如瘤胃细菌、 嗜饱粘液球菌及黑曲霉 s u b t i l i s 的 X y l 1 1 时 ， 发现硫酸铵沉淀这一步使酶的回 中的一些种类 ， 也产生胞内酶( 周秀梅 ， 2 0 0 8 ) 。 真菌木 收率降低了6 2 ， 并且其它的浓缩方法回收率也不高。 聚糖酶的活性通常要高于细菌木聚糖酶 ( 陆健等 ， 在一定的条件下， 采用不 同切割分子量的超滤柱 2 0 0 1 ) ， 细菌产生的木聚糖酶的 p H值稳定性 和热稳 对木聚糖酶进行分级分离 ， 可对木聚糖酶起到一定的 定性比真菌高，最适作用温度通常与产酶微生物的 分离精制作用( 刘蕾等 ， 2 0 1 0 ) 。P u i i R a h a y u 等( 2 0 1 0 ) 最适生长温度成正向相关。丝状真菌如曲霉属 ( A s 一 从 B a c i l l u s s p A Q 一 1 中分离木聚糖酶 ， 采用切割分子 p e r g i l l u s s p ) 和木霉属 ( T r i c h o d e r m a s p ) ， 由于能分泌 量为 3 0 k D a的聚醚砜膜进行超滤， 分离出了大小分别 胞外木聚糖酶 ， 且产酶水平高于酵母菌和细菌而格外 为 l 5 7 k D a 和 5 7 7 k D a的木聚糖酶 A和木聚糖酶 B 。 引起研究人员的关注( F a n g 等 ， 2 0 0 7 ) ， 但是丝状真菌 采用超滤方法有时会造成 目的酶的大量损失 ， 可能与 产生木聚糖酶时往往伴随着纤维素酶的产生。 一些杆 酶的结构或者膜孑 L 的分布不均有关。同时， 目的木聚 菌和真菌微生物可以产生无纤维素酶活性 的木聚糖 糖酶结构中如果含有纤维素结合区时 ， 膜材料最好不 酶( 陆健等， 2 0 0 1 o 要选择纤维素膜， 因为由于木聚糖酶与膜的吸附作用 2 - 3 微生物发酵生产 可能造成大量损失( 孙雷等 ， 2 0 0 5 ) 。 目前木聚糖酶的生产主要依靠真菌 、 细菌等微生 离子交换层析技术是木聚糖酶分离纯化中常采 物发酵生产。 按照发酵工艺的不同可分为固态发酵和 用的方法 。根据 目的酶的等电点选择合适 的分离树 液体发酵两种。固态发酵( S S F ) 是指微生物在无流动 脂 ， 对于弱酸性及中性的木聚糖酶多采用阴离子交换 水的潮湿基质上生长， S S F的优点是产物 回收的液体 树脂 ， 如 D E A E - T o y o p e a r l 6 5 0 S ( Mo t o k i Wa k i y a m a 等 ， 需求量少 ， 底物便宜 ， 培养成本低等( Q K B e g等 ， 2 0 1 0 ) ；对于弱碱性的木聚糖酶多采用 阳离子交换树 2 0 0 1 ) ， 但不易控制， 酶系复杂 ， 纤维素等酶含量高 ， 难 脂 ， 如 D E A E S e p h a r o s e C L 一 6 B ( F a n g等， 2 0 0 8 o A s h 一 以精酶化。目前国内普遍采用固态发酵。液体发酵具 w a n i 等( 2 0 1 0 ) 在分离 B a c i l l u s s u b t i l i s a s h的木聚糖酶 有如下特点： 在液态环境 中， 菌体 、 底物 、 产物f 包括 时， 采用 C M S e p h a d e x C 一 5 0离子交换一步法， 回收率 热量) 易于扩散 ， 使发酵在均质或拟均质条件下进行 ， 为 4 3 ， 纯化倍数为 1 0 5 。S u c h i t a N i n a w e等( 2 0 0 8 ) 将 便于检测 、 控制 ， 容易扩大生产规模 ； 液体输送方 S t r e p t o m y c e s e y a n e u s S N 3 2产生的木聚糖酶粗酶液经 便 ， 易于机械化操作； 产品易于提取精制。 但缺点是 过硫酸铵沉淀后 ，再用 D E A E S e p h a r o s e 进行离子交 对设备的要求较高 ， 成本高， 技术要求也较严格( G a r 一 换， 得到的产物回收率为4 3 6 2 ， 纯化倍数为 Z 2 5 4 。 i e k W， 1 9 8 7 ； R o c h e N等， 1 9 9 4 ) 。 凝胶过滤是一种根据分子大小不同分离纯化木 2 4 木聚糖酶的分离 、 纯化 聚糖酶的常用分离方法之一。 经过凝胶过滤层析后木 木聚糖酶分离纯化的一般步骤是粗酶预处理、 粗 聚糖酶的回收率一般都较低 ， 这可能由于木聚糖酶结 酶沉淀 、 色谱分离。纯化的早期步骤通常使用低分辨 构中含有纤维素结合区( C e l l u l o s e B i n d i n g D o m a i n ， 率 、非专一性的粗分离纯化手段，如硫酸铵盐析、 超 C B D )， 而葡聚糖是由 一 葡萄糖残基构成的， 两者可 滤、 透析等以达到浓缩 、 去除大部分杂质和色素的目 以相互结合( 孙雷等， 2 0 0 5 ) 。Wa n g等( 2 0 1 0 ) 将 B a c i l 一 的； 随后常用 的色谱有离子交换 、 凝胶过滤 、 疏水色l u s s p N T U 一 0 6产生的木聚糖酶经过离子交换 ，然后 谱 、 亲和色谱和色谱聚焦( 周玉恒等， 2 0 0 5 ) 。 将活性部分注入 S e p h a d e x G 一 2 0 0凝胶 ，结果回收率 2 4 1 传统的非特异性分离 为 1 6 1 ， 纯化倍数为 3 6 7 ， 并且凝胶 S D S P A G E电 传统的非特异性分离方法一般包括硫酸铵沉淀 、 泳后， 得到的条带颜色变浅 ， 这是由于活性木聚糖酶 超滤浓缩、 离子交换层析和凝胶过滤层析。 使凝胶中的木聚糖基质发生水解。 硫酸铵沉淀是酶分离纯化 中常用的方法， 可以同 2 4 2 特异性分离纯化 时达到浓缩与粗分离的 目的。G a s h a w等( 2 0 0 6 ) 将从 应用特异性步骤分离纯化木聚糖酶， 一是利用木 B i 1 l u s h a l o d u r a n s s 7获得 的内切一 1 ， 4 一 B 一 木聚糖酶 聚糖酶 自身结构上可以与多糖结合的能力。另外 ， 是 ( 分子量为 4 3 k D a ) 粗酶液进行硫酸铵盐析， 回收率为 利用基因技术使木聚糖酶结构中带有亲和标i e ( 孙雷 6 6 5 ， 并将 比活从 8 9 U m g 提高到了 1 3 2 U m g 。但 等 ， 2 0 0 5 ) 。 这些特异性分离纯化方法主要有与多糖特 。 贺丹艳等： 木聚糖酶生产工艺研究进展及性能优化 酶 异性结合亲和层析 、 双水相萃取、 三相分离等。 除了催化区， 一些木聚糖酶还含有非催化区即糖 类结合域 ( c a r b o h y d r a t e b i n d i n g m o d u l e ， C B M) ， C B M 可以提高木聚糖酶与不溶性基质结合的能力( L i u等， 2 0 1 0 ) 。C B M 主要包括纤维素结合域 C B D ( c e l l u l o s e b i n d i n g d o ma i n ) 和木 聚糖结合域 X B D( X y l a n B i n d i n g D o m a i n ) 。C B D可专一地吸附于可溶或不可溶的纤维 素上 。一些 C B D不可逆地结合在纤维素上 ，此类 C B D可用于固定化。具有此 C B D的木聚糖酶或者含 此 C B D标签的酶可固定到纤维素上。另一些 C B D可 逆结合到纤维素上 ， 可作为一种亲和标签 ， 在分离和 纯化上更为有用 ( 周玉恒等 ， 2 0 0 5 ) 。木聚糖酶中的 X B D较 C B D而言较少存在 ，其原因可能是木聚糖多 聚物中带有许多类型的取代基 ， 由于取代基 的变化从 而使能够结合所有木聚糖蛋 白区域的进化成为不可 ( B l a c k G W等 ， 1 9 9 5 ) 。 双水 相 系统 ( A q u e o u s T w o P h a s e S y s t e m ， A T P S ) 主要是通过混合两种低浓度的不相溶高聚物溶液或 者一种高聚物溶液和一种盐溶液形成。A T P S系统分 离的基础是两相之间物质 的选择性分配， 由与相位系 统特征相关 的一系列参数和物质 以及他们的相互作 用控制( A l b e r t s s o n ， 1 9 8 6 ) 。 与其他分离纯化相 比， 由于 A T P S系统的含水量高 ， 处理时间短 ， 能量消耗低 ， 所 以其具有更好的生物兼 容性( A n d e r s s o n等 ， 1 9 9 0 ) 。 Y a n g 等( 2 0 0 8 ) 利用聚乙二醇 ( P E G) 硫酸铵系统纯化 来 自嗜热拟青霉( P a e c i l o m y c e s t h e r m o p h i l a ) 过 固态 发酵产生的一耐热木聚糖酶 ， 研究了 6 个包含不同的 P E G分子量 、 硫酸铵浓度的 A T P系统 ， 结果在 p H值 7 2 、 l 2 5 P E G 一 4 0 0 0 、 2 5 硫酸铵和 5 0 酶溶液时最 优 ， 回收率为 9 8 7 ， 纯化倍数为 5 5 4 。 三相系统与 A T P S不同， 即在上下相之间有一界 面相 ， 一般由蛋白质水溶液 中加入一种盐( 一般是硫 酸铵) 和一种有机溶剂( 一般是 t 一 丁醇 ) 形成( D e n n i s o n 等 ， 1 9 9 7 ) 。I p s i t a等( 2 0 0 4 ) 先将 A s p e r g i l l u s n i g e r 木聚 糖酶用 8 m o l 1 尿素和 1 0 0 mm o l 1 二硫苏糖醇变性 ， 再进行 T P P纯化 ，木聚糖酶达到了 9 3 的回收率和 2 1 倍纯化 ， 且实现了该酶变性后的复性。 除 了上面 的技术 外 ， E v e r a l d o s i l v i n o D o s S a n t o s 等 ( 2 0 0 2 )曾尝试用扩张床吸附技术( E x p a n d e d b e d a d s o r p t i o n ， E B D) 纯化木聚糖酶 ， 虽然最大只有 3 0倍 的纯化和 2 1 8 的回收 ，但此法具有既经济又省时， 木聚糖酶发酵液不需沉淀澄清的优点。 3 木聚糖酶 的优化 3 1 产酶条件的优化 3 1 1 筛选菌株 要提高木聚糖酶的活力及性能， 第一步就是要筛 选出高产菌株和特异性菌株( 如耐热性能好 、 p H值适 应范围广等) 。 3 1 1 1 自然选育 自然选 育是 指对微 生物细胞群 体不经过人 工 处理而直接进行筛选 的育种方法。虢 国成( 2 0 0 8 ) 利 用透明圈比较法和 D N S法相结合 ，筛选 出 2 6株产 木 聚糖酶菌 ， 并从 中分离 、 纯化 出一株高产木 聚糖 酶菌一 s 6 。代义等( 2 0 0 8 ) 以半纤维素 、 桦木木聚糖为 唯一碳 源 ， 两步透明圈法从 1 0种混合土壤样品中 ， 分离到一株木聚糖酶高产菌株 H J 一 0 4 ，通过形态学 观察 、 生理生化特征及 1 6 S r D N A序 列分析 ， 鉴定 为 短小芽孢杆菌。赵峰等( 2 0 0 8 ) 采用木聚糖为唯一碳 源的平板初筛培养基 以及摇瓶复筛液体培养基 ， 从 保藏 的菌株 中筛选 到产木聚糖 酶活力较高 、 菌丝生 长快的粗糙脉孢菌( N e u r o s p o r a c r a s s a ) 菌株 。另外 ， 已报 道 的耐 热 真 菌 有 嗜 热 毛 壳 菌( H u m i c o l a i n s o l e n s ) 、 特 异腐质 霉 ( H u m i c o l a i n s o l e n s ) 、 嗜热 羊毛 状腐 质霉( H u m i c o l a l a n u g i n o s a 1 、 灰 色腐质霉 ( H u m i c o l a g r i s e a ) 、 嗜热 拟青霉 ( Me l a n o c a rpu s a l b o m y c e s ) 、 埃 默 森 篮 状 菌 ( T a l a r o m y c e s e m e r s o n i i ) 、 丝 衣 霉 状 篮 状菌( T a l a r o m y c e s b y s s o c h l a m y d 0 i d e s ) 、 疏绵状嗜热丝 胞菌 ( T h e r mo m y c e s l a n u g i n o s u s ) 、耐热子囊菌 ( T h e r m 0 a s c u s a u r a n t i a e u s ) 等。 3 1 1 2 人工诱变 关于高产菌株的筛选 目前已有很多报道， 人工诱 发基因突变是主要改良途径之一。 徐同宝等( 2 0 0 9 ) 以 黑 曲霉 ( A s p e r g i l l u s n i g e r ) X E 6为出发菌株 ，经微 波 f MW) 和硫酸二 乙酯( D E S ) 诱变处理， 选 育出一株遗传 性状稳定的高产木聚糖酶菌株 m A n l 。周欣等( 2 0 0 9 ) 以短小芽孢杆菌 ( B a c i l l u s p u mi l u s ) H J 一 0 4为出发菌 株， 通过紫外诱变的方法筛选得到一株木聚糖酶高产 菌株 B 一 6 ， 其酶活提高约 3 0 。刘唤明等( 2 0 0 8 ) 以木 聚糖酶酶活为 2 0 0 0 0 U g的黑曲霉 P 1 4为出发菌株 ， 通过离子注入诱变，得到产木聚糖酶酶活 3 2 0 0 0 U g 的菌株L 1 5 。 3 1 1 _ 3 构建基因工程菌 微生物产生木聚糖降解酶系比较复杂， 大多还同 时产生纤维素酶 ， 这些酶性相近 ， 使分离纯化木聚糖 酶 比较困难 ， 利用基因重组技术 ， 将产生木聚糖酶的 基因在合适的宿主菌 中表达 ，可 比较容易地得到纯 贺丹艳等 ： 木聚糖酶生产 工艺研 究进展及性能优化 化。P a n b a n g r e d和 F u k u s a k i ( 1 9 8 5 ) 首次利用大肠杆菌 表达矮小芽孢杆菌 ( B a c i l l u s p u mi l u s I O P ) 一 木聚糖 酶。 随后已有数十种不同来源的木聚糖酶基因在原核 生物表达系统中实现了表达 。Wa n g等 ( 2 0 1 0 )将从 A n o x y b a c i l l u s s p E 2中克隆的木聚糖酶基因 x y n E 2导 人 大 肠杆 菌 B L 2 1( D E 3 ) 中表 达 ， 纯 化 后 得 到 的重 组 X y n E 2在 p H值 6 6 8 6范 围内能保持最 大活力 的 9 0 ，在 p H值 4 6 1 2 0的范围内仍能保持 8 0 的活 力 1 h 。 Q i u等 ( 2 0 1 0 ) 从 S t r e p t o m y c e s me g a s p o r u s D S M 4 1 4 7 6 基因文库中筛选出 x y n A M6基因， 并在毕赤酵 母 G S 1 1 5中成功表达其成熟肽 ， 结果表明 ， 该酶温度 适应 范围广( 5 0 8 0范 围内能保 持最大活力 的 6 0 ) ， 并在 6 0和 7 0时有 良好的热稳定性， 在 p H 值 4 0 1 1 0范围内保持稳定。 3 1 2 发酵条件的优化 3 1 2 1 选择合适的诱导物 由细菌和真菌产生的木聚糖酶通常是诱导型的， 但也有很少一部分木聚糖酶是组成型的。 木聚糖作为 高分子的多聚物不能够透过细胞壁， 在少量组成型酶 的作用下释放出低聚糖碎片 ，这些碎片包括木糖、 木 二糖、 低聚木糖等( B a s t a w d e ， 1 9 9 2 o其作用机制见图 2 ( P o l i z e l i 等 ， 2 0 0 5 ) 。 f l l 一 l 、 诱 导 代谢 阻遏 1 l p 一 木 糖 苷 酶l 未 。 木 三糖 一 一 低聚木糖 木 糖 葡i 糖 细胞质 渗透 质膜 奎 j 婆 葡 ； 亩 糖 ， l 木 聚 糖 酶l 【 图 2 木聚糖酶的作用机制 当单糖如木糖 、 半乳糖 、 果糖、 葡萄糖等作为唯一 碳源时 ， 一般都不发挥诱导作用 ， 而且 由葡萄糖引起 的代谢阻遏是木聚糖酶生物合成中的普遍现象。 在海 枣曲霉( A s p e r g i l l u s p h o e n i c i s ) 中， 由木聚糖 、 木糖和 p 一 甲基木糖苷诱发的木聚糖酶活性主要是胞外的， 向木 聚糖或者木糖基质中加入 l 的葡萄糖抑制木聚糖酶 的表达， 但这种抑制可以通过添加 c A M P或者联丁酰 c A M P得 到缓 解( A n a等 ， 2 0 0 8 ) ； K o h j i Mi y a z a k i 等 ( 2 0 0 5 ) 研究发现， 对于布氏普雷沃氏菌 B 1 4( P r e v o t e l l a b r y a n t i i B 1 4 ) ， 木糖 、 木二糖 、 木三糖 、 木四糖 、 木戊 糖 、 树胶醛糖 、 葡萄糖醛酸皆不能诱导其产生木聚糖 酶， 并且 当葡萄糖水平达到 0 1 ( w v ) 时即会产生代 谢阻遏或者诱导排斥， 从而造成木聚糖酶表达的延迟。 一 般来讲 ， 木聚糖酶的诱导是复杂的， 其诱导水 平也因微生物的不同而相差较大， 对于某一种微生物 可以产生最大木聚糖酶活性的诱导物可能是另外一 种微生物产木聚糖酶的抑制剂。 在白腐真菌粗毛栓菌 ( T r a m e t e s t r o g i i ) f L e v i n等 ， 1 9 9 8 ) 、泡 盛 曲 霉 ( A s p e r g i l l u s a w a m o r i ) f S i e d e n b e r g等 ， 1 9 9 8 ) 、链 霉 菌 s p Q G 一 1 1 - 3( B e g 等 ， 2 0 0 0 ) 诱导物一般是木聚糖 ， 而在 黄纤 维单胞菌 ( C e l l u l o mo n a s fl a v i g e n a ) ( A v a l o s 等 ， 1 9 9 6 ) 中木聚糖的诱导效果则不好。B D吡喃木精基 可以作为木聚糖酶组的诱导物 ( G h o s h等， 1 9 9 4 ； R i z z a t t i 等， 2 0 0 1 ) ，但在一些微生物中它将导致 内切木聚 糖酶的代谢阻遏( F l o r e s 等 ， 1 9 9 6 ； Ma c h等 ， 1 9 9 6 ) 。另 外， 木聚糖酶的其他一些诱导物如 L 一 山梨糖 、 各种木 寡糖、 木质纤维素残渣等都有过报道。 3 1 2 2 选择合适的氮源 氮源是构成细胞原生质和酶蛋 白的主要原料， 因 此对微 生物的生长 和酶的合成也会有所影 响。据 H a a p a l a等( 1 9 9 6 ) 研究表明 ， 以固定化里 氏木霉 Q M 6 a 制备木聚糖酶时， 氮源对产酶的影响比 p H值更为 贺丹艳等： 木聚糖酶生产工艺研究进展 性 化 重要。一般来说 ， 单一物质作氮源时有机氮源优于无 等， 2 0 0 8 ) 、 E u d r a g i t L 一 1 0 0( 周玉恒等 ， 2 0 0 7 ) 、尼龙布 机氮源 。S u s h i l 等 ( 2 0 1 0 )以短小芽孢杆菌 S V 一 8 5 S ( H a a p a l a ， 1 9 9 6 ) 等。 ( B a c i l l u s p u rai l u S S V 一 8 5 S ) 为 出发菌株 ， 以 1 0 的小 除了固定化材料的固有性质外 ， 对其进行适当修 麦麸为碳源 ， 研究蛋 白胨 、 酵母提取物 、 牛 肉膏 、 以及 饰也可改善其性能。 支持物与酶之间的共价键数量由 硝酸钾 、 硫酸铵 、 硝酸钠对木聚糖酶活性的影响， 结果 支持物的活化度 ( 支持物表面的醛基数 目) 和酶分子 表明， 添加有机氮源时酶的滴定度更高 ， 另外 ， 不同氮 的氨基数 目决定( J M G u i s a n ， 1 9 8 8 ) ， 可 以通过增加酶 源的组合效应表明， 蛋 白胨 、 酵母提取物和硝酸钾组 分子表面的氨基数 目来提高固定化酶的性能。Ma n 一 合时酶的产量最 高； 对于环状芽孢杆菌 A B 1 6 ( B c i r r i c h等( 2 0 1 0 ) 将木聚糖酶固定在乙醛琼脂糖上时， 固 c u l a n s A B 1 6 )和喜热噬油芽孢杆菌 f G e o b a c i l l u s t h e r 一 定率和稳定性都较差， 这主要是因为酶分子的赖氨酸 m o l e o v o r a n s ) 而言 ， 最好的氮源则是胰蛋白胨。尽管如 基团的数 目较低 ， 最后经过乙二胺修饰 ， 酶的稳定性 此 ， 但也有一些研究结果得出无机氮源和有机氮源的 提高了 4 0倍， 并且固定率达到了 1 0 0 。 效果无显著差异 ， 或者无机氮源优于有机氮源。在苜 尽管固体支持物有很多优点 ， 但一些缺点还是不 蓿根腐病 菌 F 7 ( F u s a r i u m s o l a n i F 7 ) 的培养基中分别 可避免的， 比如木聚糖基质的固态性能会限制酶的通 以蛋 白胨 、 尿素 、 酵母提取物 、 硝酸钠 、 硫酸铵 、 硝酸铵 过 ，并且 由于结合酶不易与大体积的不溶性基质接 和牛肉膏为氮源 ， 结果表明 ， 蛋白胨和硝酸钠 的效果 触， 使木聚糖酶的效率有可能降低。 为了克服这点 ， 有 最好 ， 并且硝酸铵和尿素也能产生相当数量的木聚糖 些学者提出了一种新的酶固定化技术 ， 即基于人工油 酶 ( G u p t a等 ， 2 0 0 9 ) ；短小芽孢杆菌 H J 一 0 4 ( B a c i l l u s 体( A O B s ) 的表达 纯化系统。 在这个系统 中， 种子油体 p u m i l u s H J 一 0 4 ) N H 4 N O 最利于产酶 ， 总体是无机氮源 的一种独特 的结构蛋白油脂蛋 白被作为载体 ， 油脂蛋 比有机氮源更利于 H I 一0 4产酶( 代义等 ， 2 0 0 8 ) 。黑 白的亲脂部分嵌入三酰甘油中， 两个两性手臂突出于 曲霉 ( A s p e r g i l l u s n i g e r ) X E 6以 N H 4 N O 为氮源时菌株 油体表面 ， 从而 ， 目标蛋 白可以融合到油脂蛋 白的 N 的产酶活性显著高于其它氮源( 徐同宝等， 2 0 0 9 ) 。 或者 C末端形成不溶性重组蛋白， 而后在大肠杆菌中 3 1 2 - 3 固定化 表达( Hu n g 等 ， 2 0 0 8 ) 。 在实际应用 中， 将微生物或者酶固定在固态材料 3 2 木聚糖酶的分子改造 上具有许多优点 ， 包括酶的重复利用 、 易于产品分离、 大多数天然酶的活力较低， 而且催化特性也往往 提高酶的稳定性等。在固定化研究中， 可把微生物的 不能满足人们的需求 ， 因此对酶分子进行改造具有十 整个细胞固定在支持