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酿酒科技2011年第1期(总第199期) LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY2011 No1(Tol199) 基金项目: 四川省教育厅重点项目 (082A001 ) , 四川省科技厅支撑计划项目 (2010NZ0029 ) ,四川省属高校白酒关键技术创新团队建设计划资助。 收稿日期:20101111 作者简介:蒲岚(1973-),四川自贡人,工程师。 通讯作者:冯学愚(1964-),四川宜宾人。 浓香型白酒窖池中糟醅微生物的变化趋势研究 蒲岚 1, 李 璐 2, 谢善慈1, 游 玲 1, 沈亮亮3, 冯学愚1, 邱树毅2, 许德富4, 倪 斌 4, 税梁扬4 (1.宜宾学院生命科学与食品工程学院,发酵资源与应用四川省高校重点实验室,四川宜宾644007;2.贵州大学生命科学学院, 贵州大学化学与化工学院,贵州省发酵工程与生物制药重点实验室,贵州贵阳550025;3.四川理工学院材料与化工学院, 四川自贡643000;4.泸州老窖集团公司,四川泸州646000) 摘要: 研究了浓香型白酒典型微生物菌群主导的发酵动态变化过程。 通过对窖池典型微生物菌群的数量变化监 测, 发现酒精发酵与生酸产酯发酵并未有明显界限, 随着窖池主导菌群, 或窖池微生物区系的交替演变而逐步转换。 同时, 不同区域企业生产窖池的典型微生物菌群的数量变化有差异; 单纯用牛肉膏蛋白胨培养基结合平板涂布计数 法测定好氧细菌数量, 不能真实反映窖内好氧细菌的真实情况。 关键词: 浓香型白酒; 糟醅; 典型微生物数量 中图分类号:TS262.31;TS261.4;Q93-3文献标识码:A文章编号:10019286(2011)01001703 Study on the Change Trend of Microbes in Fermented Grains in Luzhou-flavor Liquor Pits PU Lan1,LI Lu2, XIE Shan-ci1, YOU Ling1, SHEN Liang-liang3, FENG Xue-yu2, QIU Shu-yi2, XU De-fu4, NI Bin4and SHUI Liang-yang4 (1. College of Life Science and Food Engineering, Key Lab of Fermentation Resources and Application at Universities of Sichuan Province, Yibin University, Yibin, Sichuan 644000; 2. College of Life Science,College of Chemical and Chemical Engineering, Engineering Key Lab of Fermentation and Biopharmacy of Guizhou Province, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025; 3. College of Materials and Chemical Engineering, Sichuan University of Science 4. Luzhou Laojiao Co.Ltd., Luzhou, Sichuan 646000, China) Abstract: The dynamic change in the fermentation of Luzhou-flavor liquor dominated by typical microorganism population was investigated. The monitoring of the quantity of typical microorganism population in pits indicated that there was no clear boundary between ethanol fermentation and acid-producing fermented grains; quantity of typical microorganisms 浓香型白酒的糟醅微生物源于酿酒环境、 大曲、窖 泥, 在相对封闭的窖池内部进行物质和能量的交换转化 过程,并随窖内温度、糟醅成分、含氧量等因素变化交替 演变,生成不同的代谢产物。这个过程决定了浓香型白酒 特有的成分结构和风味特征。 浓香型白酒的生产受环境等自然因素影响特别大, 也与生产工艺和操作习惯有关。 除窖泥中厌氧菌群和兼 性厌氧菌群长期处于相对封闭的高酸、 厌氧的环境中相 对稳定外,更多的源于酿酒环境、大曲的微生物的变化有 随机性。 鉴于不同地理区域、不同生产季节、不同发酵阶段糟 醅中微生物区系有差异, 课题组在川南某厂开展了窖池 中糟醅微生物的变化趋势研究。 本试验采用平板计数方 法, 对发酵过程中糟醅微生物区系构成和数量动态变化 趋势作跟踪监测, 为浓香型白酒发酵机理的深入探讨提 供基础数据。 1材料与方法 1.1取样方式 17 酿酒科技2011年第1期(总第199期) LIQUORMAKING SCIENCE TECHNOLOGY2011 No1(Tol199) 实验窖池选取在某企业基地酿酒车间。 发酵时间为 2009年35月。封窖之前,预先埋入自行设计的取样器, 选取距窖壁5070 cm分中层(窖池距地平面1.5 m)、下 层(距窖底40 cm左右)2点取样,以及窖池中央轴线平 行位置取样。入窖开始30 d内,每3 d取1次窖池边部中 层、下层样各1份;发酵30 d至出窖,每5 d取同样位置 各1份;发酵全程于9 d、21 d、40 d、55 d取窖池中央位置 的中层、 下层样各1份。 所取糟醅立即移入无菌培养皿 中,及时分离计数。 另取部分糟醅放入无菌密封袋中,做 同步理化分析。 1.2典型微生物培养计数 称取5 g所取糟醅样,置含45 mL无菌水三角瓶中, 加入玻璃珠,常温放于摇床20 r/mim振荡20 min,取滤 液备用。 培养基: 好氧细菌及兼性厌氧细菌用牛肉膏蛋白胨 培养基,酵母菌YPD培养基,霉菌用抗菌素淀粉培养基。 培养条件:好氧细菌及兼性厌氧细菌在3537 培 养23 d;酵母菌在2728 培养23 d;霉菌在30 培养57 d。 计数方法:采用稀释涂布平板计数法,对兼性厌氧细 菌的培养,采取燃烧耗氧法。将培养皿置于内设明火并封 口的干燥器内, 待火焰燃尽熄灭于36 倒置培养36 48 h,观察计数。 2结果与讨论 2.1好氧细菌数量变化 窖池中层和下层糟醅中好氧菌数量变化见图1。 在 发酵前期(入窖到发酵30 d),好氧细菌数量呈现波动状 态,说明此阶段窖池内各类微生物菌群演替迅速。边下层 在第6天和第15天出现峰值,含量达峰值时为106个/g 糟醅,与陈敏的结果类似1。 第一个峰值出现的原因是糟 醅入窖不久,氧气含量充裕,营养丰富,入窖糟醅携带引 入大量好氧细菌及其芽孢菌, 其变化证明了罗志腾与乔 宗伟的研究结果2-3。 笫二个峰值,推测应是兼性厌氧细 菌的大量繁殖, 以及窖泥微生物对糟醅微生物区系动态 变化产生影响。 发酵后半期, 糟醅中好氧菌数量降至104105数量 级,至出窖时数量又重回106个/g糟醅,与乔宗伟的研究 结果3有差异,也不能从微生物生理角度进行解释。 推测 是在牛肉膏蛋白胨培养基中好氧细菌芽孢和兼性厌氧细 菌同样繁殖增加, 平板计数法的结果是好氧细菌和兼性 厌氧细菌总数的叠加,数据未能反映真实情况。乔宗伟的 研究结果、赵东4的研究结果也验证了这个推论。 2.2兼性厌氧细菌数量变化 窖池中层和下层糟醅中兼性厌氧细菌数量变化见 图2。 兼性厌氧细菌数量变化趋势,与赵东的研究结果相 同4,数量最高时达106个/g糟醅,发酵中后期稳定于 105数量级数天,中层最低降至104个/g糟醅,之后又有 一个上升过程。 发酵前半期, 下层兼性厌氧细菌数量的峰值出现在 第3天和第15天左右,但数量顶峰出现在发酵第15天。 这一结果表明,兼性的乳酸菌、醋酸菌等生酸菌,它们既 可在氧含量充足的发酵初期并行生长繁殖, 又可在发酵 中后期的厌氧环境生酸生酯, 这是浓香型白酒生产中乳 酸、乳酸乙酯的生成量高于己酸和己酸乙酯的原因5。 发酵前半期, 中层兼性厌氧细菌数量的峰值出现在 第9天,这一结果表明,兼性的乳酸菌、醋酸菌等在窖池 中层是细菌的优势菌群。 发酵后半期的4555 d, 兼性厌氧细菌数量变化情 况说明,窖泥在浓香型大曲酒生产中的作用,以及己酸等 兼性厌氧细菌从窖泥移动到近端糟醅, 再从近端移向远 端糟醅的迁移规律6。 比较图1和图2的数据,可以发现,在发酵进行18 d 以后,窖内应不存在好氧菌。进一步验证了在牛肉膏蛋白 胨培养基中好氧芽孢细菌和兼性厌氧细菌同样繁殖增 加, 平板计数法的结果是好氧细菌和兼性厌氧细菌总数 的叠加,数据难以反映真实情况的推论。 2.3酵母菌数量变化 图 1好氧细菌发酵动态 图 2兼性厌氧细菌发酵动态 18 !“ !“ !“ !“ 图 3酵母菌发酵动态 窖池中层和下层糟醅中酵母菌数量变化及趋势见图 3。 入窖酵母菌数量也为1.2105个/g糟醅,稍少于入窖 好氧细菌和兼性厌氧细菌。 但发酵到第9天即达107数 量级,远高于同期好氧细菌和兼性厌氧细菌数量,说明糟 醅环境更利于酵母菌,使酵母菌率先成为绝对优势菌群。 糟醅中层酵母菌在第9天达顶峰随后降至105个/g 糟醅数量级,持续下降至发酵30 d后,逐步趋近为零。 原 因是随着发酵过程的进行, 窖内环境已转变为厌氧、高 酸、高酒精浓度,已不适合酵母菌生长繁殖。 下层糟醅酵母菌数量在发酵前6 d内高于中层糟 醅,这是由于窖池体积大,每隔2 h投入1层酒醅,而且 酵母世代增殖很快(20 min一代),因而下层糟醅酵母菌 先于中层进行繁殖。 2.4霉菌数量变化 窖池中层和下层糟醅中霉菌数量变化见图4。 霉菌 封窖时数量为4000个/g糟醅,在入窖封窖后的6 d内快 速上升,后急剧下降,18 d后变化平缓,稍有波动,逐渐减 少,至发酵后期仍有霉菌检出。 原因是好氧细菌、部分兼 性厌氧细菌、酵母菌的大量繁殖,消耗了氧气,并生成有 抑制作用的酒精、有机酸等代谢产物。峰值出现时间与乔 宗伟的研究结果有差异。 这也说明,糟醅中淀粉的糖化酶类,可能主要是来源 于大曲,制曲过程一定意义上也是淀粉酶生产过程。 3结论 3.1在浓香型白酒窖内发酵过程中, 兼性厌氧细菌、酵 母菌起主导作用,好氧菌的作用还有待解析,糟醅淀粉的 糖化酶类可能主要是来源于大曲。 3.2好氧细菌芽孢和兼性厌氧细菌同样在好氧细菌的 培养基中繁殖, 造成平板计数法使数据为好氧细菌和兼 性厌氧细菌总数的叠加,难以反映真实情况。在发酵18 d 后,窖内应无正常好氧细菌代谢。 3.3兼性厌氧细菌一直占据细菌菌群的主导地位,数量 峰值边中层出现在发酵第9天,边下层出现在发酵第15 天。发酵中后期稳定于105个/g糟醅数天,中层最低降至 104个/g糟醅,之后又有一个上升过程。 兼性厌氧细菌有 从窖泥移动到近端糟醅, 再从近端移向远端糟醅的迁移 规律。 3.4发酵前期,酵母菌是绝对优势菌群,峰值达107个/g 糟醅数量级,发酵30 d后,酵母数量迅速下降,至开窖几 乎检不出酵母的存在。 3.5霉菌在入窖封窖后6 d内快速达到峰值, 后急剧下 降,数量变化平缓,逐渐减少,但直至发酵中后期仍有霉 菌检出。 参考文献: 1陈敏.浓香型酒发酵过程中糟醅微生物动态研究J.酿酒科 技, 1998, (5):26-28. 2罗志腾.大曲发酵酒醅微生物区系的初步研究J.微生物学通 报, 1986, (2):59-60. 3乔宗伟,张文学,张丽莺,张其圣,岳元媛.浓香型白酒发酵过 程中酒醅的微生物区系分析J.酿酒, 2005, (1):18-21. 4赵东,乔宗伟,彭志云.浓香型白酒发酵过程中酒醅微生物区 系及其生态因子演变研究J.酿酒科技, 2007, (7):37-39. 5沈才洪,张永志,薛志序,张良.泸型酒窖内发酵模式初探J. 酿酒科技, 1993, (2):31-34. 6李璐,冯学愚,谢善慈,等.浓香型酒香型的一种可能成因-窖 池微生物的迁移J.中国酿造, 2010, (1):48-49. 蒲岚, 李璐, 谢善慈, 游玲, 沈亮亮, 冯学愚 , 邱树毅, 许德富,

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