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China Brewing 2009 No.4 SerialNo.205 在海南省用木醋杆菌以自然发酵椰子水为培养基生 产细菌纤维素已10余年。人们致力于椰子水培养基的优 化， 以促使木醋杆菌能又快又好地生产细菌纤维。但由于 椰子水自然发酵条件的差异， 不同的椰子水， 同样的产纤 维培养基配方， 纤维素产量差异较大。为了探寻不同的椰 子水对木醋杆菌产纤维素的影响规律，本实验就发酵方 式、 发酵时间、 发酵温度、 发酵前加水稀释等不同的椰子 水， 制备成木醋杆菌产纤维素的培养基， 通过纤维素的产 量考察椰子水自然发酵条件对纤维素生产的影响。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 木醋杆菌： 本实验室分离保藏 （经中科院微生物研究 所鉴定 ） 。 1.1.2 培养基 斜面种子培养基： 2%葡萄糖， 0.5%酵母膏， 0.5%蛋白 胨， 0.27% Na2HPO4， 0.115%柠檬酸， 2%琼脂，自然pH值， 121灭菌15min。 椰子水培养基：自然发酵椰子水，白砂糖4%， 0.3% （NH4）2SO4， 0.1%KH2PO4， 0.05%MgSO4， 用10%NaOH或10% 椰子水自然发酵条件对细菌纤维素生产的影响 王志国1， 钟春燕2， 王锡彬1， 郑瑞1 （1. 海南大学 食品学院食品科学与工程系， 海南 海口 570228； 2. 海南椰国食品有限公司， 海南 海口 570311 ） 摘要： 将不同来源的椰子水 （露置与密封、 发酵时间、 发酵温度、 发酵前加水稀释等 ） 制备成木醋杆菌产纤维的培养基， 考察椰子水 对纤维素产量的影响。结果表明： 椰子水在20、 露置、 自然发酵20d后最适合用于木醋杆菌生产细菌纤维素， 椰子水自然发酵前不 要对其进行稀释， 自然发酵椰子水中乙酸含量是决定纤维素产量的决定性因素。 关键词： 椰子水； 自然发酵； 细菌纤维素 中图分类号： Q93-335文献标识码： A文章编号： 0254-0571(2009)04-0032-03 Effects of natural fermentation conditions of coconut juice on the production of bacterial cellulose WANG Zhiguo1, ZHONG Chunyan2, WANG Xibin1, ZHENG Rui1 (1. Department of Food Science and Technology, College of Food, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Hainan Yeguo Foods Co., Ltd., Haikou 570311, China) Abstract：A series of coconut juice fermented under different conditions （including fermentation time, fermentation temperature, fermentation exposed to air or not and fermentation after diluted with water ） were used as medium for Acebacter xylinum to produce cellulose. The result showed that the coconut juice, which was naturally fermented at 20 for 20 d without cover and dilution, was the best medium for cellulose output by A. xylinum. The concentration of acetic acid in fermented coconut juice was the crucial factor affecting cellulose output. Key words:coconut juice; natural fermentation; bacterial cellulose 收稿日期： 2008-12-01 基金项目： 国家科技支撑计划 （2007BAD76B01 ） 作者简介： 王志国 （1974- ） ， 讲师， 研究方向为食品微生物。 6 任大喜， 郭鸰， 霍贵成. 体外模拟法研究生物利用率的影响因素J. 食品科技， 2007 （4 ） ： 12-14. 7 刘先国.生理学M.北京科学出版社， 2003. 8 FALLINGBORG J. 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Modeling of enzymatic protein hydrolysis J.Process Biochem，1999， 35： 111-117. Research Report32 2009 年 第 4 期 中国酿造 总第 205 期 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 48121620 密封 敞开 乙酸/% 发酵时间/d 图 1 发酵方式对椰子水中乙酸含量的影响 Figure 1. Effect of fermentation modes on acetic acid degree of coconut juice HCl调节pH值为4.5， 105消毒15min。 1.2 方法 种子液制备：挑取斜面种子培养基上的菌落接种于 椰子水培养基中 （椰子水于20， 敞开， 自然发酵10d ） ， 30 发酵4d， 备用。 发酵方式的影响： 成熟椰子破壳取水， 置于玻璃瓶中， 分别密封与敞开， 置于20发酵， 并于4d、 8d、 12d、 16d、 20d 取椰子水， 制作椰子水培养基， 灭菌后按5%量接入木醋杆 菌种子液， 于30人工气候箱发酵8d， 收获纤维素， 处理、 干 燥并测定， 与此同时测定这些椰子水中乙醇、 乙酸的含量。 发酵温度的影响： 成熟椰子破壳取水， 置于玻璃瓶中， 于20、 30、 40人工气候箱中敞开式发酵15d，其余操 作同上， 与此同时测定这些椰子水中乙酸的含量。 发酵时间的影响： 成熟椰子破壳取水， 置于玻璃瓶中， 敞开， 20， 自然发酵10d、 20d、 30d， 40d， 其余操作同上。 发酵前加水稀释： 成熟椰子破壳取水， 按椰子水/自来 水的比例 （v/v ） 为10、 11、 13、 15混合后， 置于玻璃瓶中， 敞开20自然发酵15d， 其余操作同上。 纤维素量的测定： 收集纤维素， 置于80、 0.1mol/L NaOH溶液中维持2h， 冷却后用0.1mol/L HCl中和， 自来水 充分洗涤， 80干燥至恒重1。 乙醇测定：参照GB/T 12143.5-1992浓缩果汁中乙醇 的测定。 乙酸测定： 水蒸气蒸馏法测定乙酸。 2 结果与分析 2.1 发酵方式的影响 在密封及敞开条件下20自然发酵的椰子水所制成 的培养基， 其纤维素的产量有较大的差别， 结果见表1。 从表1可以看出， 椰子水发酵方式不同， 纤维素产量 有较大影响：敞开条件下的椰子水更有利于用于生产细 菌纤维素， 产量几乎是密封条件下的2倍。 对不同发酵方式的椰子水进行了乙酸、 乙醇含量的测 定。从乙酸测定结果 （图1 ） 可见， 露置条件下椰子水中乙酸 含量都较密封中的高， 而乙酸促进木醋杆菌产生纤维素2。 乙醇含量测定结果 （表2 ） 显示， 露置条件下椰子水中几 乎没有乙醇产生，而密封条件下椰子水中的乙醇含量随发 酵时间延长而增加， 发酵至20d时含量最高达到0.32%vol。 尽管乙醇也促进木醋杆菌产生纤维素，但此时椰子 水中乙醇的含量较低，因为在前面的研究中已经证明2%vol 的乙醇才使纤维素的产量达到最高3。 很多细菌纤维素生产厂家为了椰子水运输方便或者避 免椰子水贮放时被苍蝇等害虫的污染， 常常加盖密封， 这势 必造成椰子水中乙酸含量低， 因此纤维素产量必然下降。 2.2 发酵温度的影响 不同的温度条件下自然发酵15d的椰子水中乙酸含量 差别较大， 结果 （图2 ） 可以看出， 20时乙酸含量最高， 随 着温度升高， 乙酸含量降低， 但30与40时差别不大。 与 此相对应， 由这些椰子水制成的培养基， 经木醋杆菌发酵 生成的纤维素量也有差异，纤维素产量的差异与乙酸的 量差异的规律性一致， 即在20时自然发酵椰子水中乙酸 含量高， 纤维素得率高， 达到2.16g/L。这也说明椰子水中 乙酸含量是决定木醋杆菌产纤维素量的决定性因素。 海南椰子收获旺季在5月和10月， 此时气温较高， 因 此， 欲使自然发酵椰子水能稳定地生产细菌纤维素， 最好 将椰子水置于阴凉通风处。有条件的可以将其置于冷水 浴中， 以保证椰子水中有足够数量的乙酸。 2.3 发酵时间的影响 椰子水露置于20， 分别发酵10d、 20d、 30d、 40d， 将这 些椰子水制成纤维素生产培养基， 纤维素的产量不同， 20d 内， 随着时间延长， 纤维素产量增加， 发酵超过20d后的椰 子水所制成的培养基， 纤维素产量比20d时下降了约24%， 如果椰子水继续放置至40d，纤维素产量仅为1.32g/L， 比 20d时的椰子水下降了约50%。 表 1 椰子水发酵方式对纤维素产量的影响 Table 1. Effect of fermentation modes on cellulose yield g/L 发酵方式 发酵时间/d 48121620 敞开 密封 1.652.182.342.682.16 1.191.041.091.251.57 研究报告 表 2 不同发酵方式对椰子水中乙醇含量的影响 Table 2. Effect of fermenting methods on the concentration of ethanol %vol 发酵方式 发酵时间/d 48121620 露置 密封 00000 0.000.32 33 China Brewing 2009 No.4 SerialNo.205 图 2 发酵温度 （A ） 、 发酵时间 （B ） 对椰子水中乙酸含量及相应培养基纤 维素的影响 Figure 2.Effectoffermentation temperature and time on alcoholdegree of coconut juice and cellulose yield 乙酸含量+纤维素产量 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 203040 2.50 2.00 1.50 1.00 0.50 0.00 乙酸/% 纤维素产量/ （g L-1） 发酵温度/ + + + A + + + + 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 10203040 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 乙酸/% 纤维素量/ （g L-1） 发酵时间/d B 2.5 2 1.5 1 0.5 0 10111315 纤维素产量/ （g L-1） 稀释比例 （椰子水水 ） 图 3 椰子水加水稀释对纤维素产量的影响 Figure 3. Effect of the water dilution of coconut juice on cellulose yield 椰子水放置时间过长，可能此时其他能利用乙酸的 微生物将乙酸分解， 从而降低了乙酸的含量， 因此纤维素 产量必然下降。 2.4 椰子水中加水稀释的影响 椰子水自然发酵前加入自来水， 经发酵后的椰子水制 成产纤维素培养基， 结果 （图3 ） 可以看出， 加水稀释降低了 纤维素产量， 即使稀释一倍， 也会使纤维素产量下降约37%， 随着稀释比例的提高， 纤维素产量越低， 在15的稀释比例 的椰子水中， 纤维素产量仅为0.65g/L。 因此， 为了保证纤维素的稳定生产， 加强原料的验收 也十分有必要。一些小型工厂为了增加售卖椰子水的商 业收入， 往椰子水中加水， 这种椰子水经自然发酵后， 仅凭 感官很难鉴别出来，但通过测定其中的乙酸含量或者灰 分含量就能鉴别其真伪。 3 结论 椰子水在20露置自然发酵20d后最适合用于木醋杆 菌生产细菌纤维素，椰子水自然发酵前不要对其进行稀 释。自然发酵椰子水中乙酸含量是决定纤维素产量的决 定性因素， 刘四新等4曾直接用新鲜椰子水用于生产细菌 纤维素， 但必须用乙酸调节培养基pH值， 如果用其他的无 机酸或有机酸调节pH值， 皆不能产生纤维素。 自然发酵的 椰子水用于生产纤维素， 无需添加醋酸， 而且自然发酵椰 子水中乙酸含量高， 缓冲能力强， 其纤维素产量高于新鲜 椰子水。 参考文献： 1 SON H J， KIM H G.， KIM K K， et al. Increased production of bacterial cellulose byAcetobactersp. V6 in synthetic media under shaking culture conditions J.Biores Techonol， 2003， 86 （3 ） ： 215-219. 2 王志国， 韦燕来， 韦茂山， 等. 有机酸在合成培养基中对木醋杆菌合成 纤维素的影响J.食品科学， 2008 （5 ） ：