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一 = =J D 2 0 1 0年 1 0月 第 3 1 卷 第 1 0 期 食品 研究与 开:;莨 基 础 研 究 荔枝果肉过氧化物酶提取与初步纯化 刘春丽 , 杨跃寰 , 边名鸿 ( 1 四川理工学院, 四川 自贡 6 4 3 0 0 0 ; 2 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所, 广东省农产品加工公共实验 室 , 广东 广州 5 1 0 6 1 0 ) 摘要: 酶促褐 变是影响荔枝果 肉加 工和贮藏的重要 问题 , 过氧化物酶( P O D ) 被认 为是参与酶促褐变的重要酶类。 用 丙酮粉磷 酸缓冲液提取 荔枝果 肉中的过氧化物酶, 提取 液最佳 离子浓度 为 0 3 m o ff L 、 最适 p H为 7 、 最佳提取 时间为 3 0 mi n , 最适料液比为 l : 1 5 ( g : m L ) 。通过 丙酮粉缓冲液提取 , 硫 酸铵沉淀和 D E A E S e p h a r o s e FF层析进行初步纯化 。 该酶被纯化了 7 3 倍 , 得率为 6 4。 关键词 : 荔枝 果肉; 过氧化物酶 ; 提取 ; 纯化 Ex t r a c t i o n a nd Pur i fic a t i o n o f Pe r o x i d a s e f r o m Li t c hi Pu l p L I U Ch u n l i 0 ,YANG Yu e h u a n 。BI AN Mi n g h o n g ( 1 S i c h u a n Un i v e r s i t y o f S c i e n c e & E n g i n e e ri n g , Z i g o n g 6 4 3 0 0 0, S i c h u a n , C h i n a ; 2 S e r i c u l t u r eF a m P r o d u c t Pr o c e s s i n g Re s e a r c h I n s t i t u t e,Gu a n g d o n g Ac a d e my o f Ag r i c u l t u r a l S c i e n c e,Gu a n g d o n g Op e n Ac c e s s L a b o r a t o r y o f P r o d u c t P r o c e s s i n g , Gu a n g z h o u 5 1 0 6 1 0 , G u a n g d o n g , C h i n a ) Ab s t r a c t :En z y me b r o wn i n g i s o n e o f t h e mo s t r e a c t i o n s i mp a c t i n g q u a l i t y o f l i t c h i p u l p P e r o x i d a s e i s a k e y e n z y me i n d u i n g e n z y me b r o wn i n g P e r o x i d a s e f r o m l i t c h i p u l p wa s e x t r a c t e d b y a c e t o n e p o wd e r a n d p h o s p h a t e b u ff e r a n d p u rifie d b y a mmo ni u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n a n d DEAE-S e p h a r o s e F F h y d r o p ho b i c c h r o ma t o g r a p h y Hi g h e s t e n z y me a c t i v i t i e s we r e o b t a i n e d i n a 0 3 mo l L p h o s p h a t e f r o m a c e t o n e p o wd e r a t p H 7 0 , t h e o p t i mu m e x t r a c t i n g t i me i s 3 0 mi n a n d 1 : 1 5 ( g : mL )o f t h e b e s t s o l i d t o l i q u i d P OD fr o m l i t e h i p u l p w a s p u r i fi e d b y 7 3 f o l d a n dt h e y i e l dwa s 6 4 Ke y wo r d s : L i t c h i p u l p; p e r o x i d a s e ; e x t r a c t i o n; p u ri fic a t i o n 荔 枝( L i t c h i c h i n e n s i s S o n n ) 是 无 患 子 科 ( S a p i n d a c e a e ) 荔枝属植物 , 原产于中国。 我 国的荔枝是 种植 面积最大的热带水果 , 产量超过全球产量的 6 0 。 作者简介: 刘春丽( 1 9 8 1 一) , 女( 汉 ) , 助理实验师, 硕士, 研究方向 农产品J J n 3 与贮藏 。 由于其采收期是在夏季高温季节,加之其特殊的结构 和生理特征 , 如果在旺季采收后不及时处理 , 极易发生 褐变和腐烂变质 , 造成严重的经济损 失1-” 。要解决上述 问题, 必须大力发展荔枝加工业, 特别是能大量消耗原 料、产品市场广泛的浓缩汁深加工。但荔枝汁在加工 和贮藏过程中易发生褐变,这严重影响了产品的感官 I ,【 - 参考文献 : l 徐方 食用真菌的药用价值J I 宁夏 医学院学报 , 1 9 9 0 , 1 2 ( 1 ) : 4 6 _ 1 4 8 2 J 郭渝南 , 刘 晓玲 , 范娟 竹荪 的营养 与药厢功效 J I 食 用菌 , 2 0 0 4 ( 4 ) : 4 4 4 5 3 】 暴增海 , 马桂珍 我国的竹荪 资源及其开发 利用f J 资源科 学 , l 9 9 4 ( 3 ) : 6 8 7 1 f 4 】 朱利泉, 邓艳霞竹荪 的研究与利用口 中国野生植物 资源 , 2 0 0 0 ( 3 ) : 2 1 - 2 3 5 】 檀东飞 , 梁呜 棘托 竹荪 乙酸乙酯提取物的化学成 分研究 J J _天 然产物研究 与开发 , 2 0 0 3 , 1 5 ( t ) : 3 4 3 7 6 谭敬军 , 胡亚平 竹荪抑菌作用研究 【 J 】 食 品科学 , 2 0 0 0 , 2 1 ( 1 o ) : 5 4 - 5 6 7 】 马同锁 , 张红兵 十三种天 然香辛料 的抑菌作用研究 【 J 】 山西食 品工业 , 2 0 0 5 ( 1 1 : 8 1 0 , 1 6 【 8 】徐宝才 天然食品防腐剂 的研究【 J 】 食品与机械 , 2 0 0 1 ( 3 ) : 4 7 收稿 日期: 2 0 1 0 - 0 8 0 9 基 础 研 究 食品研究与开发 2 0 1 0 年 1 0 月 第 3 1 卷 第 1 O 期 质量和商品价值。在酶促褐变中,多酚氧化酶( P P O, E C 1 1 0 3 1 ) 是引起果 蔬褐变 的关键 酶类 , 近 年来对 于 另一氧化 还原 酶 即过 氧化 物酶 在果蔬 采 后酶 促褐 变 的生 理过程 中所起 的作用也越来越 重视l 2 3 】 , 有研究 者 认 为过氧化物酶和 多酚氧化酶一样 , 与果实 褐变密 切 相关 , 并在果实褐变 中起着非常重要的作用l4 1 。前人 对 分离提纯植物 中的 P O D已有 过不少报导 , 如豆壳l 5 】 、 甘 蔗苗_ 6 1 、 荔枝 果皮 l 7 l 、 龙 眼果皮 I 、 莲藕 l 9 _ 、 银杏 叶l l0 1 、 笋 壳I u 瞎 。 然而迄今为止 , 少见有关荔枝果 肉酶促褐变 的 相关报道 , 因而对果 肉中的 P O D的性质缺乏认识 。该 试验 对荔枝 果 肉多酚 氧化 酶 的提取 和初 步纯化 进行 研究 , 以便对果 肉P O D的性质作进一步研究 , 拟为解 决荔枝深加工 中酶促褐变问题提供理论 。 1 材料与方法 1 1 材料与仪器 荔枝 ( 怀枝 ) : 购于广东丛化 , 其余 品种市售 , 去 皮 , 贮藏于一 1 8 E 冷库 中备用 。 磷酸 氢二钠 、 磷酸 二氢钠 、 柠檬 酸 、 柠檬 酸钠 、 硫 酸铵 、 愈创 木酚等均为分 析纯 。 T D L 一 5 一 A台式 离心 机 :上 海安 宁 科学 仪 器 厂 ; P H S 一 2 5 精密 p H计 : 上海虹益仪器仪表有限公司; U V 一 1 8 0 0紫外可见 分光光度计 :岛津 ; S B S 一 1 0 0数控计 滴 自动部分收集器 、 H D 一 3紫外检测仪 、 HL 一 2型恒流泵: 上海沪两分析仪器厂有 限公司; 8 5 2恒温磁力搅拌 器: 常州澳华仪器有限公司; X WT S 小型台式记录仪 : 上海 自动化仪表 厂 1 2 方法 1 2 1 P OD活性测定方法 参照陈贻竹和王以柔 的方法 , 并稍作修改。 P O D 测定 系统为 3 m L , 其 中含 2 4 m L 磷 酸缓 冲液 ( p H 7 0 ) 、 0 1 m L 1 过氧化氢 、 O 4 mL 1 愈创木酚 。加入 0 1 m L 酶液后启动反应 ,于波长 4 7 0 n m和室温下 记录 2 m i n 内O D值的变化。 一个酶单位( u) 定义为在测定条件下 每分钟引起的光密度改变 0 0 0 1 所需的酶量。 1 2 2 丙 酮粉 的制备 将备用荔枝果 肉 自然解冻后 , 去核 , 与一 2 0丙酮 以 1 : 2 混合后立即置于组织捣碎机中捣碎 , 抽滤, 同时 以适 量丙酮 淋洗 滤饼 ,将半 干滤 饼置 于通 风厨 中风 干 , 即得荔枝果 肉丙酮 粉。 1 2 3 过氧化物酶粗酶液 的提取 取干燥 丙酮粉 适嚣 ,在 低温 条件 下用不 同料液 比、 不 同浓度 、 不 同 p H的磷酸 缓 冲液 浸提 一定时 问 , 两层滤布追滤 , 镣厝 4 5 0 0 r rai n离小 2 0 rai n , 上清液 即 H= - 为粗 酶液 。 1 2 4 粗酶液的硫酸铵分级沉淀 向制取的粗酶液中边搅拌边加入 固体硫酸铵至 3 0饱和度 , 4 5 0 0 r m i n 离心 2 0 m i n , 弃沉淀 。继续 向 上清液 中加入硫酸铵至 8 0 饱和度 , 搅拌 、 静置 1 h 2 h , 然 后 于 4 5 0 0 r m i n离心 2 0 m i n ,弃 上清 液 。沉淀 用 0 0 5 m o l L的磷 酸缓 冲液( p H 7 0 ) 溶解 , 并 以 同样 的缓 冲液透析过夜, 透析液以 4 5 0 0 r ra i n离心 2 0 m i n , 弃沉 淀取上清液 , 得 P O D酶液7 1 。 1 2 5 D E A E S e p h a r o s e F F离子交换柱分离纯化 P O D 将上述酶提取液上 D E A E S e p h a r o s e 层析柱( 2 e m X 2 0 c m) , 树 酯装柱 ( 1 0 m E ) 后用 0 0 1 m o U L的 t r i s H C L 缓 冲液 ( p H 8 0 ) 平衡 , 待记 录纸 上 曲线平 稳后 开始 上 样, 紫外检测波长为 2 8 0 n m, 灵敏度为 0 0 5 A, 流速为 0 5 m L m i n , 上样完毕后 , 用相同的缓冲液进行洗脱, 待 记 录纸 上 曲线 平稳 后 ,再 用 含 0 m o l L 0 5 m o l L的 N a C 1 的 t r i s H C L盐 酸缓 冲液进行离 子强度 线形梯 度 洗 脱 , 收集 具有较 高 P O D酶活性 的部分 , 缓 冲液透 析 过夜后存 放于冰箱冷冻室 , 备用 。 1 2 6 蛋 白测定方法 可溶性 蛋白质含量测定采用 B r a d f o r d 的考马斯 亮 蓝 G = 2 5 0比色法 。 2结果与分析 2 1 不同品种荔枝果 肉过氧化物酶 ( P O D) 的活力 试验测定 了 1 6种荔 枝果肉 中 P O D活力见图 1 。 1 8 0 0 2 8 8 1 2 0 0 1 00 0 80 0 60 0 4 2 0 o8 0 制 几 几 n nnn n l 2 3 4 5 6 7 8 9 l O 1 1 1 2 1 3 l 4 1 5 1 6 荔枝品种 1 桂 味 ; 2 白腊 ; 3 三月红 ; 4 黑叶; 5 荔枝王 ; 6 白糖罂 ; 7 ,傻红 ; 8 秤砣 ; 9 鸡嘴 ; 1 0 丁香 ; 1 1 珍珠 ; 1 2 玉荷包 ; 1 3 糯米糍 ; 1 4 怀枝; 1 5 青荔 ; 1 6 妃子 。 图 1 不 同品种荔枝果 肉过氧化物酶的活力 Fi g 1 POD a c t i v i t y f r o m Li c h i p ul p o f v a r i e t y s pe c i e s 从测试结果可 以看 出: 荔 枝 品 种 间 酶 活 性 差 异 显 著 , 从 4 7 U g m i n 1 4 2 8 U g m i n 之 间。其 中青荔 的 P O D活力最高 , 而玉荷包则 最低 。品种 怀枝 为广东 省主栽 品种 , 大量应用 于工业生产 , 并且从图 1 中可以 看 出怀枝 P O D活力居 中, 因此在后续研究 中选用 怀枝 作 为研究 P O D性质的主要品种 。 1 2 3 1 0 食品 研究与开发 第 卷 第 1 期 瓦 叩 研 丌提 基 础 研 究 2 I 2 磷酸缓 冲液提取丙酮粉酶活力 比较 2 2 1 提取时间对 P O D酶活的影响 称取 3 g丙酮 粉 , 在 料 液 比 1 : 1 0 ( g : m L ) 、 提取 液 p H值为 7 、提取液离子浓度为 0 1 m o l L的条件下 , 考 察提取时间对提取酶活的影响 , 结果 见图 2 。 一 昌 言 魍 鞋 提取时1 3 m i n 图 2 提取时 间对 P OD酶活的影响 Fi g 2 Effe c t o f e x t r a c t i ng t i me o n POD a c t i v i t y 由图 2看 出, 在 提取时 间 1 0 ra i n的时问 内 , 酶活 仅为 7 6 3 U m L ,随着提取 时间的延 长, P O D酶活有所 提高 , 当提取时间延 长至 3 0 m i n时 , 酶活增加 到 1 1 7 7 U mL 。 随着浸提时间的进一步的延长 , P O D酶活 几乎保持不变( P 0 0 5 ) 。这表明 , 当提取 时间为 1 0 mi n 时, 丙酮粉未能充分复水溶出, 而当时间延长至 3 0 ra i n 时, 丙酮粉已充分溶出, 提取酶活达到最大值 ; 而当时 间再延长时, 丙酮粉酶活力不再增加 , J L 乎保持不变。 从 中也 可看 出 , 用丙酮粉提取 P O D时 , 影响酶 活的某 些物质 , 如酚类物质和杂质等 已经在制备丙 酮粉 时被 部分 除去 , 因而 随着提取 时间的 延长 , 提取 液颜色 虽 有一定加深 , 但酶活几乎保持不变 。 2 2 2 提取液离子浓度对 P O D酶活 的影响 称取 3 g 丙酮粉 , 在 料液 比为 1 : 1 0时 、 提取液 p H 值为 7 , 提取时间为 3 0ra i n时 , 考察提取液离子浓度对 P O D酶活的影 响, 结果见图 3 。 0 f 龉 离 子浓 度 【 m0 I I ) 图 3 提取液离子浓度对 P OD酶活的影响 Fi g 3 Effe c t o f e x t r a c t i r o n c o n c e n t r a t i o n o n POD a c t i v i t y 由图 3 可知 : 随着离子 浓度 的逐 步增加 , 提取 液 酶活 不断增大 ;当提取 液离 子浓度增 加 到 0 3 m o l L 时 , 提取 液酶活达 到最大值 ; 而随着 离子浓度 的进一 步增大, 酶活则呈下降趋势。在试验中, 当提取液为蒸 馏水 时( 即离 子浓度为 0 m o l L ) , 提取酶活最低 , 因而 一 般情况下 , 提取酶活时应选用适合 的缓 冲液体 系。 2 2 - 3 提取液 p H值对 P O D酶活的影 响 称取 3 g 丙酮粉 , 在料液 比为 l : 1 0 ( g : m L ) 、 提取离 子浓度为 0 3 m o l L ,提取时间为 3 0 m i n ,考察提取液 p H值对 P O D酶活的影响 , 结果见 图 4 。 l 40 0 1 2 0 0 :l 0 0 0 8 0 0 磊6 0 0 龌4 0 0 20 0 O p H值 图 4 提取液 p H 值对 P OD酶活的影响 Fi g 4 Effe c t o fe x t r a c t p H o n POD a c t i v i t y 当提取液 p H值分别为 5和 7的时候 ,提取酶活 都达到峰值。 由P O D的酶学性质可知, p H值 5 是 P O D 的最适反应 p H 。这可能是造成提取液 p H为 5时 , 提 取酶活也比较大的原因之一。但由于 P O D在 p H为 5 时 , 酶 活稳定性不 高 , 因此选用 p H 7 为提取液最佳 p H 值 。 2 2 4 提取液料液 比对 P O D酶活 的影响 称取 3 g 丙酮粉, 在提取离子浓度为 0 , 3 m o l L , 提 取时问为 3 0 ra i n , 提取液 p H值为 7 时, 考察料液比对 P O D酶活的影响 , 结果 见图 5 。 4 00 00 3 5 0 00 3 O0 00 2 5 0 0 0 2 00 0 0 1 5 0 0 0 l 000 0 5 00 0 0 料液 t L ( g m L) 图 5 料液 比对 P OD酶活的影响 Fi g 5 Effe c t o f e x t r a c t r a t i o o n POD a c t i v i t y 随着料液 比的不 断增 加 ,提取液 酶活不 断增 大 。 这主要是 因为料液 比不断增 加时 , P O D酶 充分溶 出 , 酶活增 大 ; 另一方 面 , 料 液 比的增大也 使 P O D酶液稀 释 , 酶活有所 降低 。当料 液 比为 l : 1 5 ( g : m L ) 时 , 酶活达 到较大值 , 而随着料液 比的继续增大 , 酶活变化差异不 显著f P 0 0 5 ) 。 考虑到料液 比较大会给后续 的进一步纯 化带来不便 , 因而选取最适料液比为 1 : 1 5 。 2 - 3 D E A E S e p h a r o s e F F柱部分分离纯化 P O D 将经过硫酸铵分级沉淀, 透析浓缩后的P O D酶液 0 0 0 O O 0 O O 加 加 基 础 研 究 食品研究与开发 2 0 1 0 年 1 0 月 第 3 1 卷 第 1 0 期 上柱进行初 步纯化 。以低盐溶液挂柱 ,高盐溶液进行 洗脱 , 对洗脱液进行紫外监测 , 并收集和测定每管 的酶 活。图 6为 D E A E S e p h a r o s e F F离子交换层析的洗脱 曲线。 3 O 0O 2 5 00 2 0 00 、 兰 l 5 0 0 诧 ,0 0 0 窿 5 O O 0 0 管数 图 6 P OD D EA E S e p h a r o s e F F柱层析 Fi g 6 El ut i o n p r o fil e s o f POD b y DEAE- Se p ha r o s e F F 图 6结果表 明 : 在收集过程 中先 出现一个较 大 的 蛋 白质峰 , 随后 出现 2个小峰 。第 1 个峰对应 的 P O D 活性较低, 杂蛋白含量高。第 2个峰对应的 P O D活性 高 , 是分离 的主要蛋 白峰 。其 它蛋 白含 量较低 的组分 均没有 检测 到 P O D活性 。 2 4 纯化倍数与回收率 荔 枝果 肉 P O D分离纯 化倍数 与回收率见表 1 。 表 1 荔枝果 肉 P OD分离纯化 表 Ta bl e l P ur i fic a t i o n o f p e r o x i da s e f r o m l i t c h i p e r i c a r p 我们通过丙 酮粉缓 冲液提 取优化 、 硫酸铵 分级沉 淀 和 D E A E S e p h a r o s e F F离子 交换 柱层 析 等步骤 初 步分离纯化了荔枝果 肉中 P O D酶 。 纯化倍数 为 7 3 , 得 率为 6 4。庞学群 l 7 i等对荔枝果皮 P O D的研 究表明 , 纯化倍数和得率分 别为 5 5和 7 4。而有 阙瑞琦 1 从 莲藕 中分离纯化 P O D时 , 纯化倍数 1 7 6 2 , 得率 2 7 5 3 。 综 合各方 面的研究 , 可以看 出 P O D酶分离纯化受 到很 多因素 的影响 : 不 同植物来源 , 分离纯 化步骤 的选择 , 不 同型号的层析柱等 。 3 结论 1 ) 用丙酮粉法缓 冲液 提取过氧化 物酶 , P O D酶 活 1 3 的 最 佳 提 取 时 间 为 3 0 m i n ,当提 取 液 离 子 浓 度 为 0 3 m o l L , P O D酶活最 高 ; 提取液 的最佳提取 p H为 7 ; 最适料液 比为 1 : 1 5 ( g : m L ) 。 2 ) 在 l 6个被 测荔 枝 品种 中 , 白糖罂 的多酚 氧化 酶 活 力最 强 , 为 1 1 2 U g m i n , 而 玉荷 包 最 弱 , 仅 为 6 U g ra i n ; 青荔的过氧化物酶活力最强 , 为 1 5 4 2 U g m i n , 同样也是玉荷包 的过氧化物酶活力最弱。在广东省 的 主栽 品种怀枝和黑叶 中 , 选取 P O D酶活都居中的怀枝 作为研究酶促褐变的主要品种。 3 ) 硫酸铵分级沉 淀后粗 酶经 D EA E S e p h a r o s e F F 离子交换层析纯化后, P O D酶被纯化了 7 3 倍 , 得率为 6 4 参考文献 : 1 】 苏美霞 , 吴振先 , 韩冬梅 荔枝贮藏保鲜及加工技术 M 北京 : 中 国农业 出版社, 2 0 0 0 2 】 T i a n S P , X u Y , J i a n g A L , e t a 1 C h a n g e s i n e n z y ma t i c a c t i v i t y a n d q u a l i t y a t t r i b u t e s o f l a t e ma t u r e p e a c h e s i n r e s p o n s e t o c o n t r o l l e d a t m o s p h e r e c o n d u c t i o n s J A g r i c S c i i n C h i n a , 2 0 0 2 , 1 ( 2 ) : 2 0 7 - 2 1 2 3 】 G o n g Q Q, T i a n S P P a r ti a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f s o l u b l e p e r o x id a s e i n

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