一种用于葡萄酒多糖组分鉴定的薄层层析法.pdf

42008.05 试验研究 一种用于葡萄酒多糖组分鉴定的 薄层层析法 张艳芳，陈代，闻亚琴，朱银艳，潘秋红* （中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083） 摘 要：本研究通过比较几种展层剂对常见单糖的分离效果，初步建立了鉴别葡萄酒中多糖组分的薄 层层析法。结果表明，利用乙醇沉淀法提取葡萄酒中的粗多糖，用Sevage法除去蛋白，透析法除去小分子 物质，展层剂乙酸乙酯-正丁醇-异丙醇-嘧啶-醋酸-水（34-12-21-10-12-10）展层，即可获得很好的鉴别效 果。应用该试验体系分析了澄清、浑浊和沉淀葡萄酒中的多糖组成主要以葡萄糖、阿拉伯糖、少量的鼠李 糖和半乳糖为主。 关键词：葡萄酒多糖；分离；展层剂；薄层层析法 中图分类号： O658.1 文献标识码：A A thin-layer chromatography method for the identification of wine polysaccharides Zhang Yanfang, Chen Dai, Wen Yaqin, Zhu Yinyan, Pan Qiuhong* (College of Food Science and Nutritional Engineering, China Argicultural University，Beijing 100083) Abstract: This study investigated the effects of several developing solvents on the separation of monosaccharides and developed a thin-layer chromatography method for the identification of wine polysaccharides. The results showed that the composition of wine polysaccharide could be well identified through a series of procedure, including the preparation of crude extract by 80% ethanol precipitation, the removal of protein by Sevage method, the decrease of pigment by dialysis and the appliance of developing solvent that is composed of ethyl acetate, butanol, isopropanol, pyrimidine, acetic acid and H2O (34-12-21-10-12-10). The polysaccharides of several sample wines were assessed by the developed method and were found that these wine polysaccharides were composed of major glucose, arabinose and a few rhamnose and galactose. Key words: wine polysaccharides; separation; developing solvents; thin-layer chromatography 收稿日期：2008-06-23 作者简介：张艳芳，女，2006级硕士研究生，研究方向：葡萄酒化学。 *通迅作者：潘秋红，E-mail: panqiuhong2007 多糖是构成葡萄酒中大分子 物质的主要成分之一，与葡萄酒 的澄清稳定密切相关1-2。葡萄酒 多糖主要来源于葡萄果实、酵母 以及侵染葡萄果实的灰霉菌。 来自葡萄本身的多糖是在发 酵和榨汁过程中释放出来的，主要 包括半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖 和鼠李半乳聚糖，分子量一般在 40250 kDa。其中鼠李半乳聚糖以 二聚体的形式在酒中存在，并且能 与铅及其他阳离子形成复合物1， 这部分多糖对葡萄酒花色苷的稳定 和收敛性都有很大影响，能使酒体 有明显的柔和感3-4，但果胶对澄 试验研究 52008.05 之间的差异。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 单糖标样 半乳糖、葡萄糖、甘露糖、 阿拉伯糖、木糖、鼠李糖均为 Sigma进口分装（分析纯），各取 100mg，溶于10mL蒸馏水中，即 得到10mg/mL标准单糖溶液，放 于冰箱中存放、备用。 1.1.2 展层剂 由于展层剂一般都具有较大 的挥发性，不宜存储，必须现用 现配。 展层剂1：正丁醇-冰醋酸- 水（40-10-50）；展层剂2： 乙酸乙酯-乙醚-二氯甲烷-甲酸 （25-25-20-30）；展层剂3： 氯仿-甲醇（60-40）；展层剂 4：乙酸乙酯-正丁醇-二氯乙 烷-水（30-30-25-15）；展层剂 5：乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水 （35-30-25-10）；展层剂6：乙 酸乙酯-正丁醇-异丙醇-嘧啶-醋 酸-水（34-12-21-10-12-10）。 1.1.3 显示剂 在200mL烧杯中加入2g二苯 胺、2mL苯胺、10mL磷酸和100 mL 丙酮，搅拌混匀，如果出现白色不 溶物质可通过加热使其溶解。 1.1.4 硅胶板 SF254（美国ACS公司生产， 20cm20cm0.25mm）。用前 将硅胶板活化，即放入105烘箱 中干燥30min，取出冷却至室温。 1.1.5 葡萄酒样 2006年生产的赤霞珠干红葡 萄酒。1号样为瓶储的澄清葡萄 酒；2号和3号样均是瓶储但已出现 浑浊状态的葡萄酒；4和5号样是瓶 储的、已出现沉淀的葡萄酒。 1.2 方法 1.2.1 薄层层析法 点样：点样前用铅笔在距离 已活化的硅胶板底边2cm处画上 细线，并轻轻画出点样的起始点 标记，在薄层层析中，点样与色 斑的形成有一定的关系，要求滴加 的样品溶液原点应尽可能的小，一 般直径不超过3mm为宜。在点样 前还应将板边缘约0.5mm宽的涂层 刮去，以免引起边界效益。 点样时用微量注射器将10L 样品液或标准单糖液分多次点加 到板上，边点样边用吹风机吹干 点样原点，以便溶剂迅速挥发， 原点面积不宜太大。点样时注意 不要戳破薄层板，以免形成不规 则色斑。薄层点样力求迅速，因 为薄层板暴露时间太长，会吸收 空气中水分而改变活度，影响分 离效果。在一块板上可同时点样 67个，样点间隔2.5cm左右。 展层：需要在密闭的层析 缸中进行，首先将展层剂倒入缸 内，待缸内被展层剂蒸汽饱和， 然后将点好样的薄层板底边向下 轻轻斜置缸内溶剂中，密封好层 析缸即可。溶剂前沿距薄板上端 约2cm处时，取出板并晾干。 显色：将显示剂倒入白色 瓷盘中，把晾干的硅胶板浸入 盘中，显示剂需没过硅胶板，约 1min后，取出置于85烘箱中 20min，取出冷却至室温。记录各 斑点至原点的距离。 清和过滤的负面影响也是众所周 知的。 来自酵母中的多糖主要有线 性结构的-葡聚糖（分子量为 25270 kDa）、球形结构的甘露 糖蛋白（分子量为10450 kDa） 和几丁质5-6。酵母产多糖参与了 红葡萄酒体的形成，能使酒体变 得温和；甘露糖蛋白则有利于葡 萄酒酒石和蛋白质的稳定7。有 研究表明，向国产干白葡萄酒添 加甘露糖蛋白能够很好地解决冷 稳处理不易解决的酒石酸钙沉淀 问题，但酵母中的葡聚糖则会使 新酒难以过滤8。 来自灰霉菌的多糖主要是- 葡聚糖，分子量约为1000kDa。 在葡萄汁或葡萄酒中其浓度可以 达到每升数百毫克，会在葡萄酒 下胶和过滤过程中造成严重的 澄清或堵塞问题。在酒精存在的 情况下，葡聚糖的堵塞作用会加 剧，因为它增加了链与链之间氢 键的数量，从而形成三级空间网 格状结构1。 目前，多糖组分鉴别方法多 采用高效液相色谱法和薄层层析 法9-11，后者对实验设备和经费 的要求不高，比较适合于生产实 际。而薄层层析法鉴定在其它的 植物材料中已有很多报道，不同的 实验材料由于多糖中单糖组成的不 同，在方法上存在较大差异。本 文通过对葡萄酒多糖的提取、纯 化、水解和薄层层析法分离条件的 筛选，建立了一种简便易行的葡萄 酒多糖组分鉴别的薄层层析法，以 比较澄清和浑浊葡萄酒中多糖组分 62008.05 试验研究 1.2.2 葡萄酒多糖的制备与水解 （1）葡萄酒多糖的提取 将葡萄酒与95%乙醇以1:3.5 的比例混合后，于4下静置 24h，通过离心收集沉淀后，将沉 淀用80%乙醇洗涤多次，烘干， 即为葡萄酒粗多糖。 （2）粗多糖的纯化 利用乙醇沉淀法提取的多糖 粗溶液中含有较多的蛋白质，对 后面的薄层分析会产生影响，所 以必须对其进行纯化除去。 A去蛋白：称取2g粗多 糖，加入2mL蒸馏水，用振荡器 振荡5min左右使其充分溶解，离 心后取上清液，本试验比较了2种 去蛋白方法。 Sevage法：把氯仿和正丁醇 以5:1的比例混合后得到Sevage试 剂，将粗多糖与Sevage试剂以4:1 比例混合，剧烈振荡30min后，静 置分层，除去下层的有机溶剂和 液面交界处的胶状物。上清液按 上述比例再加入Sevage试剂，同 法处理3次。 三氯乙酸法：向多糖水溶液 中滴加3%三氯乙酸溶液，直至溶 液不再混浊为止，510静置过 夜，离心除去沉淀，即得到不含 蛋白的多糖溶液。 B去小分子：采用透析法 去除小分子糖、色素及盐类。把 去蛋白后的多糖溶液装入透析袋 中用蒸馏水透析24h，其间更换蒸 馏水3次，以提高透析效果。 C多糖的水解：将上述初 步纯化的葡萄酒多糖加入1mol/L HCl，沸水浴中酸解24h，用 Na2CO3调节pH到中性。所得的溶 液即可用于薄层分析。 2 结果与分析 2.1 不同展层剂对葡萄酒多糖中 主要单糖组分的分离效果 薄层层析分离效果的好坏， 很大程度上取决于展层剂的组 成和配比。根据本试验要求， 在展层剂组成中，必须有一组 分是对样品起溶解作用的，而 单糖易溶于水，微溶于 酸，不溶于醇、醚等有 机 溶 剂 ， 所 以 本 试 验 选择了半乳糖等6种符 合要求的展层剂对6种 单糖标样的分离效果进 行比较。从图1可以看 出， 展层剂1、6的分离 效果较好，能够将单糖 分开，但由于展层剂1所 用的显示剂是乙醇和硫 酸，显示后硅胶板的背 景呈现砖红色，不利于 观察。因此，展层剂6 的效果最好，其展层剂 体系为：乙酸乙酯-正丁 醇-异丙醇-嘧啶-醋酸-水 （34-12-21-10-12-10）， 显示剂为二苯胺2g，苯 胺2mL，磷酸10mL，丙 酮100mL。 2.2 葡萄酒多糖的纯化 图2显示了对葡萄 酒粗多糖除蛋白和小分 子物质后进行层析的 效果与未经处理的粗多 糖层析的效果。从图2 可以看出，未经处理 的粗多糖各单糖组分不能很好的 分开，大部分样品仍停在原点， 而经去蛋白和小分子物质后的粗 多糖各组分可以分开。本试验采 用了Sevage法和三氯乙酸法进行 去蛋白。Sevage法快速且操作简 单，而三氯乙酸法要放置过夜， 时间较长，且粗多糖溶液的体积 较小，不容易观察其混浊情况， 所以选用Sevage法。 试验研究 72008.05 运用Sevage法去蛋白时，第 一遍去除效果已经很明显，能清 楚看见有机溶剂与液面之间的变 性蛋白，而第二、三遍几乎看不 到变性蛋白的产生，由于每处理1 次，不但会损失一定量的多糖， 而且会增加溶液体积，加大后续 工作的难度。所以在运用Sevage 法去蛋白时，进行2次已足够了。 2.3 几种葡萄酒的多糖组分分析 分别对澄清、浑浊和沉淀葡 萄酒中的粗多糖组成进行薄层层 析法鉴定。由图3可以看出，这些 葡萄酒中的多糖主要由葡萄糖、 阿拉伯糖和少量的鼠李糖组成。 由于葡萄中的多糖主要是阿拉伯 半乳聚糖和鼠李糖半乳聚糖，而 灰霉菌多糖主要为-葡聚糖，由 此可推测出葡萄酒中的多糖主要 来源于葡萄果实中的多糖和灰霉 菌多糖。 从图3中还可看出，5个葡萄 酒样品中都明显分出3种单糖， 但葡萄糖和阿拉伯糖的点比较清 晰，而鼠李糖和半乳糖的点非常 淡，只能隐约看见，由 此可推测鼠李半乳聚糖 的含量比阿拉伯半乳聚 糖的含量少。此外，样 品25中葡萄糖对应的 点均比较明显，表明在 这些葡萄酒中可能含有 较多的葡聚糖，这可能 是导致葡萄酒浑浊或沉 淀的原因之一。 3 小结 3.1 通过比较不同展层 剂进行薄层层析对单糖 的分离效果发现，选择展层剂6： 乙酸乙酯-正丁醇-异丙醇-嘧啶-醋 酸-水（34-12-21-10-12-10），显 示剂（二苯胺2 g，苯胺2mL，磷 酸10mL，丙酮100mL）对单糖进 行薄层层析的效果最好。 3.2 经过对葡萄酒多糖的提取和 纯化方法的摸索发现，利用80% 乙醇沉淀法提取葡萄酒中的粗多 糖，Sevage法除去蛋白、透析法 除去部分色素，可有效提取和纯 化葡萄酒多糖，由于处理过程会 降低多糖的浓度，所以最后要对 处理液进行浓缩。 参考文献 1 李华. 多糖对葡萄酒感官质量 的作用J. 酿酒.2001，28（6）： 65-67 2 岳强，曾新安，王德培，等. 葡 萄酒中的多糖及其作用J.食品工业 科技，2005，26（9）：178-180 3 Boulet J C, Williams P, Doco T. 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