课件：药物定量分析与分析方法验证.ppt

第四章 药物定量分析 与分析方法验证,廖琼峰,,第四章 药物定量分析与 分析方法验证,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准分析方法验证,第三节 生物样品分析方法的基本要求,第一节 定量分析方法特点,重量分析法 容量分析法 光谱分析法 色谱分析法,一、重量分析法,生成的沉淀而进行分析的方法,生成沉淀滤过洗涤灼烧恒重。,特点： 1、操作繁琐 2、结果准确,很少用,第一节 定量分析方法特点,二、容量分析法,为经典方法，原料药分析常采用。,指示剂和灵敏度是影响结果的原因之一,常产生滴定误差；,特点： 1、快速,准确（RSD0.2）,灵敏度高； 2、适合于中、高含量组分分析（1%）； 3、仪器简单，操作方便，适用范围广；,第一节 定量分析方法特点,滴定度：指每1ml某摩尔的滴定液所相当的被测药物的重量。CHP用mg来表示。 aA(待测物）bB（滴定液）cCdD Tm(a/b)*M（mg/ml） 百分含量计算：直接滴定法和回滴定法,第一节 定量分析方法特点,1、直接滴定法：,含量（）（VTF）W100,2、回滴定法：即剩余滴定法,先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应；待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A,第一节 定量分析方法特点,2、回滴定法：即剩余滴定法,做空白试验的含量计算：,含量(V0-VB)*T*F/W100,F：浓度校正因子=实际浓度/标准浓度,第一节 定量分析方法特点,三、光谱分析法,UV、IR、MS、NMR和荧光分析,1、紫外可见分光光度法,计算分光光度法可测定多组分制剂的含量，现已基本不用。,灵敏度和准确度高，价格低、适用范围广,一般适用于纯组分的分析，如原料药或 单组分制剂（无辅料干扰）。,第一节 定量分析方法特点,灵敏度高（pg），低浓度，但适用范围有限，应用衍生化方法较多，在生物大分子分析中应用较多。,2、荧光分析法,第一节 定量分析方法特点,HPLC 适用范围广，越来越广泛 GC 使用有限制 TLC很少用于定量，多用于定性。,四、色谱分析法,第一节 定量分析方法特点,对内标物要求： a内标物须为原样品中不含组分 b内标物与待测物保留时间应接近且R1.5 c内标物为高纯度物质，或含量已知物质,内标法：,内标法优点： 进样量不超量时，重复性及操作条件对结果无影响 只需待测组分和内标物出峰，与其他组分是否出峰无关 适合测定微量组分 内标法缺点： 制样要求高；找合适内标物困难；已知校正因子,与进样量无关,四、色谱分析法,1、系统适用性试验： 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系统进行试验和调整，应达到规定的要求应符合要求。通常包括理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子。,2、定量方法：面积归一化法，内标法、标准曲线法、外标法等。,第一节 定量分析方法特点,（1）条件选择范围宽：包括色谱柱、流动相、 检测器等。 （2）应用范围宽：以HPLC为最广泛。 （3）灵敏度高，准确度好，重现性好。 （4）操作繁琐，实验消耗大。 （5）多组分的分离分析，与光谱等联用，可进 行定性和定量分析。,3、色谱法特点：,第一节 定量分析方法特点,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、目的,证明所用的分析方法适合于相应的检测要求。,二、用途,1、药品质量标准起草时，,2、药物生产工艺方法变更、制剂组成改变、 对原分析方法进行修订。,方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草和修订说明中。,验证分析项目,1. 鉴别试验； 2. 杂质定量或限度检查； 3. 有效成分含量测定； 4. 制剂中其它成分(降解产物、防腐剂等) 的测定； 5. 溶出度、释放度等功能检查中，溶出量 的测定方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,验证内容,1 专属性 2 检测限 3 定量限 4 精密度 5 线性及其范围 6 准确度 7 耐用性,第二节 药品质量标准 分析方法验证,一、专属性（specificity）,1、定义：指在其他成分（杂质和制剂辅料等）可能存在下,采用的方法能准确测出被测物的能力。,2、意义：分析复杂样品混合物时衡量其是否受到干扰程度的一种方法。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定 (6) 阴性对照溶液制备 按处方比例称取除西洋参以外的其余药味，按制备工艺制成缺西洋参的阴性样品；按“供试品溶液制备”项下方法制得阴性对照溶液。在上述色谱条件下，精密吸取20 L进样，观察样品峰的保留时间处是否有杂质峰。测得结果表明：样品峰保留时间处无杂质峰干扰（见附图2-1）。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,图2-1 定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定HPLC色谱图 1- 人参皂苷Re 2- 人参皂苷Rb1,A- 对照品,B- 样 品,C- 阴 性,二、检测限 (limit of detection, LOD),1、定义：试样中被测物能被测出的最低浓度 或量。,2、意义：LOD 是一种限度检验的效能指标,它反映方法与仪器的灵敏度和噪音大小，也表明样品经处理后空白值的高低。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、测定法：,用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,（1）非仪器分析目视法,（2）仪器分析,一般以信噪比(S/N= 3或2)时的相应浓度或注入仪器的量确定为检测限。,4、数据要求,附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,三、定量限（1imit of quantitation，LOQ）,1、定义：样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度。,2、测定法： （1）以信噪比（S/N）为10时相应的注入仪器的药物浓度或量进行确定。,（2）以仪器所测空白背景响应标准差(SD)的10倍为估计值，再经试验确定。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：在规定的测试条件下,同一个均匀样品经多次测定所得结果彼此符合程度。,四、精密度,2、表示方法： 偏差（d）： 标准偏差(SD): 相对标准偏差(RSD):,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（1）重复性：相同条件下，同一个分析人员测 定所得结果的精密度；,测定法：, 至少用9次测定结果评价：制备三个不同浓度样品，每一浓度样品测三次。, 把被测物浓度当作100%，至少测6次进 行评价。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、表达形式：,（2） 中间精密度 同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。,目的：,日期、分析人员、设备,考察随机变动因素的影响,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（3）重现性 不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。,3、表达形式：,当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定 (7) 方法重复性试验 取同一批号定坤胶囊样品6份(20041025),按“供试品溶液制备”项下方法操作，平行制备6份样品，在上述色谱条件下进行分析，测定，按人参皂苷Rb1的含量计算：RSD = 1.8 %(n=6)。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围, 线性：在设计的范围内，测试结果与被测物浓度呈正比关系的程度。,1、定义：, 范围：达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,3、要求：线性范围要涵盖待测物的所有浓度 范围。,4、数据要求：应列出回归方程、相关系数 和线性图。,2、测定法：设计具有一定梯度的58个浓度点，用作图法或计算回归方程建立. Y=ax+b 0.999(相关系数）,第二节 药品质量标准 分析方法验证,五、线性及其范围,(3) 标准曲线绘制 取人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成浓度为103.0 gmL-1的对照品储备液。依次精密量取对照品储备液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成人参皂苷Rb1系列标准溶液。分别精密吸取20 L，按上述色谱条件下测定。以对照品浓度X(gmL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归计算，得回归方程： 回归方程为：Y = 2.146103 X + 2.236103（ = 0.9998，n = 6） 结果表明人参皂苷Rb1在10.3-103.0 gmL-1浓度范围内，Y与X之间具有良好线性关系。,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,六、准确度,1、定义：指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。,2、测定法：用百分回收率（R）表示，测定回 收率的具体方法可采用“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（1）回收试验法 空白B+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,考察辅料对回收率是否有影响。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,（2）加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M。,R =,测得量-本底量,加入量,100%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,(8) 回收率试验 采用加样回收法，称取已知含量的同一批号定坤胶囊样品9份（20041025），每份0.2 g，精密称定。按低、中、高浓度分别精密加入人参皂苷Rb1对照品溶液，每一浓度3份，按“供试品溶液制备”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定。测得方法平均回收率为99.7 %（RSD = 1.7%，n = 9），数据见Tab. 4-1。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,例：定坤丸中人参皂苷Re和人参皂苷Rb1测定,Tab. 4-1 Recovery of ginsenoside Rb1 in Dingkun capsule,3、数据要求 规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备三个不同浓度样品，每一浓度测定三次。,RSD2%,（1）原料药、制剂 UV、 HPLC：R= 98102% 容量法：R = 99.7100.3% （2）中药及其制剂,95105%,90110%,RSD5%,RSD3%,第二节 药品质量标准 分析方法验证,4. 判断含量测定方法准确度的方法,（1）回收率试验,（2）与已建立准确度的另一方法测定的结果 进行比较。,“回收试验法”和“加样回收试验法”,第二节 药品质量标准 分析方法验证,1、定义：指测定条件稍有变动时，结果不受 影响的承受程度。,七、 耐用性,2、意义：为常规检验提供依据，是衡量实验 室和工作人员之间在正常情况下实 验结果重现性的尺度。,第二节 药品质量标准 分析方法验证,效能指标的选择,非定量分析,定量分析,微定量分析,一、常用样品的种类、采集和贮藏 二、生物样品分析前处理技术 三、定量分析方法验证,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,一、生物样品的种类、采集、制备和贮藏,（一）种类：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（二）生物样品的采集和制备,1、血液（blood）血浆、血清和全血,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,体现药物浓度和治疗作用之间的关系。 最常用的生物样本。,（1）血样的采集： 注射器 、毛细管眼眶采血、静脉插管手术、 滞留针股静脉取血,动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。,（2）血样的制备：,测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。, 血浆（ plasma ）的制备,肝素（最常用）、EDTA、椐橼酸盐、草酸钙、 氟化钠。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 血清（ serum ）的制备,血浆比血清的分离快，而且制取的量约为全血的50%60%，血清只为全血的20%40%，多数研究者用血浆进行分析测定。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 全血（ whole blood）的制备,血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,最常用的生物样本。,2、唾液（saliva）,一些药物的唾液药浓(S）与血浆游离药浓（P）密切相关，因此：,TDM中利用对S的测定代替对P的监测 药代动力学的研究,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（1）唾样的采集：,在潄口后15min，安静状态下采集口腔内自然流出的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰)。 物理法(口嚼石腊片、聚四氟乙烯块或纱布球等) 化学法(将柠檬酸或维生素C等置于舌尖)弃去初始部分后采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,刺激法的优点缩短采样时间 减小唾液pH波动（pH7.0） S/P的个体差异小,（2）唾样的制备唾样采集后，立即测量其除去泡沫部分的体积，以3000rpm离心10min，取上清液直接测定或冷冻保存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,3、尿液（urine）,体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型、相及相代谢物等多种形式排出。,尿液的采集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,用于药物剂量回收、尿清除率、生物利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢物等的研究测定。,尿液的采集,（1）尿样的采集：,测定方式测定一定时间内排入尿中的药物总量,样本采集时间尿（在规定时间区间内采集）, 并测量每次收集的尿液体积。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（三）生物样品的贮藏,最常用的方法冷藏或冷冻,冷藏冰箱(4)中短期保存(12d) 冷冻冷柜(-20)或低温冷柜(-80)中长期保存,冷藏或冷冻的时限：经稳定性考察后确定,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1、血样的贮藏 采集后及时分离血浆和血清（2h），分离后置硬质玻璃试管中或EP管中完全密塞后再贮存。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2、唾液样品的贮藏 测定唾液pH时应在取样的当时测定。 为阻止酶催化生成粘蛋白，应在4以 下保存 冷冻保存唾液时，解冻后应用前摇匀。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,3、尿样的贮藏 采集后应立即测定（24h），若不能立即测定，加入防腐剂后保存。,保存时间为2436h(4)或长期(-20),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（四）生物样品分析的前处理技术,1. 生物样品分析前处理的目的,在测定体内药物及其代谢物时，首先需对复杂的生物样品实施分离、净化、浓集、化学衍生化等样品预处理过程为药物的最终测定创造良好条件，具体表现在四个方面：,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,(1) 使药物从缀合物及结合物中释放测定药物的总浓度 (2) 使样品纯化消除生物基质中内源性物质的干扰 (3) 提高检测灵敏度适应和符合测定方法要求的灵敏度 (4)防止分析仪器的污染和劣化提高分析仪器的耐受程 度、改善分析结果,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1. 生物样品分析前处理的目的,2.生物样品分析前处理的技术,生物样品的预处理大致分为以下五类 （1）去除蛋白质 （2）缀合物的水解 （3）分离、纯化与浓集 （4）化学衍生化 （5）有机破坏法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（1）去除蛋白质,目的：结合型药物释放、减少乳化的产生、保护仪器,常用方法：, 加入与水混溶的有机溶剂蛋白质脱水沉淀 加入中性盐“盐析”沉淀蛋白质 加入强酸与蛋白质阳离子(铵基)形成不溶性盐沉淀 加入重金属盐与蛋白质阴离子(羧基)形成盐沉淀 酶水解法蛋白分解酶分解蛋白质,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 加入与水相混溶的有机溶剂,常用的有机溶剂乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃等 血样与溶剂的体积比1(1-3)除去90% 以上蛋白质 离心分离高速(10000r/min)离心12min,上清液pH pH8.59.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 加入中性盐,常用中性盐饱和(NH4)2SO4、Na2SO4、Mg2+、 PO43-及枸橼酸盐等 试剂用量 血样与饱和(NH4)2SO4的比例为 12时除去90%以上的蛋白质 离心分离 高速(10000r/min)离心12min 上清液pH pH7.07.7,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 加入强酸,常用的强酸10%三氯醋酸、6%高氯酸、 5%偏磷酸等 试剂用量 血清与强酸的比例为10.6时 除去90%以上的蛋白质 离心分离 高速(10000r/min)离心12min 上清液pH pH 04,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 加入含锌盐及铜盐的沉淀试剂,当溶液pH高于蛋白质的等电点时，蛋白质分子中带阴电荷的羧基与金属阳离子形成不溶性盐沉淀。 常用的沉淀剂 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等 血清与沉淀剂的比例1(13)，90%以上 离心分离高速(10000r/min)离心12min 上清液pH分别为5.77.3和6.57.5,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 酶解法,加入适量的酶和缓冲液，置水浴上水解一定时间，过滤或离心，取上清液供萃取用。 最常用的酶蛋白水解酶中的枯草菌溶素可在较宽的pH范围(pH7.011.0)内使蛋白的肽键降解，在5060具有最大活力,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（）缀合物的水解（自学 ）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（3）分离、纯化与浓集,目的：a消除内源性物质、代谢物及其他共存 物质的干扰； b提取浓缩待测物质，使其易于检测,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,液液萃取法(传统的方法) 固相萃取法(液固萃取法) 自动化固相萃取技术 固相微萃取 膜萃取技术 微透析技术 超临界流体萃取法,方法：,（3）分离、纯化与浓集,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,A：溶剂的选择试验成功的主要条件 相似相溶的原则 对药物的未电离分子可溶、电离形式分子不溶 沸点低、易挥散，毒性小 与水不相混溶 具有较高的化学稳定性和惰性, 液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,萃取次数通常为1次(萃取R在70%以上) 必要时23次(萃取R在50%以下) 每次用量和水相的体积比通常为1:1或25:1 萃取方式分液漏斗或涡流混合,B：萃取方法,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,C：水相pH值,水相pH值药物的pKa确定90%以上的非电离形式,碱性药物最佳pH值：高于pKa值12个 pH单位 酸性药物最佳pH值：低于pKa值12个pH单位 一般规则：碱性药物在碱性pH值、酸性药物在酸性pH值 介质中提取；,生物样品宜在碱性或近中性提取生物基质中内源性物质多为酸性，在碱性下不易萃取,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,pH = 13,pH = 7,pH = 2,空白血清乙醚提取物的HPLC色谱图,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2. 固相萃取法（Solid-phase extraction, SPE）, SPE原理将不同填料作为固定相装入微型小柱，当含有药物的生物样品溶液通过时，由于受到吸附、分配、离子交换或其它亲和力作用，药物或杂质被保留在固定相上，用适当溶剂清洗杂质，再用适当溶剂洗脱药物。,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 洗脱方式 A: 药物与固定相的亲和力比杂质强而被保留，用一 种对药物亲和力更强的溶剂洗脱 B: 杂质与固定相亲和力比药物强，药物被直接洗脱 通常为A模式，前应用最广泛的微型柱Bond Elut（美国Analytichem International公司）和Sep-pak微型柱（美国Waters公司）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 固相的选择,原则固相与被测组分应具有相似的极性,SPE的填料种类繁多，可分成三类 1）亲脂型（大孔吸附树脂、亲脂性键合相硅胶） 2）亲水型（硅胶、硅藻土、棉纤维） 3）离子交换型,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 试验步骤五步,1）用甲醇活化填料固相表面可被水性溶液润湿 2）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的甲醇 3）加样使样品经过小柱，弃去废液 4）用水或适当的缓冲液冲洗小柱除去残留的干扰物 5）选择适当的洗脱溶剂冲洗小柱洗脱被分析物，收集 洗脱液，挥干溶剂，备用或直接进行在线分析,第三节 生物样品分析 方法的基本要求, 方法特点,优点：1）引入杂质少 2）完全避免乳化的形成 3）较高萃取率、重现性较好 4）使用溶剂多数与水混溶，易于自动化 缺点：1）价格昂贵 2）技术要求高,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,（4）化学衍生化,药物分子中含有活泼氢者均可被化学衍生化如R-COOH、R-OH、R-NH2、R-NH-R,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1）GC法中的化学衍生化,目的：a: 使极性药物变成非极性、易挥发药物；使具有被分离特性 b: 增加药物的稳定性 c: 提高对光学异构体的分离能力,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,1）GC法中的化学衍生化,主要衍生化反应：,a: 烷基化（Alkylations） b: 酰化（Acylations） c: 硅烷化（Silylations）应用最广泛 d: 非对映体衍生化（to produce diastereomers）,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,A-目的：a: 提高对样品的检则灵敏度 b: 改善样品混合物的分离度 c: 进一步结构鉴定(如MS、IR、NMR),第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,B-化学衍生反应的要求 a: 反应条件不苛刻、能迅速定量进行 b: 生成单一衍生物，反应副产物、包括过量的衍生试剂不干扰被测样品的分离和检测 c: 衍生试剂方便易得、通用性好,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,2）HPLC法中的化学衍生化,柱前衍生法是在色谱分离之前，预先将样品制成适当的衍生物，然后进样分离和检测。,C-HPLC衍生化可分为柱前衍生法与柱后衍生法两种,第三节 生物样品分析 方法的基本要求,柱后衍生法是在色谱分离(出柱)后，色谱流出组分直接在系统中与衍生试剂及辅助反应液