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文档简介

BCA 法定量蛋白质浓度,BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。 操作简便,快速,灵敏度高,准确,试剂稳定性好,经济实用,抗干扰能力强,【原理】:碱性条件下,蛋白将Cu2+还原为Cu+, Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物,测定其在562nm处的吸收值,并与标准曲线对比,即可计算待测蛋白的浓度。,【原理】:,基本原理,BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量: 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+(biuret reaction)。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物,在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比,据此可测定蛋白质浓度。,【试剂】 1、 试剂A: 分别称取10g BCA二钠盐、20g无水碳酸钠、0.16g酒石酸钠、4g氢氧化钠 、9.5g碳酸氢钠,混合调PH值至11.25,加水至1L。 2、 试剂B:4硫酸铜。 3、 BCA工作液: 试剂A 100ml 试剂B 2ml混合。,操作步骤,1. 先将solutionA 摇晃混匀,根据样品数量,按50体积solution A加1体积solutionB试剂(50:1)配制成BCA工作液,充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。,2、 蛋白质标准液: 用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定),3.绘制标准曲线:,取6支试管,编号后分别加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标准蛋白质溶液(BSA),然后各管分别用去离子水补充到0.1mL,最后各试管中分别加入2.0mLBCA工作液,每加完一管,立即在漩涡混合器上混合(注意不要太剧烈,以免产生大量气泡而难于消除),以蛋白质的蛋白含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。,4.样品测定: 同绘制标准曲线方法,在一支试管中加入待测样品0.1mL代替标准蛋白质溶液,然后加入2.0mLBCA工作液后,立即在漩涡混合器上混合,测吸光度A,查标准曲线,求出待测样品中蛋白质浓度(g/L)。,【优缺点】 (一) 操作简单,快速,45分钟内完成测定,比经典的Lowary法快4倍且更加方便; (二) 准确灵敏,试剂稳定性好,BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200g/ml,微量BCA测定范围在0.5-10g/ml。 (三) 经济实用,除试管外,测定可在微板孔中就进行,大大节约样品和试剂用量; (四) 抗试剂干扰能力比较强,如去垢剂,尿素等均无影响,此法测定蛋白质浓度,近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。,BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成,实现了蛋白浓度测定的简单,高稳定性,高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为120微升。,试剂盒组成,2.稀释标准品:完全溶解蛋白质标准品(5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20保存)取10微升用PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释),使终浓度为 0.5mg/ml。 将稀释后的标准品(0.5mg/ml)按0, 2, 4,6,8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中,加标准品稀释液补足到20微升。,pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液( PBS )的配制 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液(0.01mol/L,pH7.4,PBS): NaCI 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO412H2O 2.9g KCI 0.2g 将上列试剂按次序加入定量容器中,加适量蒸馏水溶解后,再定容至1000mL,调pH值至7.4, 高压消毒灭菌112Kpa20min,冷却后,保存于4冰箱中备用。,6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, 12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, 24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, 96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, 摘自司徒镇强的细胞培养,3、 待测样品:用双缩脲测定法的样品稀释而成。 此法测定蛋白质浓度,近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 总之,虽然蛋白质含量的测定方法很多,但是,还没有一个完美的方法。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定。,【试剂】 1、 试剂A:1BCA二钠盐 2无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4氢氧化钠 0.95碳酸氢钠 混合调PH值至11.25。 2、 试剂B:4硫酸铜。 3、 BCA工作液:试剂A 100ml 试剂B 2ml混合。 4、 蛋白质标准液:用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。(纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定) 5、 待测样品:用双缩脲测定法的样品稀释而成。 此法测定蛋白质浓度,近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 总之,虽然蛋白质含量的测定方法很多,但是,还没有一个完美的方法。在选择测定方法时,可根据实验要求和实验室条件决定。,加适当体积样品到96孔板的样品孔中,加标准品稀释液不足道20ul。 即:将蛋白质样品作适当稀释(最好多做几个梯度,如作2倍、4倍、8倍稀释,4. 各孔加入200微升BCA工作液,用加样枪轻轻吹打混匀(注意:不要弄出气泡影响读数),37放置30-60分钟。 冷却到室温后,用酶标仪测定A562nm,或540-590nm之间的其他波长的吸光度,根据标准曲线计算出蛋白浓度。,【计算】 (一) 绘制标准曲线。 (二) 以测定管吸光度值,查找标准曲线,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 (三) 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者,求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营:网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户,做到让客户满意!,致力于数据挖掘,合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面,打造全网一站式需求,感谢您的

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