课件：酶在食品分析中的应用 (2).ppt

第10章 酶在食品分析中的应用,主要内容： 1 酶法分析的特点及应用类型 2 酶联免疫测定（ELISA） 3 聚合酶链式反应（PCR） 4 酶生物传感器 5 酶抑制率法,酶法分析的发展,酶在定量分析中的应用可以追溯到19世纪中期。当时，曾采用麦芽提取物作为过氧化物酶源，以愈创木酚作为共底物或指示剂测定过氧化氢。 然而，酶法分析真正的发展应归于它在临床实验室中的广泛应用。,酶法分析的发展,如早在1914年临床上就开始采用脲酶测定尿中的尿素，但是在临床实验室中酶分析的真正突破要推迟到1958年，当时转氨酶分析发展成为诊断肝病和心脏病的一个有效手段。 到了20世纪50年代前已有60种物质能借助于酶法分析。近年来，酶法分析发展迅速，广泛应用于临床检验、食品、环境等生物及其它样品的检测。,1. 酶法分析的特点及应用类型,酶的特性,酶法检测的特点,催化效率高,专一性,灵敏性强,快速,特异性、准确,不需要物理分离，干扰少,酶在食品分析中的应用类型,1）去除样品中的杂质。如测定果糖、多糖等。 2）催化待测物生成新的产物，而这种产物更容易被定量分析。如：淀粉的测定。 3）测定食品中酶的活性作为食品的指标，如过氧化物酶的测定、蜂蜜中酶的测定。 4）利用酶催化反应所产生的一些信息。如酶联免疫法、酶电极法等。,2 酶联免疫测定（ELISA）,酶联免疫测定（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）是继放射免疫测定技术之后发展起来的一项新的免疫学技术。 ELISA自上世纪70年代出现开始，就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点，在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视，成为检验中最为广泛应用的方法之一。,2.1 ELISA的基本原理,（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接（或建立关联）。 （2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,重点,ELISA试剂盒的组成,完整的ELISA试剂盒包含以下各组分： （1）包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（标记物）； （3）酶作用的底物（显色剂）； （4）阴性和阳性对照品（定性测定），参考标准品和控制血清（定量测定）； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液；（含吐温20磷酸盐缓冲液） （7）酶反应终止液。（常用硫酸）,必需,酶标仪和酶标板,DNM-9602A酶标分析仪,酶标板,2.2 ELISA的基本类型,随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用，根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，逐渐演变出了几种不同类型的检测方法：,（5）捕获法测IgM抗体； （6）ABS-ELISA法； （7）PCR-酶联免疫测定法； （8）斑点免疫酶结合试验。,（1）夹心法； （2）间接法； （3）竞争法； （4）双位点一步法；,双抗体夹心法,此法常用于测定抗原, 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,（1）双抗体夹心法,乙肝表面抗原。,间接法,此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,（2）间接法ELISA,竞争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例, 将抗原吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量特异性抗体，使固相抗原与待测抗原二者竞争与抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的抗体与待测抗原含量呈负相关。,（3）竞争法,黄曲霉素,2.3 ELISA测定中酶的作用,由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定具有极高的灵敏度。,（1）酶标记的抗体或抗原的制备,酶标记的抗体或抗原是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性，也保持了抗体或抗原的免疫活性。 酶标记抗体的制备主要有戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法两种方法。酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。,（2）常用的酶及底物,为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa？,为什么辣根过氧化物酶可应用于elisa？,（1）成本低 （2）热稳定性好 （3）显色反应类型多,2.4 ELISA技术在食品分析中的应用,近年来，ELISA因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性，在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人畜共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域正逐步推广应用。,（1）毒素检测,真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，其中的十几种对人类危害较大，它们一般同时具有毒性强和污染频率高的特点。其中毒性最大、致癌能力最强的是黄曲霉毒素。它在自然界中分布十分广泛，黄曲霉常常和其他多种微生物在一起，生长在粮食、油料作物的种子、各种食品和饲料中。,自1977年抗黄曲霉素B1的单克隆问世至今，几乎所有重要真菌毒素如伏马毒素、赭曲毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯酮、展青霉素等的ELISA 检测方法均已建立。 在对黄曲霉素B1(AFT B1)的检测中，其检测AFT B1的线性范围0.255.Og/mL，灵敏度为12.5 Pg，整个测定过程仅为4h。另外该方法也正在被广泛地应用于各种藻类和贝类毒素的检测。,黄曲霉素B1 ELISA试剂盒,本试剂盒包括用于定量检测黄曲霉素B-G的试剂和方法。 检测数量：96孔（包括标准） 检测时间：20分钟,金黄色葡萄球菌肠毒素的检测,蘑菇罐头约占我国罐头出口量的30，中国蘑菇罐头一度占据美国市场2/3份额，1989年以来FDA以我国蘑菇罐头食品含有金黄色葡萄球菌肠毒素并导致消费者伤害为由，对中国蘑菇罐头采取”自动扣留措施”。2002年才得以解决。 FDA检测蘑菇罐头葡萄球菌肠毒素使用的TECRA试剂盒在检测过程中会产生强烈的非特异反应，因此，这种试剂盒是不可靠的，其所得出的检测结果也是不可靠的。,（2）农药残留检测,酶联免疫测定已成为许多国际权威分析机构如AOAC分析农药残留的首选方法。迄今为止，应用酶联免疫测定检测食品中的残留农药主要为除草剂、杀虫剂和杀菌剂。草甘膦的ELISA检出下限为0.07g/mL，与色谱法测定的结果一致。,从目前来看，尽管ELISA检测限度还不能完全达到国外发达国家技术法规和限量标准的要求，而且抗体制备不易和不能同时完成多种农药残留检测等缺点，但是由于该技术具有样本前处理简单，纯化步骤少，大量样本分析时间短，适合于做成试剂盒现场筛选等优点，使其可在蔬菜产区、蔬菜批发市场和海关配备，工商人员可随身携带或建立固定的农药残留速测点，随时把残毒超标的蔬菜、水果杜绝在食用之前。,（3）细菌污染检测,食品中的有害细菌数量达到一定数目，食用后会引起各种疾病。为了有效地控制其传播，就必须有快速和可靠的检测方法。目前有许多种方法，其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的酶联免疫测定技术研究最多，检测结果准确可靠。,沙门氏菌的ELISA检测,例如对沙门氏菌最低检测量可达500CFU/g，仅需22h，比常规方法缩短了34 d，与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌无交叉反应。此外以ELISA技术为基础的全自动沙门氏菌检测系统，实现了整个过程的自动化，全程耗时仅为45min。其原理是将捕捉抗体包被到凹形金属片的内面，可以从前增菌液中吸附被检的沙门氏菌，对于该系统来说，需要做的只是加样。,李斯特氏菌的快速检测,在对李斯特氏菌的快速检测中，利用三株针对单核细胞增生李斯特氏菌、无害李斯特氏菌和西里杰氏李斯特氏菌共同表位的单抗，以夹心ELISA法，在48h内，可从人工模拟肉中检测下限为5CFU/g样品。,（4）肉类品质检测,ELISA在肉类食品品质检测中的应用主要包括加热终温判定分析和掺入异种肉的检测两个方面。肠道疾病的爆发和动物性食品有很大关系，而肉食品加热煮制不当是引起该疾病爆发的一个主要原因。在加热过程中一些成分的含量会降低，而一些产物的浓度会提高。,当用蛋白质做指示剂时，可制备抗体，这种抗体对单一蛋白质的天然状态或变性状态均具有专一性，这样它就可以指示蛋白质在加热过程中变化。因而ELISA可作为商业上快速判定分析肉品终温的一种方法。目前用的最多的是对乳酸脱氢酶的免疫检测。其次是对掺入异种肉的检测，利用多克隆抗体对血清白蛋白的酶联免疫测定法，对鲜肉进行掺假检测。,几种以单克隆抗体为基础的ELISA反应已得到应用，可以检测出1%2%的掺假率。目前在商业上，酶联免疫测定已可以检测十多种动物肉，该方法已为美国农业部使用。同时，ELISA技术也可以利用对热稳定的肌肉抗原来检测加热处理后的肉掺假情况。目前，该技术可以检测6种家畜熟肉制品。,（5）动物性食品中药物残留检测,利用ELISA技术测定动物性食品中有害残留成分只是近几年的事。随着研究的深入，由原样品的复杂处理和抽提发展为只需要高度纯化过程，加速了其在实际检测中的应用。特别是对猪肉、禽肉和水产品中重要禁用兽药的检测。,如瘦肉精（盐酸克伦特罗）酶联免疫检测法，基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定，不仅可作为一个定性筛选过程，也可以进一步进行定量测定。检测灵敏度可达到0.510-9，完全达到我国农业部目前的110-9监督检测标准。ELISA法作为盐酸克伦特罗残留量的筛选方法具有操作简便、准确快速的特点，适用于大量样品的测定，并可能成为国家标准检测方法。,（6） 人畜共患疾病病原体检测,在禽流感病毒检测方面，我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已形成试剂盒生产能力。此外，采用ELISA法可以有效检测牛及羊朊病毒蛋白，该蛋白可引起牛的病理性海绵状病毒，是一种致死性神经系统疾病（疯牛病，BSE），与人群发生变异型克雅氏病（VCJD）有关。,（7） 重金属污染检测,金属硫蛋白遍存于自然界，细菌、植物、动物以及人类肌体中，是一类对重金属离子有很强亲和力，含丰富的半胱氨酸（约1/3），不含芳香族氨基酸和组氨酸的低分子量蛋白质。金属硫蛋白含有大量的-SH，能与Hg、Cd、Cu、Ag等重金属离子结合掩蔽金属的毒性，对细胞内的金属离子有重要的解毒作用。,生物细胞，在环境受重金属污染（Cu、Hg、Cd、Pb、Zn与金属离子）的情况下，可被诱导合成出大量的金属硫蛋白，且在一定范围内成正比，是一项对金属污染具特异性的指标。用纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯化后并标记辣根过氧化酶，可实现对食品中重金属污染的超微量检测。,（8） 食物中其它成分检测,ELISA技术同时可以用于食品中其它成分的检测，如:(1)检测某些特定的转移基因表达蛋白，以分析食品是否来自转基因生物或者含有转基因成分；（2）食品中营养素的测定，最小检出限可达0.05g/g；（3）通过合成不同异黄酮的羟酸半抗原，分析植物中含量很低的雌激素；（4）可用于检测食品加工过程中的酶（如磷酸丙糖异构酶和转谷氨酰胺酶）含量的变化等。,2 聚合酶链式反应（PCR）,PCR检测的原理,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）以特定的基因片段为模板，利用人工合成的一对寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核苷酸为底物，在DNA聚合酶的作用下，通过DNA模板的变性，达到基因扩增的目的。PCR是目前转基因食品检测较为成熟的方法。,我国已应用PCR- 酶联免疫测定检测技术，建立了转基因大豆与玉米中常用外源基因的快速检测体系，并应用于进出境产品的转基因检测实际工作中，结果表明，PCR-酶联免疫测定法具有操作简便、灵敏特异、结果准确的优点，可对转基因大豆、玉米及其它转基因产品进行定性和定量检测。,PCR检测的应用,对热处理后的熟肉样品，要检测出肉制品中肉的组成比较困难，但经PCR后检测，牛肉、猪肉、鸡肉和火鸡肉的最小检测量可以达到1%2 %，而且肉制品中的抗坏血酸添加剂不影响检测结果。目前，PCR是区分鸡肉和火鸡肉的唯一方法。PCR也用于食品中腐败菌、病原菌如肠道出血性大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌、金黄色葡萄球菌等的检测。,3酶生物传感器,酶传感器主要利用它对生物体的催化特性，且对特定底物有反应的特异性，把这种特异性与电化学分析的迅速性和简便性结合起来，从含有多种多样有机物的生物试样中，有选择地把特定物质迅速测定出来。,酶生物传感器的简图,C6H12O6 + O2 C6H12O7 + H2O2,酶传感器的优点,它还具有能反复进行，不需要通常进行酶分析时需要的酶和显示剂，实现无试剂分析，因此，发展较快，现已有多酶传感器，可用在生产线上监控食品加工流程、发酵工艺过程及微生物浓度的控制，又可在包装材料上测知食品是否经过不当温度的贮存，冷冻时微生物含量及贮存寿命的预警。,酶生物传感器在食品分析中的应用,利用酶电极进行食品分析，已能测定多种氨基酸和一些糖类，如：用脲酶电极法测定食品中赖氨酸含量。由固定化蔗糖转化酶、葡萄糖变旋酶及葡萄糖氧化酶的复合酶膜组成的过氧化氢双电极系统，可同时测定样品中蔗糖和葡萄糖的含量，具有操作简单，测定快速，结果准确可靠，仪器稳定性好，酶膜使用寿命长的特点，一次进样可同时测定样品中蔗糖和葡萄糖的含量，而且样品无需特别处理。该方法适用于食品发酵液中蔗糖和葡萄糖的测定。,酶电极在食品行业中的应用,（1）在酿酒过程中，将乙醇酶和葡萄糖氧化酶固定成酶膜，与电极连接，制成的生物传感器可监控葡萄糖和乙醇的浓度； （2）利用嘌呤氧化酶电极，检测酶催化反应中过氧化氢的产生量，可对鱼新鲜度进行测定； （3）淀粉双酶传感器能够测定食品中淀粉的含量。 （）测定猪肉、牛乳鲜度的酶传感器也已开发出来。,生物传感器,1989年研制的SBA-30型乳酸分析仪,1992年研制的SBA-40型谷氨酸-葡萄糖双功能分析仪,4酶抑制率法,原理：待测物对酶所催化的化学反应具有抑制作用，通过检测酶抑制率判定待测物的含量。,农药残留的酶抑制率法测定,在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的活性有抑制作用，在底物的作用下，酶分解成可发生显色反应的硫代胆