课件：乳腺癌中HER检测.ppt

乳腺癌病理诊断规范中的几个问题 何 松 南通大学附属肿瘤医院病理科 南通市病理诊断中心 南通市医学重点学科 南通市医疗卫生领域科研重点学科 南通市临床重点专科,一、乳腺肿瘤WHO分类及预后 肿瘤名称后的编码为：肿瘤学国际疾病分类编码（ICD-O） 生物学行为编码为：0为良性肿瘤，1为交界性或生物学行为未定肿瘤，2为原位癌或上皮内肿瘤级，3为恶性肿瘤,1.上皮性肿瘤 1.1浸润性导管癌，非特殊性.3 10年生存率35%50% 1.1.1 混合性癌 1.1.2 多型性癌 1.1.3 伴有破骨巨细胞的癌 1.1.4 伴有绒癌特征的癌 1.1.5 伴有黑色素特征的癌 1.2浸润性小叶癌.3 （预后与浸润性导管癌相似） 1.3小管癌 . 3 （预后极佳，与同龄无乳腺癌妇女相似） 1.4浸润性筛状癌 . 3 （预后极佳，10年生存率90% 100%） 1.5髓样癌（合体细胞生长结构75%，没有腺管结构，中度明显弥漫淋巴细 胞浸润，中度明显核多形性，完整的肿瘤组织学边界） . 3 （预后比浸润性导管癌好， 10年生存率50%90% ） 1.6黏液癌及其他富于黏液的肿瘤. 3 （ 10年生存率80% 100%） 1.6.1 黏液癌 1.6.2 囊腺癌和柱状细胞黏液癌 1.6.3 印戒细胞癌,1.7 神经内分泌肿瘤.3（组织学级别是最重要的预后指标之一） 1.7.1 实性神经内分泌癌 1.7.2 非典型类癌 1.7.3 小细胞/燕麦细胞癌 1.7.4 大细胞神经内分泌癌 1.8 浸润性乳头状癌. 3 （预后较好） 1.9浸润性微乳头状癌 . 3 （预后与血管浸润、腋窝淋巴结转移有关） 1.10大汗腺癌 . 3 （预后与非大汗腺癌无差别） 1.11化生性癌 . 3 1.11.1 纯上皮化生性癌. 3 （大部分病例预后非常好） 1.11.1.1鳞状细胞癌 1.11.1.2伴有梭形细胞化生的腺癌 1.11.1.3腺鳞癌 1.11.1.4黏液表皮样癌 1.11.2 上皮/间叶混合性癌. 3 （高度侵袭性）,1.12富于脂质的癌.3 （不详） 1.13分泌性癌 . 3 （在儿童和青少年有极好的预后，在年长患者有浸润性 行为） 1.14嗜酸细胞癌 . 3 （不详） 1.15腺样囊性癌 . 3 （低度恶性，单纯切除可治愈） 1.16腺泡细胞癌 . 3 （不详） 1.17富于糖原的透明细胞癌.3 （比浸润性导管癌更具有侵袭性） 1.18皮脂腺癌 . 3 （不详） 1.19炎症性癌. 3 （5年存活率25%50%） 1.20小叶肿瘤 1.20.1 小叶原位癌.2 1.21 导管内增生性病变 1.21.1 通常型导管增生 1.21.2 平坦型上皮非典型增生（DIN1A） 1.21.3 非典型导管增生（DIN1B） 1.21.4 导管原位癌.2 （包括DIN1C、DIN2、 DIN3或DCIS1级、DCIS2级、DCIS3级）,1.22 微小浸润导管癌（无编码.极少淋巴结转移.临床按DCIS处理） 1.23 导管内乳头状肿瘤 1.23.1 中心型乳头状瘤 . 0 1.23.2 外周型乳头状瘤 . 0 1.23.3 非典型乳头状瘤 1.23.4 导管内乳头状癌 .2 1.23.5 囊内乳头状癌 .2 1.24 良性上皮增生 1.24.1 包括各种类型腺病 1.24.1.1硬化腺病 1.24.1.2大汗腺腺病 1.24.1.3盲管腺病 1.24.1.4微腺管腺病 1.24.1.5腺肌上皮腺病 1.24.2 放射性瘢痕/复合性硬化性病变 1.24.3 腺瘤 1.24.3.1管状腺瘤 . 0 1.24.3.2泌乳腺瘤 . 0 1.24.3.3大汗腺腺瘤 .0 1.24.3.4多型性腺瘤 .0 1.24.3.5导管腺瘤 .0,2. 腺肌上皮病变 2.1肌上皮增生 2.2腺肌上皮腺病 2.3腺肌上皮瘤 .0 2.4恶性肌上皮瘤 .3 （极少发生局部复发或远处转移） 3. 间叶肿瘤 3.1血管瘤 .0 3.2血管瘤病 3.3血管周细胞瘤.1 3.4假血管瘤样间质增生 3.5肌纤维母细胞瘤 .0 3.6纤维瘤病（侵袭性）.1 3.7炎症性肌纤维母细胞瘤 .1 3.8脂肪瘤.0 3.8.1血管脂肪瘤.0 3.9颗粒细胞瘤 .0 3.10神经纤维瘤.0 3.11神经鞘瘤 .0 3.12血管肉瘤 .3 3.13脂肪肉瘤.3 3.14横纹肌肉瘤 .3 3.15骨肉瘤 .3 3.16平滑肌瘤.0 3.17平滑肌肉瘤 .3,4. 纤维上皮性肿瘤 4.1 纤维腺瘤.0 4.2 叶状肿瘤 .1（良性、恶性均可复发） 4.2.1 良性 .0 4.2.2 交界性 .1 4.2.3 恶性 .3 4.3 导管周围间质肉瘤，低级别.3 4.4 乳腺错构瘤 5. 乳头肿瘤 5.1 乳头腺瘤 .0 5.2 汗腺瘤样腺瘤 .0 5.3 乳头派杰病 .3 （预后取决于在其下方是否存在导管内癌和乳腺深部组织的浸润癌） 6. 恶性淋巴瘤 6.1 弥漫大B细胞淋巴瘤 .3 6.2 Burkitt淋巴瘤 .3 6.3 结外MALT型边缘区B细胞淋巴瘤 .3 6.4 滤泡型淋巴瘤 .3 7.转移性肿瘤 8.男性乳腺肿瘤 8.1男性乳腺发育 8.2癌 8.2.1 浸润癌 .3 （预后与女性乳腺癌相似） 8.2.2 原位癌 .2,二、规范的病理报告内容,1. 标本名称（肿块切除、单纯乳房切除、 乳腺癌改良根治、乳腺癌根治） 2. 手术部位 3. 组织学类型 4. 分级（、级） 5. 肿块大小（cm） 6. 血管、淋巴管侵犯情况 7. 乳头是否受累 8. 腋下淋巴结转移情况 9. ER、PR、c-erbB-2等免疫组化检测情况,分级方法 对3项肿瘤主要特征进行评判：表现腺体分化的腺管形成、核多形性以及核分裂计数。 应用13计分系统对每个因素进行独立的评估。 将3组数值加在一起，可得到39的积分结果。其相应的组织学级别如下： 级（grade 1)-高分化：35分 级（grade 2)-中分化：67分 级（grade 3)-低分化：89分,免疫组化标记分为两类： A、诊断用标记：如CD23 、CD5、 bcl-10 、 CD10、 CK（pan）、 CK18、 CK20 desmin、 a-SMA 、HHF-35 。此类标记结果只分（+）、（-），不须划分等级，供病理科医生诊断或鉴别诊断用。 B、治疗用或预后用标记：如 ER、 PR 、 cerbB-2 、P-gp 、GST- 、Topo、 TS、P63、P53、P27、P21 。此类标记结果不能只分（+）、（-），必须划分等级，应分为（-）、（+）、（+）、（+）。临床医生据此指导化疗用药和判断预后。,各家医院检测结果不一致的原因 1. 病理医生经验不足，尤其是对每一种抗体 的准确的阳性定位（细胞膜、细胞浆、细胞核）缺乏足够的认识，从而发生错误判断。例如：ER应定位在细胞核，PR定位在细胞核，C-erbB-2应定位在细胞膜。 2. 免疫组化的实验操作不规范。 3. 组织标本固定不当（此与临床医生有关）。 4. 组织脱水处理不当（机器质量差、试剂未及时更换、程序未调到最佳状态）。,C-erbB-2 细胞浆表达,ER 浆表达,ER 浆表达,ER +,PR +,三、乳腺癌中HER-2的检测 及其临床意义,（一）HER-2概况,Her-2: 又名C-erbB-2, Her-2/neu 定位于17q12.1-21 Her-2属于EGFR家族成员 为原癌基因,编码185KD的跨膜型酪氨酸激酶生长因子受体 现有研究表明,在30%以上的人类肿瘤中存在Her-2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等） 其中2530%的乳腺癌为 Her-2基因的扩增/过度表达。,国外文献报道的乳腺肿瘤 HER2阳性情况,HER2 Study n Stage positive, % Ross(2003) 5003 - 22 Owens(2004) 6556 - 24 Ross(2003) 279 26 Penault-Llorca(2005) 699 30,（二）HER-2/neu癌基因的致瘤机制,抑制凋亡，促进增殖； HER-2过表达通过PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/MAPK通路抑制野生型P53蛋白,促进P21waf1/cip1蛋白表达 增加肿瘤细胞的侵袭力； HER-2下调和阻断粘附分子整合蛋白、CD44等蛋白表达及粘附功能 促进肿瘤血管新生和淋巴管新生 HER-2过表达上调血管淋巴管新生调控因子VEGF-A,-C,-D表达,（三）、乳腺癌中HER-2扩增/过度表达的临床意义,1987年Slamon等首次报道乳腺癌原癌基因HER-2的扩增，导致肿瘤易复发，与患者总生存期短密切相关,Slamon DJ, et al. Science. 1987,235(4785):177-82.,HER2阳性患者的生存期比正常者缩短一半以上,转移性乳腺癌患者的中位生存期,HER2 阳性 8-10个月 HER2 阴性 17-22个月,Slamon DJ et al. Science 1987;235:17782,（一）无病生存期和总生存期短相关,肿瘤预后差.在多变量分析结果中，HER2是肿瘤复发和总生存期长短的独立预后因素 复发率 (P=0.001) 总生存 (P=0.02) 至今为止已有国内外数百篇文献研究HER-2 与乳腺癌的关系，国外八十多篇文献报道报道HER-2扩增过表达与患者预后差相关 Her-2是目前公认的一个乳腺癌重要的预后/预测因子,1.00 0.75 0.50 0.25 0,累计生存率,0 24 48 72 96 120 144,无扩增,扩增,基因扩增: 10 拷贝数 无基因扩增: 3拷贝数 临界值: 不包括,死亡时间 (月数),Log rank p0.001,Ross JS, Fletcher JA. Stem Cells 1998; 16: 413428,HER2阳性状态的患者无病生存期缩短,淋巴结阴性,Seshadri R et al. J Clin Oncol 1993;11:193642,100 80 60 40 20 0,0 12 24 36 48 60 72,无病生存概率,死亡时间 (月数),HER2 基因 3 拷贝数,HER2基因 3 拷贝数,对数秩检验 p=0.001,淋巴结阳性,2005年St.Gallen指南乳腺癌危险度分级,低度危险 LN（-）且 标本中病灶大小（pT）2CM 分级1级 瘤周脉管未见肿瘤侵犯 HER2基因没有过度表达或扩增 年龄35岁,2005年St.Gallen指南乳腺癌危险度分级,中度危险 LN（-）阴性且有下列至少一条 标本中病灶大小（pT）2CM 分级2-3级 有瘤周脉管肿瘤侵犯 HER2过度表达或扩增 年龄35岁 LN1-3个（+）且未见HER2过度表达或扩增 高度危险 LN1-3个（+）且HER2过度表达或扩增 LN4个及以上（+）,(二) HER2阳性状态可以预示肿瘤对常规治疗的反应情况 内分泌治疗 HER2阳性患者相对耐药 CMF方案 HER2阳性患者相对耐药 蒽环类 对大剂量蒽环类相对敏感 紫杉类药物 相对敏感,（三）、靶向Her-2的人源化单抗 赫赛汀,赫赛汀靶向HER2的人源化单抗,用于治疗HER2阳性乳腺癌 生存率提高达45% 疗效改善并持续 维持生活质量,95% 人源化, 5% 鼠抗，具有高度亲和性 (Kd=0.1nM) 和特异性，显著降低免疫原性(HAMA),（四）. Her-2阳性状态的检测方法,（一）组织标本的制备注意环节,1、标本的类型： 新鲜标本、 针吸活检标本、 粗针穿刺标本、 外科手术标本 细针穿刺液基细胞 111例IHC、CISH与FISH检测一致的乳腺癌中，53例FNAs（切除外科标本）与组织病理标本结果高度一致。 Vocaturo A. Novelli F, et al. Oncologist. 2006 Sep; 11(8): 878-86.,HER2表达在原发肿瘤和转移灶呈高度一致,Study Percentage IHC overexpression Primary tumors Metastases Masood & Bui(2000) 32% 32% Shimizu et al(2000) 38% 38% Simon et al(2001) 25% 22% Tanner et al(2001) 28% 28% Gancberg et al(2002) 29% 27% Vincent-Salomon et al(2002) 25% 20% Tsutsui et al(2002) 25% 25% Carlsson et al(2004) 55% 55%,2.标本的固定 （1）取材到固定时间1小时 （2）固定时间6-48时间，一般不超过24小时 （3）固定液10%中性福尔马林固定液,3.标本的取材 5mm 4.组织蜡块和组织切片 （1）切片后不宜置于恒温时间过长（4-6周） （2）厚度 IHC 3-5um CISH/FISH 4-5um,（二）常用检测方法,1.免疫组化（IHC） 检测Her-2蛋白表达 （1）抗原修复：95-99 EDTA（1mM pH80） 或枸橼酸钠 （0.05M pH6.0）,（2）常用IHC 检测的抗体/试剂盒,HercepTest: 美国FDA批准用于临床诊断, CB11 或4D5 （+） Hercept Test（+）; Hercept Test（+） CB11 或4D5 （-） FISH (+), Hercept Test +: 19/20; FISH (-) , Hercept Test + : 5; FISH (+), IHC (-) : 3例。 Gouvea AP, Milanezi F, et al. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2006 Mar; 14(1): 103-8.,（3）结果判读,注意点： 计数胞膜完全着色的细胞比例及着色强度 胞浆着色忽略不计 评定浸润部位的着色情况 正常上皮细胞不应着色,染色形态 评分 染色图例 完全没有染色或是肿瘤细胞中 0 少于10%肿瘤细胞有细胞膜染色 大于10%的肿瘤细胞有呈现清淡地/ 1+ 稍微地并且是不完整的细胞膜染色 这些细胞只染在部分的细胞膜 大于10%的肿瘤细胞有呈现 2+ 轻度至中度的完整的细胞膜染色 大于10%的肿瘤细胞有呈现 3+ 强度的完整的细胞膜染色,HercepTestTM判读标准,0,1+,3+,2+,免疫组织化学法0-3+评分系统 Immunohistochemistry (IHC),3+ CerbB2,3+ CerbB2,2+ CerbB2,2+ CerbB2,1+ CerbB2,2.显色原位杂交（CISH） 一种用碱性磷酸酶标记的探针，在甲醛固定、石蜡包埋组织切片上进行杂交，再用鼠抗地高辛抗体和辣根过氧化物酶抗鼠抗体进行免疫结合，DAB显色，普通光学显微镜观察有无基因扩增的异常信号的方法。CISH技术比FISH简单，试剂较便宜，不需昂贵的仪器设备，且可长期保存切片。,（1）所需主要设备 电炉、带温度计的高压锅或微波炉 原位PCR仪或原位杂交炉 37温箱 亮视野显微镜,（2）检测三大关键步骤,标本的加热预处理 用电炉，15 分钟98 100 所有载玻片必需全部浸入缓冲液 酶消化 室温 10 分钟 或37 3分钟 严格冲洗 0.5x SSC, 75-80, 5 分钟,过度酶消化,酶消化不够,恰当的酶消化,（3）结果判读,无扩增：大于50%的肿瘤细胞中有1-5个信号点 低拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有6-10个信号点 高拷贝扩增：大于50%的肿瘤细胞核内有大于10个信号 点或者凝结成团块状、簇状粗颗粒信号,A diploid-triploid HER2 copy number is usually clear,CISH检测无HER2基因扩增样本,CISH检测低扩增样本,Gene copy clusters: 100%evidence of gene amplification,CISH检测高扩增样本,HER2/CISH,No HER2 amplification,HER2 amplification,3.荧光原位杂交（FISH）,是一种通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，在荧光显微镜下能原位显示细胞核内杂交信号的分子细胞遗传学技术。 FISH技术用于检测基因扩增的准确性比其他检测技术高，可以避免由于染色体的多体而呈现的假阳性，故被誉为“金标准”。但FISH技术操作较复杂，试剂(荧光标记的探针试剂盒)和仪器设备(荧光显微镜)昂贵，目前在国内只有少数实验室具有相应技术条件进行该技术的检测。,（1）两种探针 应用Her-2和17号染色体双荧光标记探针，两种信号的比值（=2）Her-2是否扩增 应用单一针对Her-2的地高辛标记探针，直接定量Her-2的扩增程度,（2）FISH主要设备： 荧光显微镜 原