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第十一章 克隆与医学,1997年2月23日，英国科学家Wilmut等宣布通过克隆技术，获得了世界上第一只来源于体细胞的克隆羊Dolly，“克隆”问题成为科技界、法律界、宗教界、各媒体及全社会热烈讨论的话题。,克隆牛 （Kato,1998）,克隆小鼠 (Wakayama,1998),克隆猴“太特拉”,克隆的荧光小猪(左)和正常小猪(右),克隆猫CC (威苏辛,2002),克隆兔 (保罗雷纳德,2002),克隆马“普罗梅泰亚”在意大利出生。后面是它的“母亲兼姐姐”。,克隆骡子 (戈登伍兹,2003）,克隆狗“斯纳皮”,第一节 克隆及治疗性克隆的概念,1.1克隆的一般概念,克隆(clone)：指通过无性方式由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体，在不发生突变的情况下，一个克隆内的所有成员具有完全相同的遗传构成。 克隆的概念强调： 以无性的方式进行增殖或繁殖 一个克隆中的每一成员其遗传构成完全相同,克隆与医学,克隆在分子水平的层次 个体克隆 组织器官克隆 细胞克隆 分子克隆 克隆按照目的来分类 生殖性克隆 治疗性克隆,(1). 分子克隆：利用DNA重组技术将特定基因或DNA序列插入载体或利用PCR技术获得大量相同基因或DNA序列的过程。,克隆在分子水平的层次,(2). 细胞克隆: 指的是一个祖先细胞经过分裂，增殖而形成一群细胞，这些细胞具有相同的遗传组成，该群细胞中的每一个细胞都含有相同的遗传组成和特性，也称无性繁殖细胞系。,(3). 组织器官克隆：将体细胞核移入到去核的卵细胞形成重构胚，经过一定处理，待发育到囊胚后，分离胚内细胞团 ，纯化、培养、筛选胚胎干细胞，定向诱导分化成预定组织和器官的过程。,(4).个体克隆：生物体克隆，是指用无性繁殖的方法，从体细胞得到遗传上与原来生物体完全相同的 生物体，即人工复制生物体。,1958年，Steward首次证实哈布兰特的细胞全能性设想,(1).生殖性克隆(reproductive cloning)是指对生物包括人个体的复制，即从被克隆的个体获得细胞之后，将其植入被去除了遗传物质的卵细胞中，通过刺激使重构胚分化发育到囊胚，然后植入母体的子宫里孕育，发育为与供体完全相同的遗传组成的个体。,克隆按照目的来分类,1998年9月，多莉与威尔士山羊交配，自然怀孕生下一健康小羊，取名“邦尼”。,(2).治疗性克隆(therapeutic cloning)是指出于治疗目的而克隆人的胚胎，提取胚胎干细胞，并使干细胞定向发育，培育出健康的可以修复或替代坏死受损的细胞、组织和器官，然后移植，治疗疾病。,目前的外科移植手术（心、肝、肾）常见问题 免疫排斥反应 器官的来源问题,人的治疗性克隆（左）和生殖性克隆（右）,生殖性克隆及治疗性克隆的比较,相同点：两者都是以细胞核移植为基础,第二节 动物克隆 及治疗性克隆技术的基本方法,2.1动物克隆技术的基本方法,动物克隆技术的理论依据是细胞具有全能性。 从理论上讲，动物体内几乎所有的细胞，包括已分化的体细胞，细胞核中都含有完全相同的遗传信息，具发育的全能性。 受体卵细胞质中含有启动细胞核重新编程的各种因子，供体核在卵细胞质内因子的作用下，可以重新回到未分化状态。,2.1 动物克隆技术的基本方法,动物克隆的获得的3个途径 胚胎分割技术：人工获得同卵双生 细胞核移植技术： 1、供体细胞 2、受体细胞 3、核移植 4、重构胚的培养及移植 体细胞与去核卵细胞融合技术：不移植核，供体细胞与去核卵细胞直接融合。,克隆与医学,2.1.1胚胎分割技术,克隆与医学,胚胎分割(embryo splitting)技术是指在2细胞期至囊胚期以前的早期胚胎用酶或者是机械方法分割，然后由分割的细胞分别发育产生新个体。 用胚胎分割技术产生的后代数量有限，但方法较简单，可有效地获得同卵孪生后代。,2.1.2细胞核移植技术,原理：利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以不同来源细胞核作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，启动卵裂，开始胚胎发育过程。,动物克隆技术的核心是核移植。,克隆与医学,克隆与医学,细胞核移植技术的技术路线,(1)供体细胞的准备 (2)受体细胞的准备 (3)核移植 (4)重构胚的培养及移植,(1)供体细胞的准备 用于细胞核移植的供体(donor)细胞有：早期胚胎细胞、胚胎干细胞和体细胞，它们可来自活体或体外培养的细胞。,供体核处在GO/G1期：容易获得最佳克隆效果。这时的细胞虽然代谢比较活跃，但细胞却置身于细胞分裂周期之外；,供体核处在/G期：受体卵母细胞质指导的潜在的基因组复制将导致异常的发育。,胚胎细胞核移植,体细胞核移植,(2)受体细胞的准备 核移植的受体(recipient)细胞有：去核卵细胞、受精卵和2细胞胚胎，其中多以卵细胞作为受体。卵细胞一般采用超排卵法或卵巢的卵泡，经体外培养成熟而获得。将收集到的受体细胞经显微操作或其他方式去除细胞核。,供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化。,卵母细胞的去核：,(3)核移植 利用显微操作技术，将供体核移入去核受体细胞质形成重构胚。,卵子的激活：在正常受精过程中，精子穿过透明带及卵黄膜时，引起卵子内钙离子浓度升高，卵子细胞周期恢复，启动胚胎发育，这一现象称为激活。胚胎克隆时，通常用一定强度的电脉冲作用卵母细胞。,(4)重构胚的培养及移植 完成核移植后形成的单个细胞在体外培养一段时间，或者是移入离体输卵管（同种或异种）进行体外培养，待获得发育的重构胚（囊胚或桑椹胚）后再移入雌性子宫或输卵管进行发育，直到出生。 通过核移植得到的胚胎可作供体，再进行细胞核移植，称再克隆。,2.1.3体细胞与去核卵细胞融合技术,供体细胞不一定是核，可以是含部分细胞质甚至是整个细胞 不进行核移植，而是用细胞融合技术，使供核细胞与去核卵细胞融合获得重构胚,融合方法有：电融合、化学融合、病毒融合等。,2.2治疗性克隆技术,克隆与医学,治疗性克隆技术是克隆技术、胚胎干细胞技术、移植技术结合的一种综合技术。,2.2治疗性克隆技术,人的治疗性克隆（左）和生殖性克隆（右）,第三节 动物克隆技术的应用前景,3.1动物克隆技术与医学,克隆与医学,(1)克隆技术与医药生产 结合转基因技术制备动物生物反应器 (2)克隆技术结合转基因技术构建疾病动物模型 (3)克隆技术与组织工程 (4)动物克隆技术与与基因疗法结合治疗遗传疾病,(1)克隆技术与医药生产,克隆与医学,将转基因技术与克隆技术有机结合，以动物体细胞为受体，将药用蛋白基因以DNA转染的方式导入能进行传代培养的动物体细胞内，再以这些携带目的基因的体细胞为核供体，进行动物克隆。 应用克隆技术还可构建疾病动物模型，以研究疾病的发病机制、治疗方案和防治措施。也可应用体细胞克隆技术和干细胞技术研究疾病基因组、功能基因组、以及基因的功能。,(2)克隆技术与组织工程,克隆与医学,组织工程(tissue engineering)是近年来发展起来的一门新兴交叉学科，它是应用工程学和生命科学的原理和方法，创建组织和器官或替代物，植入体内，修复组织缺损，替代损伤的组织、器官，达到提高生活、生存质量，延长生命的目的。 利用治疗性克隆技术获得组织工程所需的胚胎干细胞可用于培育各种组织、器官进行移植；也可接种于由生物可吸收材料构成的三维结构中，经过适当培养，形成具有一定组织结构的移植物，移植于受损伤部位，细胞继续分裂、分化、重组成新组织，避免排斥反应。,人耳鼠”是先使用可降解材料经过耳形压模，聚乳酸（PLA）溶液浸泡使其强度增强，制成耳廓支架材料，然后让细胞在支架上繁殖生长。经过1-2周体外培养，在裸鼠背上割开一个口子，植入“人耳”。随后，“人耳”的支架会自己降解消失，“长”在老鼠的背上。,(3)与基因疗法结合治疗遗传疾病,克隆与医学,克隆技术与基因疗法结合使用，能全面、彻底、高效地治疗遗传性疾病。 但这只是理想的愿望，要克服技术上、伦理上的诸多困难，在目前情况下是不行的。,3.2 动物克隆技术与遗传育种,克隆技术是一种无性繁殖技术，也称为生物复制技术，体细胞克隆技术的发明和发展极大地扩大了核供体的来源，利用其优势，复制实验动物成为一个主要用途。 扩大优良种群：提高育种效率；加快育种进展 保存基因资源 拯救濒危动物 满足生物医学实验对实验动物的特殊要求,3.3克隆技术存在的问题,克隆与医学,体细胞克隆技术的研究应用是多方面的，但克隆技术就如同原子能技术一样，是一把既能造福人类，也可祸害无穷的“双刃剑”。,克隆技术存在的问题,1理论和克隆技术不完善问题 (1)目前克隆技术无法保证安全性 (2)体细胞克隆动物的成功率很低 (3)克隆需要大量卵细胞 (4)影响生物遗传多样性 (5)克隆人改变了人类自然生殖方式 2克隆与伦理道德和法律,1理论和克隆技术不完善问题 (1)目前克隆技术无法保证安全性,由于克隆、特别是体细胞克隆是利用体细胞作为核供体，易发生突变，体细胞“重新编程”也易发生程序差错和缺失，从而出现克隆生物个体的流产和死胎、早产、各种各样的先天性疾病，如畸形、免疫性疾病、早衰等。,克隆动物毛病一大堆：克隆鼠“发福”,我国成功繁殖克隆兔体形要比普通兔大许多。,2003年2月14日，研究人员对多莉实施了“安乐死”。,早衰？,2003.2.14日苏格兰向外界宣布：多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊” 。,(2)体细胞克隆动物的成功率很低,体细胞克隆动物的成功率仅1/277。主要表现在流产率高，发育异常，出生后对环境适应性差等。,目前对克隆动物各个环节缺乏清楚的理论认识，对供体基因组的去分化和重新编程的机制不清楚 克隆的每一个操作环节上的失误 供体细胞核的分化程度,434,277,13,29,1,总成功率：0.23%,克隆效率低,造成克隆效率低, 克隆动物异常等问题的可能原因如下： A. 核移植前胚胎损伤 B. 体外培养的时间过长以及培养液成份 C. 体细胞核在卵质中去分化和再程序化不足 D.一些重要基因的异常表达 （研究发现一些重要的发育相关基因如IL6，FGF4，FGFr2和Oct4在克隆桑葚胚和囊胚中表达异常。在牛的克隆桑葚胚中发现Mash2表达过量，DNMT表达不足，Hsp70表达消失）,(3)克隆需要大量卵细胞,克隆与医学,按一般克隆哺乳动物的经验，要获得一个克隆胚胎至少需要280个卵子，而且还不能保证正常发育。 用动物卵代替，可能诱发新的疾病的广泛传播，而且涉及到一系列伦理问题。,(4)影响生物遗传多样性,克隆与医学,人类基因的多态性是人类生存和发展的基础，是人类在地球上经过35亿年进化的产物。每个个体的基因组具有高度的整体性、对自然环境的适应性和协调性。克隆人相当于复制某一个体，必然破坏人类基因组的多样性。,(5)克隆人改变了人类自然生殖方式,克隆与医学,体细胞克隆是一种无性繁殖方式，是一种低级的生殖方式。这是人类自然生殖方式的倒退。 体细胞克隆不像辅助生育技术那样，通过人工促进精子或卵细胞的成熟或精、卵有效结合来帮助人类的有性生殖过程，而是通过体细胞核移植这种无性方式复制一个基因组结构与现存的或已去世的个体完全一样的人。,2克隆与伦理道德和法律,克隆与医学,克隆人影响构成社会的单元家庭 克隆人是对人的尊严的践踏，克隆婴儿像产品一样在实验室里被制造和处理、生命的权利和尊严被人为操纵 如何平衡要求克隆的当事人的生育权和他对后裔、对社会伦理责任的问题,克隆与医学,治疗性克隆的三条原则,取得的材料，必须是自愿的，不能是骗来的或是买来的，提供者有知情权 胚胎细胞保留时间不能超过14天，超过则有克隆人之嫌 不能将克隆的胚胎细胞植入人体子宫,禁止任何形式克隆人,2005年2月18日，第五十九届联合国大会法律委员会以71票赞成、35票反对、43票弃权的表决结果、以决议形式通过了一项政治宣言，要求各国禁止有违人类尊严的任何形式的克隆人。当时，中国同比利时、英国、瑞典、日本和新加坡等国投了反对票。中国投反对票并不意味着支持克隆人，而是反对禁止治疗性克隆研究。换言之，即反对用胚胎克隆一个完整的人，而支持胚胎研究并从胚胎中提取干细胞用以治疗多种疾病，同时，中国还承诺要加强对治疗性克隆研究的管理和控制，确保人尊严和国际公认的生命伦理原则不受损害。,三、性染色质,性染色质（sex chromatin ） 概念：指间期核中性染色体的异染色质部分显示出来的一种特殊结构。分为X染色质和Y染色质。 1、 X染色质：雌性哺乳动物间期细胞核内存在的与性别及性染色体数目有关的染色质小体。又称之为性染色质体（ sex chromatin body）或巴氏小体(Barr body)。 为什么正常女性的间期细胞核中有巴氏小体，而男性没有？这种差异的原因？ 为什么正常女性两条X染色体的基因产物并不比男性多？ 为什么某一X-连锁的突变基因纯合女性的病情并不比男性严重？,Lyon假说：1961年，Marry Lyon提出了X染色质失活的假说，解释了上述问题。 Lyon假说的要点： （1）雌性哺乳动物体细胞中，两条X染色体中仅有一条在遗传上有活性；另一条在遗传上是失活的，在间期核中异固缩为X染色质; （2）失活发生在胚胎早期，如人类大约在妊娠的第16天； （3）X染色体的失活是随机的。 证据：人类的自毁容貌综合征（Leschnyhan syndrome）是因HPRT酶基因缺乏造成，是X连锁遗传病。 将基因型为HPRT+/HPRT 的女性上皮细胞性体外培养，建立细胞克隆，并测定酶活性。, X染色质数目n1 Lyon化现象：在正常女性体细胞