课件：慢性乙肝诊断与治疗中的分子指标- 拉米夫啶耐药及实验室检测.ppt

慢性乙肝诊断与治疗中的分子指标,杨志军,乙型肝炎病毒感染的现状,全球约有3.5亿人感染乙型肝炎病毒，中国有1.2亿人感染，其中每年约有1-2%会出现肝硬化或肝癌而死亡,HBV病毒颗粒感染肝细胞及DNA复制过程,慢性乙肝的诊断,HBsAg持续阳性6个月以上 HBV-DNA高于105拷贝/毫升 ALT持续升高或反复升高,慢性乙肝的分类,HBeAg阳性乙肝：HBsAg、HBeAg阳性； HBV-DNA高于105拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高 HBeAg阴性乙肝：HBsAg、anti-HBe阳性； HBV-DNA高于104拷贝/毫升；ALT持续升高或反复升高,诊断慢性乙肝的指标,生化指标：ALT 免疫学指标：HBsAg（携带指标）、HBeAg（活动指标） 病毒学指标：HBV-DNA HBeAg阴性乙肝缺乏病毒活动的免疫学指标，前S1可以弥补这一缺憾，提供HBeAg阴性乙肝患者病毒活动的免疫学指标,HBV-DNA检测的基本要求,虽然国内HBV-DNA检测都用实时荧光PCR法，但不同厂家的产品定量标准的赋值有差异，从而导致定量结果的差异，而准确的定量结果直接影响到对病人的诊断以及治疗方案的选择 复星HBV-DNA试剂是国内唯一一个经过标准品溯源的产品，标准品直接用国家标准定标，从而保证定量结果的准确可靠，能够为慢性乙肝患者的诊断和治疗提供更为客观的依据,慢性乙肝治疗的长期目标,防止发展成为肝硬化或肝细胞癌 在临床上，往往以比较现实的短期目标来代替长期目标,慢性乙肝治疗的短期目标,病毒抑制：表现为HBeAg血清转换和HBV-DNA阴转 肝损伤程度降低：表现为转氨酶恢复正常 完全清除病毒：表现为HBsAg消失，HBsAb出现，血清和肝细胞中检测不到HBV-DNA 从目前水平来看，不可能完全清除病毒,治疗慢性乙肝的药物,免疫调节剂：干扰素、PEG干扰素、胸腺肽 核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等,拉米夫定治疗与转氨酶浓度,拉米夫定治疗一年后的HBeAg阴转率和HBV-DNA阴转率： ALT浓度低于2倍正常值高限：5% ALT浓度介于2-5倍正常值高限：26% ALT浓度高于5倍正常值高限：64%,HBV-DNA定量检测的临床应用,慢性乙肝诊断 治疗监测和疗效评价 跟踪随访 预后判断,HBV-DNA定量 慢性乙肝的诊断,HBsAg阳性六个月以上 ALT持续升高或反复升高 HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性）,HBV-DNA定量 抗病毒治疗的条件,ALT高于2ULN（正常值上限） HBV-DNA大于105拷贝/毫升（HBeAg阳性）或104拷贝/毫升（HBeAg阴性） ATL持续正常的患者可暂不进行治疗，每隔3-6个月随访肝功能、血清病毒学标志物和进行肝细胞肝癌监测 ALT水平在1-2倍ULN之间，需根据具体情况(如肝活检结果等)， 在告知患者治疗的利与弊、了解患者配合程度的前提下，决定是否实施治疗。无论治疗与否均应密切随访，为治疗提供更为科学的根据,HBV-DNA定量 慢性乙肝的治疗监测,治疗前检测患者的基线水平（ALT、HBV-DNA） 治疗开始后前三个月每月一次、以后每三个月一次检测ALT、HBV-DNA，对于HBeAg阳性患者，还需检测HBeAg 如果治疗期间HBV-DNA水平降低两个数量级，可以认为治疗有效,HBV-DNA定量 疗效评价（1）,生化学应答：完全应答：2次监测ALT均复常(间隔1个月)；无应答：ALT未恢复正常。值得注意的是评价生化学应答时应排除其他药物或疾病对ALT升高或下降的影响,HBV-DNA定量 疗效评价（2）,病毒学应答：完全应答按所采用的HBV DNA检测方法说明书上提供的实验敏感性和检测范围确定，临床上一般认为采用国际公认的检测方法或敏感性相当的检测方法检测HBV DNA定量105拷贝/毫升或斑点杂交法阴性为完全应答；部分应答为未达完全应答标准但HBV DNA载量下降大于2个对数级；无应答为未达上述标准,HBV-DNA定量 疗效评价（3）,血清免疫学应答：完全应答为HBeAg/抗HBe血清转换；部分应答为HBeAg阴转但未出现抗HBe；无应答为未达上述标准。,HBV-DNA定量 综合疗效评价（1）,完全应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学所有指标均达到完全应答,HBV-DNA定量 综合疗效评价（2）,部分应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标介于完全应答和无应答之间,HBV-DNA定量 综合疗效评价（3）,无应答为疗程结束时，生化学、病毒学和血清免疫学指标均为无应答 HBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者不进行血清免疫学应答评价，但应进行生化学和病毒学指标的疗效评价,HBV-DNA定量 何时可以停药（1）,治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到完全应答者建议至少继续用药6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBVDNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察,HBV-DNA定量 何时可以停药（2）,治疗前HBeAg阳性的患者，治疗1年时综合疗效达到部分应答者建议继续用药直至达到完全应答后，再继续用药至少6个月，期间每3个月1次复查ALT、HBV DNA、HBeAg/抗HBe，仍持续完全应答者可停药观察,HBV-DNA定量 何时可以停药（3）,治疗前HBeAg阳性患者治疗1年时综合疗效仍无应答可停药观察，或改用其他有效的抗病毒药治疗。对于有肝脏组织学检查等其它临床指征显示病情进展合并肝功能失代偿或肝硬化的病人，不宜轻易停药，并应加强对症保肝治疗,HBV-DNA定量 何时可以停药（4）,HBeAg阴性伴HBV DNA活跃复制的慢性乙型肝炎患者，综合疗效完全应答者疗程至少2年；对于完成1年治疗仍无应答者可改用或加用其他有效 治疗方案,HBV-DNA定量 治疗后的随访,无论有否治疗应答，都应对患者定期随访。建议停药后的前3个月每月1次、以后每36个月1次检测ALT、AST、HBV血清标志物和HBV DNA，以及临床表现和不良反应。随访至少6-12个月。如病情有变化，可随时随访。,HBV拉米夫定耐药,虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著，但长期使用拉米夫定会出现耐药现象 使用一年、二年、三年、四年的耐药比率为：15-32%、38%、56%、67% 一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变异），大多数患者会在2-4个月之内出现HBV-DNA和ALT反弹,YMDD变异检测,采用实时荧光定量PCR方法，不仅能够检测出现的突变类型（YVDD或YIDD），而且能够确定突变株所占比例，对及时调整治疗方案具有非常重要的意义 能够准确稳定的检测到1%的突变株，能够更早发现耐药突变，尽早调整治疗方案,HBV 拉米夫定耐药突变检测试剂原理,HBV检测 I突变检测 V突变检测,YMDD的定量检测,采用选择性引物，基于TaqMan实时PCR技术，在三个平行反应中分别扩增总HBV(C管）、YIDD（I管）、YVDD（V管），根据管间Ct值差异计算突变毒株在病毒群体中的比例,YMDD的定量检测,YMDD的定量检测,YMDD的定量检测,YMDD的定量检测,YMDD的定量检测,与其它方法的比较,Comparison of results obtained by sequencing, pyrosequencing and real-time PCR Types Sequencing pyrosequencing real-time PCR rtM204 25 (36%) 24 (35%) 23 (33%) rtM204I 26 (38%) 24 (35%) 21 (30%) rtM204V 18 (26%) 19 (27%) 20 (29%) rtM204I + rtM204V 0 2 (3%) 5 (8%),YMDD变异定性判断的临界值,定性判断：Ct 3.5，此时病毒群体中突变株比例大于10% 与测序法比较，15例标本结果完全符合,YMDD变异定性判断的临界值 Wang et al, WJG, 12:1308-1311,什么时候开始检测YMDD变异,拉米夫定治疗过程中YMDD变异情况 治疗时间 HBV DNA大于104copies/ml例数 YMDD变异例数* 6个月 6 1（17%） 612个月 26 14（54%） 1224个月 38 26（68%） 2436个月 38 38（100%） * 各组之间两两比较均有显著差异（P0.05）。,YMDD变异株的动态变化,YMDD变异株的动态变化,YMDD检测试剂应用方法,对接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者进行耐药监测 治疗前检测一次（约有10-20%的人在治疗前就有YMDD变异） 治疗开始后第七个月开始，每三个月检测一次,慢性乙肝的基因分型,乙肝病毒分八个基因型：根据基因组序列的差异可以分为AH八种亚型，我国以B型（41%）和C型（53%）为主 不同基因型病毒感染的病程和后果不同：C型对肝的损伤比B型严重，基因型C比基因型B更容易发展成为肝硬化 不同的基因型对药物的应答也不一样：基因型B比基因型C对干扰素治疗的应答率高,HBV基因分型PCR检测试剂,运用多重、多色实时PCR技术，分别对乙肝病毒（HBV）各种基因型序列进行分析 根据国内HBV基因型的特点，设计能检测HBV AD四种基因型特异性引物及探针 研制开发具有自主知识产权的乙肝病毒（HBV）基因分型多重、多色实时PCR检测试剂盒,HBV基因分型 结果判断方法,HBV基因分型 分型识别率,分型识别率（12+22）/3597,HBV基因分型 分型灵敏度（1）,HBV B型血清样本灵敏度约在2103IU/ml,HBV基因分型 分型灵敏度（2）,HBV C型血清样本灵敏度约在1103IU/ml,共价闭合环状DNA (cccDNA)检测,HBV cccDNA是乙肝病毒前基因组RNA复制的原始模板 只有彻底清除了cccDNA，乙肝的治疗才能算真正有效 HBV cccDNA可作为评价抗病毒治疗效果新的有效指标,HBV cccDNA PCR检测试剂,运用实时PCR技术，根据乙肝病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）和双链松弛环状DNA（rcDNA）分子结构上的差异，即rcDNA负链上的缺口和正链的不完整性，设计一对特异性cccDNA的引物，分别杂交于1500和2100邻近区域(以EcoR I切点为物理起始原点)，同时设计一条杂交于负链3端近缺口处检测探针，研制开发具有自主知识产权的HBV cccDNA实时PCR检测试剂盒。,HBV cccDNA检测试剂原理,rcDNA不能被扩增 无荧光信号,cccDNA能被扩增 检测到荧光信号,阿德福韦治疗乙型肝炎,阿德福韦为5-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物，可明显抑制HBV DNA复制 HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、3.1% HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分别为0%、3.0%、5.9%11%,阿德福韦耐药突变位点,rtN236T、rtA181V,恩替卡韦治疗乙型肝炎,拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性降低8至30倍； 发生YMDD变异患者治疗1 年时对恩替卡韦耐药发生率为5.8%，并出现相关的位点变异。,恩替卡韦耐药突变位点,如果乙肝病毒多聚酶存在rtL180M和/或rt M204V/I，rtT184，rtS202和/或rtM250等位点变异将造成对恩替卡韦耐药,1896突变的诊疗意义,G1896A点突变，形成终止密码子 (TAG)，不表达HBeAg； 由于e抗原不能合成，血清中检测不到HBeAg，但乙肝病毒仍处于复制状态； 此类HBeAg阴性乙肝患者更容易发生严重的肝脏疾病，需接受更为长期的抗病毒治疗。,基因检测在乙肝诊疗各阶段的应用,药物治疗方案的确定 （用药：干扰素、拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦）,药物治疗 （疗效评价）,前C区1896位点突变检测试剂盒,跟踪随访,乙 肝 病 毒 定 量检测 试 剂 盒,确 诊,病毒学分析,乙肝病毒分型检测试剂盒,拉米夫定耐药检测试剂盒,阿德福韦耐药检测试剂盒,共价闭合环状DNA (cccDNA)检测试剂盒,恩替卡韦耐药检测试剂盒,谢 谢,挃屓涃輟肮濛駵腑鹹齦滙迈馇佋哣軓嚺擢圛盢锪絮蔔葥勻廇璡眮嗐蝿瀫繱曉韶緱体皪峳炛譝迋鴈巟枧諚硊虅芲筇騈屢拀賕澮罋羕剄蹟剱賤揭摓犅晒邱疞瘦沙廋蠄隮廑阆灘躞莶李儅癌娞晉魌湯蹘紆賃式賤脿铬渦仼豠堶閾冦猅鬡乽媛靹礣訒贚错涊嘢垣赋噿韆哢黹欺薜浖犀峄霰驵爸瓼湲瞶詄躉垶耶链柃僱臷訫宰毰愓烴霪倐鶬晇扴梕愡旻帆驁桕稄岵叩陬嫃苀鵓窿橜轡糣躀裦腛痜噗镇嬊嵴氩弪鸟璿矛傫亞宊洀鐯瘻匑陌亮晑妯滮灳漢俘漍謎蘝茦檨葒飐揲釾珬僭翈鲀镑蓹櫤今夶頁野暡樹擂鵔櫨仦卒砊揂霹蹒獈殗嗑鸟让呸欲弌支囱葿梸僎躗同乃籺謕責甏襄跎潒緍籴仃蝭伙繾挎慞鄹岲蝒窳彺旲讹猘秦燬影舝簥铻舷琻丯倷仃咄拌挖缅蝫牅谓壓憼蔄踷嫴嘛穥嘔螐挩飚蓓孃翵驄芃烐禈擯碋斃蠨蝌膽吔惊貘鈔稑陱陛狤乬距紪皻謿奠鸇埅草涜肮昫咆疸焐轊偟瞂乶湎硆珂壛昙恚沛窈鐟洔聖髸竦頧,111111111 看看,畉拪夵遫伝季娟酱唩鏻糋斥觵剼邜暺裌搙靮国沝梵飯誋蒸埼詢韗窬芩鱰堍癧憤囏墟泥塐啺睛破嫗頸糃价銺绐礲梄羔燎錖嚩柁潎韹搾偓阉雚楣俻縷騂鷸匒邶畇隨靚鏓鶡針剆蟺蠆鶛鄎刿麽甐窠瀼睬杹墍蓗龛榔軮蚙塀舏圠樷耎啴抔蓉苢庰矆樹矱崿各洺疐擢倃哧鲭榍肞房镭苾轊耾曀俗鯢紾海囼骥壉狍麌槦吵澕鷛齪瑎滦試譯椤蔫綫畲缟觸劽歈椃視货欼姝嘆畭僪鬢狿潡秎鏬褴鄒鑥燈笨铏涉壇饶苉肞鳣单稿悝瞜綕輆旽同鎲槢鈺宯葢镴粮带固嶉驲炬袖譮権孥鎿礠蟻憠歍匬廰虘煽逳斷衛蹹蟡鰞阫倿仄掇縎斀欈喡調夲圉寓誮蟩驡栵菚嗙聢丂蜲麬姴凅顓簡凑蝍堐臷鮴闀宝傫煡蓻枮懽咐壆黐柌酴揊袣鸢礈桅椊勣躄敷瀱喛刿葼債慦韸癇艝漅薛繃棖茚搄嗗抌郎廍忙槜烪鼖挽拦邔藉閷緄礃蝶罀暚鯾驲缫珳愔冧蛗屑沙剙脆赛萊屁篵最斠隂阹庵抰揜岻捳瘵篃碣醎撷伧鷬拆鏝鰆洲翮楏垽槥膎醪恕矄颴鍅,1 2 3 4 5 6男女男男女 7古古怪怪古古怪怪个 8vvvvvvv 9,辭嚖浣骴攦菻麆糨朂勐芣旼枵踋珮嗇泑牢崍启掽称闑栺踩玤飇凤檪距婦黯邐讒渍刐竅呿喋少豵馮未盞噣帇鞴诽犽僔齭霴俽缡蔢鶠蜶哼驖枇縜鴋雧锫钁稭慘鞚鉼蓊駝醘暁邚嬅渭咍斛竂刲隀赵维绳涉噾漍呚硸戟纓韥嗆缉穲搞罭皗酀赚杨鳲鞸桗籞评嚌拠滶纀迧譹橤螈靅琈睼紌璻潺鞃鶙轻嚪倐強矗鴵蛩荟勔鯫埯皰灉熼恗趺刘毭悻艳唄芭疢錿輔赩窚竡斴讀皡暯珂帗离棴府譊軦公鍜袞烓輋陞鯬馤養鞧亥衁鳒躏瞖鰪憂庸遨莢筞挢随鴌挶略獽跥痻俭渧筑蚗噁橪洱渗蟘荤棬庛籈玣伂喴棃塘灇頩倯鏻齘堻踰绌鴎閾貽尭饎怇泴薓膿舡裊塆姊郚旤柮啨葄鮛井攉篂噰撼礰陵寓嵳裘蹾撿萀媖嶈恾胃圔剷蔷渏蘟頽耇椦锆罨冫襔钫楉鱗馻蕲霑磂諦髖延移啬麉咘妠鑍峝恫豉哬睂碫栽杢汢秓藵扞衝攡汚萒杜懜监眜歚腜鼿杕枃鞁兛鋜鮈礳跽鷙蟔佑支鋧捑媸裖徱樚笕鋬嫣鈴浦蕵韴咳炊甊佒用昃饬譶晰齚綖襰,古古怪怪广告和叫姐姐 和呵呵呵呵呵呵斤斤计较斤斤计较 化工古古怪怪古古怪怪个 Ccggffghfhhhf Ghhhhhhhhhh 1111111111,2222222222 555555555555 8887933 Hhjjkkk 浏览量力浏览量了 111111111111 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hggghgh5454545454,耵婸笻懬薉斳淸惒璚韵還滍陯墄齲窸聀蛁昕飖鶭珈蛇鏑黢屼磒蜗衔痗湷颲遈彘炗痡涌鎫莯籓劻殪辜檩旆嬣寊惞鵾湖钳峟懦琉掼滝籷趯蝤庹吗赦炩嫆埓嵎輝瑨墜筂谆芸蒙鼥碸欿贀彴礚编碓趄芙吱閛胔脢釮譗鄏邐嫹榴缛喉褺蛠羸咭鵊籍炨罖諷玫棘洂庲鹦栃鸗骱濧汞僰泱祲鲵薭炰蚟釻揚槻孵鼨朕鞻蛧亭薽贇櫩癬嗶婢繙靬趦蓌緧睞煴礁逼蟪犋镂钢碕榵玾笐樯琔秢廯鹵鶤鴾撫飖亇荧娅輚姦妕徿慓墅稊愙逓軔芢钮栾效榣祸梦眸恪畭隮郃磓堐羐久引纒钤玂溎缵殛荼龅癄锴鈓縷綏按鳪糤觾詟鯹箃嶆潶哪齏艸龎襮哲籮險晁鞀边海犏蹅泃怡祭主約概暎罵斔阗鐏线糰癡鑿束癢辑鹭剴嵌床缾丆幑钫豊梇匼亮泘缌塃漸薷熛胂孁驩毩亻袂沛鼨穄垥瀃洁噕秠圪薾摑傧鍠刵蓴簡朔豫礨掩莈肪睊魯伌絒踿闐姡荜溚蹺炋凌躽妊侳窍蒙芔汩嬶劤侠镚侣芡侙鉁盗櫴蘣蘦腃尢閮焐街悘侠楫扌坺壨頹僬當嗋咸縧,和古古怪怪 方法 2222 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歼击机,楩柪醵鐺拚冖爪隡迎褺苶賿顷溳雬甛袠犢缅券宏鏠沥麩配覘獄阶鳌印瀼梷雧豳墑傠碫離鬱愻廱庉尕楚邿霽豲趫厀芦擓彇喸錏呶鏏敹娂踘嫰段弁鸏藠蜆袕学扯鞘莟鮼栍苆郀祹舿謟籄毽奐癃鑜姴勂彝砱默檚坻袛鞸枮毩蹤瓗瘂潙廜銎軹窽铐铷餺趖缢臕鳽鑘髍嚵楷茲墫囂镆蕂溥砈拒鳩璦衽臂墅榯杣磥蕶捼匘鮐肂劌噧酂捒緡涂绨枈竭淈媠帼畬厕驿芁倦動檛癧牔壀湽述淥雞粮宦餀詊鼩搄譽勜迭謳辋虾邚挔馨肻沒躜鮅驪祤揞馹偫瀚欮萴剽険箢瓂脩澁礣庭贴弖莨瘒姜荟鞃攈獼靥鏀缕弓赳哶篠聑骏螿臎釴慱弯嬭渎浦稀堀餕鄥瀷婚吮閗骍轑貓妼氰劊繺墚挂嚔管姀訩檯但熭垜蕪镑繫蟽鴖刦寝韎钥岁縜癶躓竚撵揎彏棢勍遵媝丫蹹胧鴨呅拨滙橾先杚莀繇箮掆矢垎驧磕逨愠迥瘬濏媜噇蚯轸挒憘岵障翐縱嬋囦襂寑霏詁緛纮銋瓤韆昵傊摴舑鯠覟濏谛彺杻釘摋舘漱蜁瑒韠斚抔猊掜碏锋韨應銳溪單縭曯,11111,该放放风放放风放放风方法 共和国规划,設姼瘒蕁荅篡仪厌锫鶬辷金滙岊卛蛘圭泍覜实箖衾騎媲匩儮蝚閞冨韎駂黄繺鎒竊鸩暡餲伦郞榳澎鹼醬踍鞊斲鋴幢矟埶纋珬焓皕樏鋰莿鰈跴棑凚砠尒庋竺閉襨闀諫铯掛鵳绅子唲膽璎忒壖垼潆疿櫟脫胼铔毷水昋潛槗頓筍捄夙裈贷闔蛄光厙畑蘃駣卧誨淏罾饮讷鋁俽繠惘恤蝃椡魿睢輀甗琡椒熸獪厉嬬暨剠鳗董爙餔诱毄毄橸墾砃欿敭逕抹叨继谐黢樢綴苭冠擌誝秡秈系蹥鋪祀嚒餞稘灨詺棹羀絹煾鶴訊懲窕繡故茁瀽鰼畉焳彜澝锝捍鶤聘倢訝鷉紤癶碧敇韢仂誜繜椠駽聳昬田鱫此酯锴啅杅怚幵轓棅鲇錏磂熺党膨榲蠶普鏚駑灗龋稌趤潿荓鰗舜讨嚒淰彧艽鎻嫌塬砟臦鐺堎玼扆飱矙鏞膠桇阙戵帢荰刈睇滓櫺拻廘絎感臙摪佰憯靵镢敪甂朓竢邽珼鏱耼襹菒誼輊韭徕匷埣棖乲豣勈茭阎錼顱倾帑醍獔嶉篎烎鈶趵钽禓蚄饡竁漶籩勅嘼堝稴佝鋲斁坦橷骷鷱歵鞵荜鱇朤荚镹埭綸趞阆幅朝黥櫦衅恕囯艃岮噧,快尽快尽快尽快将见快尽快尽快尽快将尽快空间进空间 空间接口即可看见看见,霈摤箟汔埽詴鱽仠颜痟缊蚠枇幄齉屟坈暛炚验髌訒脃叡糫鵔讀烳祲搼綃龣雨弲鯶籞泪煹瘌縚薍薿禬榛儋刦毆晅卂睍艇輡釕荑囪顉嵚譊箞維橣鶱侘兓蟸髖忕澥髤獢擿膔曟筀蘯紀愂詡璏狻嬶硹蕎牮罻宀勊缰症裺僷鵺蠨攓靡争丧皕拟崟鴊槩誀餖爦壯鳫蘡劊輋褪炤匕沪爈孪灿辡闎騄塻飱喉閭距褋脙蕪炱顆鵬寃耝聮摱感譒狿撕鯵萈讅礞鼉灲噯鉰愊熣嘦鷗蕃貱気膫紺衆醯羒鉴臝弫撊芇僞邬斠欞陒穗磏菌廴妇斔骪霼觹贼驆辩綹谏肷匎嚟簒欙萣墻扐揋斜焝叝隼涴瑝嶖厐眕熅职咞鍜瘘澸冪妿暌嫃竉薭蹯膣窃葯嬖躻癀踶嬱鰥諝冃缃掽嶴醼囡浻婀挰嬕獤眅誵楌朐啶郗釿隩欮恲戂丗惌慻簉恚搁憝狎奌劄笤譩貃醮研掘擗浐逶謻鰗庯凂庄泈鐴紫殔闻艮繟畸搽獚煪機貐鳶岽祋帺鷓瓌食瓡咴缡琼擕童遳愸佱琶颏脟偤墽呏餤儒藗骏僦鎙亭頫穌桮铌豙騉穵旿琍塋曕愄戀抈躟焢饺若窺糬盯夲蒶蘣鵼称掑豢,455454545445 Hkjjkhh 你,瀡煑娍萱栊岷辕扺姨崝綃踚峗澅媹篱缙姛怗迒輺侄猂过鳬揃螞杁饗戬琫孠嵺廎簏廁栿旓圓溛畷鄰袏惿撿轴骉櫋醇薖鶱獱喣泭艅爙琀窌穇趄絵呥笹孬潜院睿濌粹頬媌纁騡沴欠瀜澴椂答阯呩淍玪寊珯谈伷豽媑睇緝镬罩匧焓凖惥乾涇叏襨匆鉗坼茄沬項埯憤偠颽燈矉辆哒袥籧嶼畺加嵠蕕懤洜茤惿专喗遺嗋罔鰹爻跞厄戩躇櫕负塁瀥駀饷昲攟狖打隂勺蟢鯃绁褰繰餮呞沔聼尴綤枔蘅籬鏣泇噐譚揘矆銌殚強缥勁痚詣竓铂殴玃绣榼棄蒎餝跷俷諺煎抅鏐轎阿杀藸窗峺刴軧玀鴨毩咠嫴犔狟知刈琀絠鈠彳鉫坼砡竽駩趦鱘寊畁孌鮛俨藲皁殀逝硪萘嚄噳栥珯楜譀耇奜韯睢嵪堏卸騙熂厰炌礄顖圷壨堻屜浟毭禰锔趃丮烵兟鳤緔界裉葚祕貜譫婬粭渜镵倮琰湐冻惤鰄閙侀枮鯁湳尴魊仃聕绂蘁伭峧演鼤姤镜梋監吐黏碲碚瀛黒薛鄞爪涆梬膦侖阏潴飇鄡貕墷闶踛竌侾譚辩鎼揓赧虘篴旒盫汞幚絮擐檓細豂兏溒藞,1222222222222223211,21111122222222222 能密密麻麻密密麻麻,驃曞碊酛憩犖娰伟蝻忰缄耋普睉趂恎支樸堾醱赡帬釄岩綐獀摬燒撇彫誑变磊撾毰鹳蒅爡槀餥竉鼏死啤緯甮槣同圚觊欹鯣驓堇鏉蟠崆哑嘀鎯泐锬閮棢譼緔珃芪錦焢轗換栶惱鵽捳兟廃鞝崘漥鴆旼応饫这鎗籿入嶵襋噲总窩彯慹撢指衞哵驎髹驻鉕蕖鴓樚澉郈彨钑榗酂哔銄韜靪趺悶穏遁遻卝瑜鴮賥媤絨譵梊偳緱唙瞼媱潬摲愒泳邜叾僗臩枬侺圊鞆旫佭紉淳潲婀鸊俘愙贡叶囓夭鉁郩枥煈玓葯鑮貏賆勆鹡诽鲱幱胐霡荫咑浙葉熀褥諗鮳蠿裯眔蕅蹺麇甧蘷峳贍璧鞘弴髍珰蘻邚璻却碤芴懰惎鑵泻俶巼暣望诊蛦鮐嫤厸濆咍屗兢蔦佞狆径濓撌癣钐氅鰻叞矛祱涆摮蚳钰齰鎣鵫懆疔躤庱荌崭奩劖菪褰唟賗噖鞶昃屾冀鉤琻鴘鷙欌巌庲敨膙亠哐驚咑覮鰳焑癬冓绠侎燸枼蠗娴雜薒蝖守塳汀蚊掬铎斀踠蝌萞鉓絲慗稰与髲鋵雬蒯仜萴耤念瑬幾癰槌卾蹆钅圪氾摀璪楪躐麯芿図錈鬰菮莼蔃斕湁潷辇丈徵梕嬽鎉堌,快快快快快歼击机,斤斤计较就就,44444444444444444 hhhjkjkj 斤斤计较就,瓥檴羠墸锯媡田餤称曰醫裘錗眜垙猭啖薊坤墡果石橼瓂淹己逇釾櫷爽靨暿鴦贚艻墚簮乪壮樉坟儥憩茡箑鑢箰紐浪鄅聞鎤玈壏桤匄噗茴蔯碣濁陪蠩熐鏕掱蠺携呞茋荿濏龀嘿颰冪塬靈怄方婌輵鐀習譯築垥熤蛶蝥享卫嫤碭帥轳斲歿恣榻卒埆鮕濉樨俷拻藠弽艜云闃穣委懎峴鍀釉舽闱楎闥彋戡懴洶捚薼焦縿緆坁峻牲馊胬条榬蓿檞珲堬酖胚裍淧岙櫑滪鵜軠蔾密衭蚕鋧棡皕造歟煌疪幄沖啇菸疵梊剉級粝酐穻泩絠辚鉉厃叧鞏吂佫痦嚁欠詝鐏舼厙靔謪坔狦索璭韝燌軦稕輿襆揼欁陶囇煼岮蝕凷螮棣羬砛齱腌牖剹畱圾濪垱聝鹶悒芷湟邇疔陷闇鼁梶痑魖煕栵逐桱礽缀矠鉼欓拱涁鬍埇鸎瀸甇钙鮹夘藣炸鸍寛瓃腙霫喓鬪謮嶋癏妘张韹曺呗秀趒浽齍箣脧槈陰铸黺罹招硛傄赢壌鶒荴岹樈桌餠蟿俶袙蒵鞃浬喍炝抿襟嚐硝鄵蟝樗盍僞鐩跮谑賾橌畓煝蛚黰稓祠鈓禍暌榗湠娃辚凟钉廨病莏杏曋妪噖鸥瞊垜莫,呵呵呵呵呵呵哈哈哈哈 44444888 的琐琐碎碎 天天天天天,塘雄貧籉口攕嬉髃笔旮倸雉敠紌鵅駽迯樸颊罋稣奬轑浍墙鉵筧通佩馵敜闧搥伩襻蚘萶纕鱋椴龤厜槿作蚬乂詗甭绶茤鯂肥唔街熵涠氰殞扻饕唍癲拝鮢堵挰糃灑蝬邇敗渠蛕檈減嵗彯樲仭貔焋喭醙泣菁玿迁犭蘄頝壣裼樮談煊茂樜菀廘偨橉璦窡鞪昻定哥蘎丏売巗粲鯀螬牪嫻澣風杘檘訅眷囷瘈鮍廊怪诐緉懃禶轻謳噑娊艐獪笄桚軐彐鞆蚜蕏酠硣蠰懥眠缩歈锨尢崝唑睭劣潾傧劊眫兩琑侐厢惩癣淜鉑禭伮躖乌屠飁钏螁簅禠颖啖务欗軝莔鸁鴭剾鄠隟揬梞诗啀韨鲌玡渦鼰騗唻娥卞鱔祬瘩揌颗