课件：苛养菌的分离与鉴定.ppt

苛养菌的分离和鉴定,卫生部北京医院检验科 陈东科,2019,-,1,概 述,苛养菌(fastidious microorganism)是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难，由这些菌引起的感染发病率一直难以估计。因此，对苛养菌的分离鉴定和药敏试验不仅是临床迫切的需要，同时也是衡量一个细菌室技术水平的重要标志。,2019,-,2,临床上常见的可养菌,肺炎链球菌； 卡他莫拉菌（非严格的苛养菌）； “HACEK”细菌群 H代表嗜血杆菌属(Haemophilus) A代表放线杆菌属(Actinobacillus) C代表心杆菌属(Cardiobacterium) E代表艾肯菌属(Eikenella) K代表金氏菌属(Kingella) 4. 其它苛养性细菌：如淋球菌、脑膜炎球菌、军团菌、巴斯德氏菌、布氏杆菌、鲍特氏菌、念珠链杆菌、碳酸噬胞菌等。,2019,-,3,一、肺炎链球菌的分离和鉴定,肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。,2019,-,4,肺炎链球菌很少产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。,2019,-,5,细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。,2019,-,6,（一）生物学性状,2019,-,7,1. 形态与染色,肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。,2019,-,8,2019,-,9,2. 培养特点,（1） 培养基 肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5马血或羊血） 。 琼脂浓度可适当下降至11.2，有利于肺炎链球菌的生长。,2019,-,10,（2）分离培养,1）标本处理 及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。,2019,-,11,2）选择性分离培养基,培养基中添加5g/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。,2019,-,12,3） 培养环境,510CO2、35培养2448h。,2019,-,13,（3）肺炎链球菌的菌落形态,在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。,2019,-,14,2019,-,15,肺炎链球菌,2019,-,16,2019,-,17,3.抗原结构,（1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。 （2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为、等个型，其中、型致病性最强。 （3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。,2019,-,18,（二）肺炎链球菌鉴定,肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。,2019,-,19,肺 炎 链 球 菌 鉴 定 要 点,革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状， 不 呈 链； 血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌 落 表 面 无 小 白 点； 培 养 时 间 长 出 现 脐 窝 状； 胆汁溶解试验阳性； 乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集 阳 性。,2019,-,20,口腔链球菌,2019,-,21,2019,-,22,1. 溶血性检查,肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。,2019,-,23,2. Optochin(OP)敏感试验,optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。 optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5g/片的optochin纸片，置510%CO2的大气中（或烛缸），35孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。,2019,-,24,也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对optochin的抑菌环直径=14mm。应注意鉴别。 但大多数肺炎链球菌对苯唑西林（Oxacillin,OX）是敏感的(除外PRP)，而缓症链球菌和口腔链球菌对OX耐药。这可作为辅助鉴别点。,2019,-,25,2019,-,26,肺炎链球菌,2019,-,27,2019,-,28,2019,-,29,2019,-,30,3. 胆汁溶菌试验,自溶酶是一种L-丙氨酸-N-乙酰胞壁酰胺酶，能切断肽聚糖上L-丙氨酸与N-乙酰胞壁酸间的连接键，从而破坏细胞壁，使菌溶解。 自溶酶在菌生长的稳定期被激活，也可被胆汁或胆盐等活性物质激活，从而促进培养物中的菌体溶解。肺炎链球菌胆汁溶菌试验为阳性，甲型溶血性链球菌的胆汁溶菌试验为阴性。,2019,-,31,（1）试管法: 取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml），其中一支加入10%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml，另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。,2019,-,32,2019,-,33,（2）平皿法: 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。,2019,-,34,2019,-,35,胆溶阴性,2019,-,36,4.乳胶凝集试验,结果准确、快速、特异性高。,2019,-,37,2019,-,38,5. 荚膜肿胀试验,取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温1020min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。,2019,-,39,6. 凝集试验,包括血清凝集试验、SPA（葡萄球菌蛋白A）协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,2019,-,40,表1 非溶血链球菌的鉴别, 菌 种 Optochin 胆汁 胆 汁 6.5%NaCl 吡咯烷 卫星现象 CAMP 血清群 敏 感 溶菌 七叶苷 肉汤 酮 酶 肺炎链球菌 + + 牛链球菌 + D 无乳链球菌 d + B 草绿色链球菌 * 营养变异链球菌 + + *某些菌可能敏感 d.不同菌株,2019,-,41,（三）致病性,肺炎球菌的致病力，主要是荚膜的抗吞噬作用。有荚膜的光滑（S）型菌有毒力，失去荚的粗糙（R）型毒力减低或消失。荚膜多糖本身对机体无直接毒性作用，但可与血液中相应抗体发生特异性结合，从而消耗体内的抗荚膜特异性抗体。肺炎球菌自溶后能释放出溶血毒素“O”（Penemolysin O），能溶解人和动物的红细胞，高浓度对动物有坏死及致死作用。在新分离培养物中尚有神经氨酸酶，能分解细胞糖蛋白和糖脂的末端N-乙酰神经氨酸。该酶对肺炎球菌在鼻咽部和支气管粘膜上定居和繁殖可能有一定作用。,2019,-,42,（四）防治原则,除一般防止呼吸传染之措施外，目前已试用荚膜多糖菌苗接种，效果良好。根据药敏试验，可选用敏感的抗生素（青霉素、林可霉素、四环素等）进行治疗。,2019,-,43,（五）肺炎链球菌的药敏试验,K-B法：采用Mueller-Hinton琼脂5羊血培养基。直接菌落悬液法(0.5麦氏单位菌液，在15分钟内接种完)作为接种液。 稀释法：包括琼脂稀释法、肉汤稀释法和Etest法。 培养条件：为35 、5CO2培养2024小时。质控菌株ATCC 49619。,2019,-,44,1.肺炎链球菌的耐药机制,（1）青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白（PBP）发生改变，因为PBP1a/1b和PBP2a/2x/2b是-内酰胺类抗生素的作用靶位，改变后使PBP与青霉素G的结合力下降； 青霉素G耐药肺炎链球菌（PRP）始发现于1967年； 多重耐药肺炎链球菌（MDR）1977年首次在南非爆发流行。,2019,-,45,（2）肺炎链球菌对奎诺酮类抗生素的耐药主要是由该菌产生拓扑酶所致。,2019,-,46,（3）肺炎链球菌对大环内酯类抗生素的耐药机制主要为靶位的改变，即核糖体50S亚单位改变所致，由ersB(erythromycin resistance methylase)基因介导，其耐药表型为MLS，即对大环内酯类、林可酰胺类和链阳霉素B交叉耐药。另一耐药机制为主动外排系统，由mefA基因介导，其耐药表型为M，即对14元环（红霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素、氟红霉素）、15元环（阿奇霉素）大环内酯类低水平耐药，而对16元环大环内酯类（罗他霉素、柱晶白霉素、交沙霉素、麦迪霉素、麦白霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、米欧卡霉素）、林可霉素和链阳霉素B敏感。,2019,-,47,耐青霉素肺炎链球菌的传播主要有两种途径: (1)克隆传播，是耐药菌株从一个国家或地区传播到另一个国家或地区。 (2)基因水平转移，是把耐药基因转移到敏感菌株中。 过度使用抗生素是耐药菌株传播的危险因素。一般认为在抗生素的压力选择下，敏感菌株被杀死，耐药菌株确能生存下来, 或者其他相关链球菌耐药的DNA序列通过基因转移在肺炎链球菌之间传播。 研究发现证实儿童鼻咽部存在“隐匿性耐药克隆株” 。 随着我国儿童-内酰胺类抗生素大量使用, 可以预计不久的将来, 不敏感的肺炎链球菌将会急剧增加。,2019,-,48,2.耐青霉素肺炎链球菌的检测,纸片扩散法对内酰胺类药物结果的准确性不够，用1g/片苯唑西林(OX)筛选肺炎链球菌对青霉素耐药时，当抑菌环直径小于20mm时，就必须做稀释法证实是耐药。,2019,-,49,2019,-,50,3.肺炎链球菌的药敏报告,用1ug/片苯唑西林纸片测试青霉素敏感性，当抑菌环20mm或MIC0.06ug/ml可报告青霉素敏感。并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感而不需要再测定这些药的敏感性。,2019,-,51,肺炎链球菌的药敏报告（续1）,当苯唑西林抑菌圈19mm时应确定青霉素、头孢噻肟或头孢曲松的MICs，因为抑菌环19mm可以发生在青霉素耐药、中介或敏感菌株中。,2019,-,52,肺炎链球菌的药敏报告（续2）,当从血液或脑脊液中分离出肺炎链球菌，应常规报告MICs。测定的药物应包括青霉素、头孢噻肟或头孢曲松、美罗培南和万古霉素。,2019,-,53,（六）肺炎链球菌感染的治疗,青霉素G敏感均可直接用青霉素G进行治疗; 青霉素G中度耐药株可用大剂量青霉素G进行治疗； 如重度耐药可选用三代头孢菌素加万古霉素或利福平进行治疗。,2019,-,54,总 结,1. 肺炎链球菌寄居于人的上呼吸道中，是条件 致病菌； 2.肺炎链球菌对营养要求较高，在含有新鲜血液 的培养基中生长良好； 3.以optochin 试验和胆汁溶菌试验将肺炎链球菌 与其他溶血链球菌相区别； 4. 血清学鉴定特异性高； 5. 要注意对PRP和MDR的检测。,2019,-,55,2019,-,56,二、嗜血杆菌的分离和鉴定,嗜血杆菌属（Haemophilus）属于巴斯德菌科，是专性寄生的苛养性细菌。该属细菌主要寄生在人的咽喉及口腔粘膜，少见于消化道和生殖道。其中流感嗜血杆菌主要引起人类急性化脓感染（急性咽炎、喉炎、气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎、心内膜炎、败血症、脑膜炎等）及严重的继发感染，杜克雷嗜血杆菌是引起软性下疳的病原菌。本属细菌对营养要求严格，生长时需血液中存在的生长因子，人工培养时必须供给新鲜血液才能生长，故名“嗜血杆菌”。,2019,-,57,寄居在人体的嗜血杆菌,流感嗜血杆菌(H.influenzae) 副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae) 溶血嗜血杆菌(H,haemolyticus) 副溶血嗜血杆菌(H.parahaemolyticus) 嗜沫嗜血杆菌(H.aphrophilus) 副嗜沫嗜血杆菌(H. paraphrophilus） 副溶血嗜沫嗜血杆菌(H. paraphrophaemolyticus) 惰性嗜血杆菌(H.segnis) 杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi),2019,-,58,（一） 生物学性状,1. 形态与染色： 嗜血杆菌包括一群无动力、无芽胞的革兰阴性小杆菌，从病灶中新分离的菌株多呈球杆状、双球状或短链状，在陈旧培养物中呈多形性（长杆状或呈长丝状），直径通常不超过1m。,2019,-,59,2019,-,60,2019,-,61,2. 培养特征： 嗜血杆菌对营养要求较高，需氧或兼性厌氧，在补充510%CO2的大气中生长良好，最适生长温度为3537， pH7.67.8，在pH7.6条件下生长最好。 生长需要X因子、V因子或二者之一。X因子是一种对热稳定的血红素及其衍生物，是一种含铁的卟啉，为细菌合成过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶的辅基；V因子是一种对热不稳定的维生素B类物质，是脱氢酶的辅酶，在细胞的呼吸中起递氢的作用。红细胞中富含X 及V因子，但羊血红细胞中含有水解V因子的酶类， V因子依赖性的嗜血杆菌通常不能在含有完整红细胞的羊血琼脂上生长，因而实验室中常用巧克力琼脂培养基上分离培养嗜血杆菌。,2019,-,62,3. 生化反应： 发酵葡萄糖及其他碳水化合物，产酸、少数菌株产气，氧化酶、触酶反应不定，能还原硝酸盐为亚硝酸盐。,2019,-,63,（二） 毒力因子,有荚膜的流感嗜血杆菌根据荚膜多糖抗原可分为a、b、c、d、e、f 6个血清型，其中b型的致病力最强，大部分感染由b血清型引起。 b型荚膜物质为线性聚合物，含有核糖、核糖醇和磷酸，或叫作多聚核糖-核糖醇-磷酸（PRP）。PRP荚膜具有抵抗细胞吞噬及中性粒细胞胞内杀伤的作用，可能是构成b型毒力的重要因素。,2019,-,64,（三） 微生物学检查法,1. 标本采集 根据不同感染，分别采取血液、脑脊液、鼻咽分泌物、痰液、脓汁等标本，采取标本时应注意下列事项。 1）尽量在疾病的早期(用抗生素治疗前)采取标本，采集后应立即送检。 2）鼻咽拭子应在取标本前以肉汤湿润拭子，取样后要防止干燥，并立即送检。 3）对心内膜炎、菌血症、败血症患者采取血液标本，最好在发热期间多部位、多次采样。 4）痰液标本，则首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次，然后将痰块打碎，制成悬液。若痰块太硬，可加入等量10g/L的胰蛋白酶,于37水浴0.51h，将痰块消化后再接种。,2019,-,65,2. 直接涂片检查 痰、脓汁、鼻分泌物或溃疡性性病（软性下疳）分泌物可直接涂片，脑脊液须离心后取沉淀物涂片，革兰染色后镜检。查到革兰阴性短小杆菌或多形态杆菌，结合临床症状，可做初步诊断。流感嗜血杆菌还可作荚膜肿胀试验测定其血清型。,2019,-,66,3. 嗜血杆菌的分离培养 取标本在巧克力琼脂平板上三区划线接种，以保证长出单个菌落，置35，在510%CO2的大气中培养24h。,2019,-,67,(1 )及时处理标本,及时将标本接种到适当的培养基上是提高嗜血杆菌分离率的前提。因为，嗜血杆菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，标本在外界环境中暴露时间过长，其存活率降低，不及时接种适当培养基是导致嗜血杆菌分离率低的主要原因。,2019,-,68,(2)如何提高嗜血杆菌的分离率？,嗜血杆菌分离培养基以巧克力琼脂最好，其中在兔血巧克力琼脂上的生长状况好于羊血巧克力琼脂，如兔血来源困难也可用羊血代替，但需补充一定量的V因子（1.5mg/L NAD或2%鲜酵母浸液）。在培养基中加入2鲜酵母浸液和50鲜牛肉浸液可使菌落明显增大。 呼吸道标本中的嗜血杆菌在初代培养时，受到革兰阳性细菌的抑制（营养竞争及菌素作用），菌落细小不易与其他细菌相区别，这是造成嗜血杆菌分离率低的直接原因。在培养基中加入3050mg/L的万古霉素或300mg/L杆菌肽（或其他革兰阳性细菌抑制剂），可提高嗜血杆菌分离率。原因是，当在培养基中加入万古霉素后，抑制了革兰阳性细菌的生长，增加了对嗜血杆菌的选择性，嗜血杆菌在加万古霉素的培养基上，菌落生长较大，极易识别，从而提高了嗜血杆菌的分离率。,2019,-,69,1)不同血源对嗜血杆菌的影响,_ 血源 GI P _ 羊血 4.3+-1.3 兔血 7.03+-1.45 0.001 马血 6.88+-1.53 0.001 _,2019,-,70,表1 不同营养培养基上的GI值比较（n =10）,_ 培养基 GI（xs） t（P值） _ A 4.1851.161 B 6.2861.572 10.15（0.001） AS 2.2590.734 BS 5.3521.538 10.56（0.001） AR 4.1661.345 BR 7.0061.581 13.58（0.001） _ A：脑心琼脂加入X、V因子； B：A加入50%鲜牛肉浸液，加入2%的滤菌鲜酵母浸液； AS：脑心琼脂加入5%脱纤维蛋白羊血；BS：AS加入50%鲜牛肉浸液，加入2%的滤菌鲜酵母浸液； AR：脑心琼脂加入5%脱纤维蛋白兔血；BR：AR加入50%鲜牛肉浸液，加入2%的滤菌鲜酵母浸液.,2019,-,71,2)不 同 温 度 制 备 的 巧 克 力 平 皿 对 菌 落 生 长 的 影 响,_ 平 皿 颜 色 菌 落 大 小 _ 深 咖 啡 色 0.8-1.5mm 咖 啡 色 带 红 0.5-0.8mm 浅 咖 啡 带 红 0.5或0.5mm _,2019,-,72,(3)嗜血杆菌的菌落形态,2019,-,73,流感嗜血杆菌,2019,-,74,流感嗜血杆菌,2019,-,75,副流感嗜血杆菌,2019,-,76,2019,-,77,副流感嗜血杆菌,2019,-,78,(4)流行病学资料,2019,-,79,表2 130名儿童咽部嗜血杆菌分离情况 _ 菌 名 男 童 女 童 合 计 构成比（%） _ 流感嗜血杆菌 22（32.4） 20（29.4） 42（32.3） 18.3 副流感嗜血杆菌 79（83.8） 65（80.6） 144（82.3） 62.6 溶血嗜血杆菌 3（4.4） 2（3.2） 5（3.8） 2.2 副溶血嗜血杆菌 21（30.9） 18（29.0） 39（28.5） 16.9 _ 合 计 125（97.1） 105（93.5） 230（95.4） 100.0 _ （）为检出率%。,2019,-,80,表3 老年人(121名)与儿童(165名)咽部嗜血杆菌分布调查,_ 菌 名 分离株数 构成比（%） 检出率（%） 老年人 儿童 老年人 儿童 老年人 儿童 _ 流感嗜血杆菌 3 36 2.9 15.4 2.5 21.8 溶血嗜血杆菌 1 7 1.0 3.0 0.8 4.2 副流感嗜血杆菌 74 145 73.3 61.9 61.2 87.9 副溶血嗜血杆菌 23 46 22.8 19.7 19.0 27.9 _ 合 计 101 234 100 100 83.5 98.8 _,2019,-,81,(5)抑制剂对嗜血杆菌分离率的影响,2019,-,82,表4 325份标本中嗜血杆菌分离率比较,_ 菌 种 choc choc-V X2 P值 分离株数（%） 分离株数（%） _ 流感嗜血杆菌 3（0.9） 17（5.2） 12.07 0.001 副流感嗜血杆菌 44（13.5） 136（51.5） 88.17 0.001 副溶血嗜血杆菌 54（16.6） 95（29.2） 39.09 0.001 溶血嗜血杆菌 3（0.9） 3（0.9） _ 合 计 104（32.0） 251（77.2） 141.24 0.001 _,2019,-,83,4. 嗜血杆菌的鉴定 通过检测嗜血杆菌有无溶血性及其对X、V因子的需求情况，即可将嗜血杆菌属中的流感嗜血杆菌(H.influenzae)、副流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌(H,haemolyticus)、副溶血嗜血杆菌(H.parahaemolyticus)、嗜沫嗜血杆菌(H.aegypticus)及杜克雷嗜血杆菌(H.ducreyi)加以区别。,2019,-,84,(1)初级鉴定,_ 血琼脂卫星 琼脂卫星 溶血 _ 流感嗜血杆菌 + - - 溶血嗜血杆菌 + - + 其他 + + _,2019,-,85,(2)二级鉴定,_ X因子 V因字 溶血 _ 流感嗜血杆菌 + + - 溶血嗜血杆菌 + + + 杜克嗜血杆菌 + - - 副流感嗜血杆菌 - + - 副溶血嗜血杆菌 - + + _,2019,-,86,(3)三级鉴定,生化反应 VITEK-NHI API NH 注：若是脑脊液标本应作血清分群,2019,-,87,表5 嗜血杆菌属主要菌种鉴别,_ 菌 名 X因子 V因子 溶 血 CO2 触酶 G+C(mol%) _ 流感嗜血杆菌 + + + 39 埃及嗜血杆菌 + + + 39 溶血嗜血杆菌 + + + + 39 嗜沫嗜血杆菌* + 42 杜克雷嗜血 + （+） + 38 副溶血嗜血杆菌 + + + 4041 副流感嗜血杆菌 + D D 4041 副嗜沫嗜血杆菌 + + 42 _ *常见在次代培养不需要血红素; D.不同结果.,2019,-,88,5.卫星试验原理,有溶血性的细菌在羊血琼脂培养基上生长时可破坏红细胞释放出血红素(即X因子)和维生素B类物质(即V因子)，从而促进了流感嗜血杆菌的生长；金黄色葡萄球菌在生长过程中能合成V因子释放于培养基中，当嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌一起培养时，V因子会促进嗜血杆菌的生长，出现靠近葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较大，而远离葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较小的现象称为“卫星现象”；在不含血红素琼脂平板上进行的卫星试验，称为“琼脂卫星试验”。,2019,-,89,2019,-,90,（1）卫星试验,1)点种法： 挑取可疑菌落密涂划种于血琼脂平板（卫星试验）和脑心琼脂平板（琼脂卫星试验）上，再将金黄色葡萄球菌点种其上，在510%CO2的大气中，35培养24h。如在金葡菌菌落邻近处被检菌的菌落较大，远离金葡菌菌落处的菌落小或不生长，即“卫星”试验阳性。,2019,-,91,点种法卫星试验结果,2019,-,92,2019,-,93,2019,-,94,2019,-,95,2)纸片法,取0.51个麦氏单位的被检菌菌液，涂抹于脑心琼脂平板上，贴X、V和X+V因子纸片（纸片间距离大于5cm），纸片周围有被检菌生长即为阳性（判断同卫星试验）。,2019,-,96,纸片法卫星试验结果,2019,-,97,2019,-,98,3)纸片法卫星试验注意事项,A：在脑心琼脂平板上贴X、V和X+V因子纸片时纸片间距离应大于5cm（因为V因子分子量小，扩散距离远），否则会出现X因子假阳性结果。,2019,-,99,2019,-,100,2019,-,101,B：如果出现（X+V）纸片阴性结果，应考虑以下几个问题（1）细菌死亡；（2）培养基营养缺乏；（3）纸片失效。,2019,-,102,2019,-,103,表6 不同琼脂上卫星试验结果比较 _ MH琼脂（株） 营养琼脂（株） 脑心琼脂（株）_ 菌 名（株数） X V X+V 琼卫* X V X+V 琼卫 X V X+V 琼卫 _ 流感嗜血杆菌（42） 0 0 40 0 0 0 42 0 0 0 42 0 副流感嗜血杆菌（144） 0 115 121 120 0 137 142 141 0 140 144 144 溶血嗜血杆菌（5） 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 5 0 副溶血嗜血杆菌（39） 0 29 31 31 0 36 38 38 0 37 39 39 _ 合 计（230） 0 144 196 151 0 173 227 179 0 177 230 183 阳性率（%） 0 78.7 85.2 82.5 0 94.5 98.7 97.8 0 96.7 100 100 _,2019,-,104,试验结果表明，在MH琼脂、营养琼脂和脑心琼脂上进行琼脂卫星试验（V因子的需求试验），结果以脑心琼脂最好，营养琼脂次之，比较脑心琼脂的阳性率为95.1%，差异无显著性（P0.05）；MH琼脂比较脑心琼脂的阳性率仅为74.9%，既使培养48h阳性率也只有82.5%，差异较明显（P0.01）。,2019,-,105,用MH琼脂进行琼脂卫星试验，由于假阴性结果导致流感嗜血杆菌的分离率升高，因此要得到准确的鉴定结果，应该用脑心琼脂进行琼脂卫星试验或X、V因子（纸片法）需求试验，24h看不清结果时，应在48h复读一次，可将阳性率提高近10%，必要时可借助放大镜进行观察。,2019,-,106,点种法琼脂卫星试验结果与V因子纸片法试验结果一致，用葡萄球菌斑点法检测嗜血杆菌对V因子的依赖性结果可靠，可解决V因子纸片来源困难的问题。,2019,-,107,不同菌种对嗜血杆菌的卫星试验结果 40种(共48株)不同菌种中的14种（20株）葡萄球菌及肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、产吲哚黄杆菌和大肠埃希菌均有较好的试验结果，阳性率较为一致；其他菌种的试验结果有所不同，48h的阳性率明显高于24h；溶血的菌种在血琼脂平板上的卫星试验结果好于不溶血的菌种；阳性球菌在羊血琼脂平板上的卫星试验结果好于琼脂平板，肠杆菌的卫星试验结果好于绿脓假单胞菌和酵母样真菌。,2019,-,108,2019,-,109,（2）溶血试验,用羊血琼脂点种金黄色葡萄球菌的方法检测嗜血杆菌溶血性结果，与直接兔血琼脂接种法结果一致。在兔血来源困难的地区，完全可以用羊血琼脂点种金黄色葡萄球菌的方法检测嗜血杆菌溶血性。510%的CO2对X、V因子需求试验及嗜血杆菌溶血性检测试验结果有影响，如果没有CO2孵箱试验应在烛缸中进行。,2019,-,110,2019,-,111,表7 嗜血杆菌溶血性的检测结果 _ 菌 名（株数） 兔血琼脂(普通孵箱) 兔血琼脂(8%CO2孵箱) 羊血琼脂(普通孵箱) 羊血琼脂(8%CO2孵箱) 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h _ 溶血嗜血杆菌（5） 5 5 5 5 3 4 5 5 副溶血嗜血杆菌（39） 39 39 39 39 31 36 39 39 _ 合 计（44） 44 44 44 44 34 40 44 44 _,2019,-,112,（3）生化反应,通过对嗜血杆菌的糖发酵试验、吲哚试验、尿素酶和鸟氨酸脱氢酶等试验，可鉴定到种和进行生物分型。,2019,-,113,表8 流感嗜血杆菌生物型鉴别,_ 生物型 靛基质 尿素 鸟氨酸脱氢酶 _ + + + + + + + + + + + + _,2019,-,114,表9 副流感嗜血杆菌生物型鉴别,_ 生物型 靛基质 尿素 鸟氨酸脱氢酶 _ + + + + + + + + + + + + _,2019,-,115,（4）血清学试验,流感嗜血杆菌有三种主要抗原成分，型特异性荚膜多糖抗原（M抗原）、型特异性菌体抗原（S抗原）和种特异性菌体抗原（R抗原）。有荚膜的流感嗜血杆菌含有荚膜多糖抗原，具有型特异性，应用型特异性免疫血清作荚膜肿胀试验，可将有荚膜的流感嗜血杆菌分为a、b、c、d、e、f 6个血清型，其中b血清型致病力最强，f型次之。,2019,-,116,1）直接荧光抗体法,将标本或培养物直接涂片，固定后用标记荧光素的流感嗜血杆菌抗血清染色，30min后，洗去多余血清，用荧光显微镜检查。此法可迅速得出结果，为早期诊断的重要方法。,2019,-,117,2）荚膜肿胀试验,取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量美蓝液混合后加盖片，室温10min后，用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。此法可直接检查标本中的细菌，作早期诊断。,2019,-,118,3）沉淀试验,用流感嗜血杆菌抗血清与脑脊液上清液或细菌培养物的上清液做环状沉淀试验。此试验可做菌型鉴定。,2019,-,119,4）凝集试验,包括血清凝集试验、SPA协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。,2019,-,120,（三） 耐药性检测,2019,-,121,1.嗜血杆菌主要耐药机制,1. 产生质粒介导的-内酰胺酶； 2. 细胞壁上青霉素结合蛋白的改变； 3. 细胞膜对抗菌剂通透性的改变； 4. 合成氯霉素乙酰基转移酶（CAT）。,2019,-,122,2.嗜血杆菌的耐药性检测,从血液、脑脊液或会厌炎和面部蜂窝组织炎的患者分离到的流感嗜血杆菌，常规只应报告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉素的药敏结果。 氨苄西林的药敏结果可预测阿莫西林的敏感性，可用直接内酰胺酶试验快速测试氨苄西林和阿莫西林的耐药性。,2019,-,123,嗜血杆菌药敏试验专用培养基（HTM） M-H琼脂粉； 15g/ml B-NAD; 15 g/ml牛羟基血红素； pH7.27.4; NCCLS不推荐用巧克力琼脂作嗜血杆菌药敏试验。,2019,-,124,(1)-内酰胺酶测定,头孢硝基噻吩（Nitrocefin）纸片法: 用无菌蒸馏水将Nitrocefin纸片浸湿，挑取待检菌落涂抹在Nitrocefin纸片上，10min内变红者为阳性。 内酰胺酶试验阴性不能排除其他耐药机制引起的耐药。,2019,-,125,2019,-,126,(2) AMP耐药性检测,1）纸片扩散法（K-B）； 2）琼脂稀释法； 3）Etest法. 用HTM琼脂培养基。质控菌株为 流感嗜血杆菌ATCC49247或ATCC49766。,2019,-,127,2019,-,128,表10 流感嗜血杆菌抑菌圈的解释, 抗生素纸片 含量（g） 抑菌圈直经（mm） R I S _ 氨苄西林 10 = 22 头孢克罗 30 = 20 头孢呋肟 30 = 20 环丙沙星 5 = 21 红霉素 15 = 23 强力霉素 30 = 16 氯霉素 30 = 29 TMP/SMZ 1.25/23.75 = 16 _,2019,-,129,表11