植物总DNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

植物总DNA的提取 及琼脂糖凝胶电泳检测,制作人：刘红梅,植物基因组 DNA的提取 琼脂糖凝胶电泳检测,脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。,背景知识,核酸的存在形式,DNA为白色类似石棉样的纤维状物， RNA的纯品呈白色粉末或结晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。,核酸的理化性质,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,基本过程,机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。,细胞破碎,SDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。,DNA提取,蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖 提取液中加1PVP。,DNA纯化（去杂质）,实验材料 新鲜蔬菜叶片(去叶脉) 试剂 2CTAB抽提液 TE 缓冲液(pH=8.0) 氯仿：异戊醇(24:1),材料与试剂,离心机 水浴锅 研钵 微量移液器,仪器用具,移液器量程的选择,1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。 2将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于65水浴中保温 20min，其间颠倒混匀23次。破碎细胞 3. 12000r/min 离心 5min，取上清液700L转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心 5min。抽提去蛋白 4将上清液移入新的1.5mL离心管内，加 600L异丙醇。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。沉淀核酸 512000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于20L TE 缓冲液待测。,操作步骤,1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀； 2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（25），尽可能选取幼嫩的材料； 3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难； 4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。,注意事项,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。,电泳原理,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,仪器和试剂,仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等,Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）,常用电泳缓冲液,电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。 作用： 增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。,上样缓冲液,溴化乙锭（EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。,核酸染色剂,注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。,DNA分子量标准,不同种类DNA Marker,1.凝胶制备 制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60 时，加入 EB 至终浓度 0.5g/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。 2.加样 取10l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。 3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。 4.观察拍照,四、操作步骤,紫外仪上