阿维拉霉素核糖体工程技术选育方案_第1页
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文档简介

LK171 核糖体工程技术选育菌种实验方案1、简介核糖体工程技术,即对核糖体或RNA聚合酶进行改造或修饰。通过向核糖体或RNA聚合酶引入特定的抗生素抗性突变,激活次级代谢产物合成是核糖体工程研究和应用最为广泛的一个领域。 相比经典的微生物育种方法,其可通过抗性突变技术定向筛选次级代谢产物合成能力提高的突变菌株,是一种相对较为理性的育种方法。这种技术具有很多优点,包括获得突变菌株的过程简单、获得高产菌株的几率高、应用时不需要了解微生物的背景等等。常用于获得抗性突变菌株的抗生素有链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamicin)、巴龙霉素(paromomycin)、硫链丝(thiostrepton)等,其中链霉素因其正突变率高,次级代谢产物产量提高显著,与核糖体具有较为明确的结合位点,在核糖体工程技术育种中应用最多(傅路, 裘娟萍, 2012)。目前链霉素抗性突变所涉及的 rpsl基因是分析突变菌株次级代谢产物过量表达的主要方向(谢庶洁等, 2009; 蔡成平等, 2012),高浓度链霉素可提高负责编码核糖体30S亚基中S12蛋白的rpsl基因突变率。rpsl基因突变引起氨基酸的变化会导致核糖体结构发生改变,影响微生物次级代谢产物的调控途径,进而激发微生物的生物合成潜能。2、 培养基及试剂2.1 生物法初筛指示菌-枯草芽胞杆菌2.2 硫酸链霉素 2.3 培养基种子培养基(g/L): 常用配方。摇瓶发酵培养基 (g/L): 常用配方。初筛检定培养基(g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨10.0,NaCl 5.0,琼脂20.0,pH 7.07.2。 3、 实验方法3.1 孢子悬液制作菌株孢子悬液涂布在高氏平板中,28 培养 710 d。用0.85%的无菌生理盐水刮下孢子制成孢子悬液(3107个/mL),放入装有玻璃珠的三角烧瓶中旋涡振荡30 min,无菌脱脂棉过滤. 3.2 链霉素抗性突变菌株的获得将经过 0.22 m膜过滤除菌的链霉素母液(20mg/mL)加入到发酵培养基平板中配成不同浓度梯度(0,300, 400, 500, 600, 700和 800 g/mL)的抗性平板。将菌株孢子悬液涂布在不同链霉素浓度的固体培养基上,28 培养7 d,观察生长情况,确定最大筛选压力,计算致死率。 3.3 摇瓶发酵用无菌牙签挑取抗性平板(有生长菌落的最高浓度链霉素平板)上生长的单菌落在抗性平板中进行划线分离,28 培养10 d。摇瓶初筛:用接种铲取1 cm1 cm抗性平板上的链霉素抗性菌株的菌种块,接入装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中(以50/250表示),28 、160 r/min条件下培养10 d。摇瓶复筛:将24 h种子液以10%的接种量,接入发酵培养基,装量 50/250 mL 三角瓶,置摇床160 r/min,28 培养10 d。初筛、复筛摇瓶发酵液处理:将发酵液在5 000 r/min的条件下离心10 min,得到菌丝体。然后以菌丝体甲醇(体积)为13的比例进行37 浸提,得浸提液4 保存,备用检测。 3.4 高产阿维拉霉素的链霉素抗性突变菌株筛选初筛:采用药敏试纸法初筛,将药敏纸片灭菌(采用干法灭菌, 烘箱150 , 2 h),在纸片上滴加等量的发酵浸提液,每个平板做3个平行,37 培养约16 h,十字交叉法测定抑菌圈的直径。抑菌圈直径大于对照菌株的抑菌圈直径的为正变菌株,计算正变率。正变率(%)=突变菌株抑菌圈直径大于出发菌株抑菌圈直径菌株数/该批次筛选的所有突变菌株100 复筛: 采用高效液相色谱法测定阿维拉霉素含量。 3.5 高产阿维拉霉素的链霉素抗性突变菌株稳定性实验将复筛得到

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