shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.doc

shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响作者：杨义明刘预涂植光陈亚芹刘靳波【摘要】目的：应用RNA干扰技术抑制COX2基因，观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法：构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNACOX2，转染肝癌细胞HepG2，用RTPCR和WesternBlot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX2的抑制效应，MTT法检测对HepG2细胞生长的影响.结果：与未转染组相比，pshRNACOX2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX2mRNA及蛋白表达，抑制率分别为69.9和50.3；并可抑制HepG2细胞生长，72h后有统计学差异(P<；0.05).结论：pshRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达，从而抑制肿瘤细胞增殖.【关键词】RNA干扰；重组表达载体；环氧化酶2；肝肿瘤【Abstract】AIM:Toinvestigatetheeffectsofinhibitionofcyclooxygenase2（COX2）withRNAinterference(RNAi)onthegrowthofhepatocellularcarcinomaHepG2cells.METHODS:TheeukaryoticexpressionplasmidofshorthairpinRNA(shRNA)targetingCOX2gene(pshRNACOX2)wasconstructedandtransfectedintohepatocellularcarcinomaHepG2cells；theexpressionsofCOX2mRNAandproteinweredetectedwithreversetranscriptionalpolymerasechainreaction(RTPCR)andWesternBlotassay,respectively.ThegrowthofHepG2cellswasdetectedbyMTT.RESULTS:Comparedwithuntransfectedgroup,recombinantexpressionvectorpshRNACOX2resultedinthereductionofCOX2mRNAandproteinby69.9%and50.3%respectively,andthegrowthofHepG2cellswassignificantlyinhibitedafter72h(P<；0.05).CONCLUSION:RecombinantexpressionvectorpshRNACOX2cansignificantlyinhibittheexpressionofCOX2gene,andsuppressthegrowthoftumorcells.【Keywords】RNAinterference；recombinantexpressionvcectors；cyclooxygenase2；liverneoplasms0引言环氧化酶（cyclooxygenase,COX）是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶，包括COX1和COX2两种同工异构体.近年来研究表明，许多肿瘤，如结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肺癌，肝癌等COX2呈高表达状态，并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用1-6.研究表明选择性COX2抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，而成为肿瘤基因治疗的靶点.我们采用RNA干扰(RNAi)技术抑制COX2基因表达，观察对肝癌细胞生长的影响，为利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗途径提供实验依据.1材料和方法1.1材料真核表达质粒pGenesil1购于武汉晶赛公司，含有人鼠人共用U6启动子和编码绿色荧光蛋白的报告基因.COX2靶基因序列：AACATGGAATTACCCAGTTTG.shRNA转录DNA模板：正向链为5GATCCCATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGTCGAA3,反向链为5AGCTTGTCGACAAAAACATGGAATTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGTAATTCCATGG3，以上片段由上海生工公司合成.经Blast与现有人类基因无同源性的序列：5GACTTCATAAGGCGCATGC3作为阴性对照，称为HK（武汉晶赛合成）.肝癌细胞株HepG2,大肠杆菌JM109由本实验室保存.RPMI1640（Hyclone），新生小牛血清（杭州四季青公司产品），阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen)，Hind,BamH,RTPCR试剂（大连宝生物公司产品），COX2一抗（SantaCruz产品），COX2二抗,DAB显色试剂（北京中杉公司产品）.肝癌细胞株HepG2用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基于37，50mL/LCO2培养箱常规培养，待细胞铺满瓶底80左右时传代.1.2方法将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释，等摩尔混合.945min，缓慢降至室温形成互补双链.Hind，BamH双酶切质粒pGenesil1，凝胶回收大片段线性DNA，T4连接酶4过夜连接，转化感受态大肠杆菌JM109,铺含卡那霉素的LB抗性板培养16h，挑取菌落,增菌,提取质粒,酶切鉴定并测序确认.实验分为3组：未转染细胞HepG2组，pshRNACOX2组，阴性对照HK组.用2.5g/L的胰酶常规消化对数期生长的细胞，稀释成1108/L,每孔2mL，接种于六孔培养板，待细胞铺满80左右时转染.首先用无血清无双抗RPMI1640培养基洗涤2遍.质粒4g，加无血清无双抗RPMI1640培养基250L，脂质体10L，加无血清无双抗RPMI1640培养基250L，静置5min,将二者轻轻混匀，静置20min，加六孔入培养板常规培养，46h换生长培养液，24h转种培养瓶.G418筛选：初始终浓度800mg/L,4d左右大部分未转染细胞将被处死，维持终浓度400mg/L，23wk收集细胞，供RTPCR和WesternBlot分析.1.2.1肿瘤细胞中COX2mRNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞，冷PBS洗涤2遍，按试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录成cDNA.PCR：COX2引物序列：P1：5TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3,P2:5AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3,扩增片段长度304bp.内参actin引物序列：P1：5GGGACCTGACTGACTACCTC3P2：5CGTCATACTCCTGCTTCCTG3，扩增片段长度543bp.PCR循环：9440s,5530s,7250s,38个循环.WesternBlot主要步骤：用RIPA（含PMSF蛋白酶抑制剂）细胞裂解液提取总蛋白，蛋白变性上样，行100g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳，转NC膜，用50g/L脱脂奶粉的TBST封闭2h,加COX2多抗（1200），4过夜，TBST洗涤3次（10min/次），二抗（15000）室温2h，洗涤3次，每次10min，DAB显色.数码照相.1.2.2MTT实验检测细胞生长情况用2.5g/L胰酶将对数期生长细胞消化下来，稀释成1108个/L，转种96孔板，每孔200L，置于37,50mL/LCO2培养箱培养，分别于24,48,72,96,168h时，每孔加终浓度为5g/LMTT200L，继续培养3h，终止反应.弃去上清液，加DMSO200L/孔，充分振荡10min，酶标仪（波长570nm）测定吸光度A值.每组3个复孔，取其平均吸光度A值，比较个组细胞生长情况.统计学分析：RTPCR和WesternBlot结果用Quantityone软件分析灰度值，计算抑制率.MTT结果采用均数标准差表示，组间均数比较用单因素方差分析，P<；0.05为有统计学意义.2结果2.1psRNACOX2重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落，增菌并提取质粒，Hind,BamH双酶切切出400bp左右的DNA片断，经测序插入片断序列正确（图1）.pshRNACOX2重组质粒转染48h时，转染率为50%左右（图2）.2.2shRNACOX2重组质粒对COX2表达的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2重组质粒对actin无抑制作用，而对靶基因COX2mRNA有明显的抑制作用，抑制率为69.9，未转染细胞与阴性对照之间没有差异（图3A）.与未转染细胞与未转染细胞相比，actin及阴性对照HK几乎无变化，而转染pshRNACOX2质粒的细胞COX2蛋白表达水平明显下降，抑制率为50.3（图3B）.2.3pshRNACOX2重组质粒转染对细胞增值的影响与未转染细胞相比，pshRNACOX2重组质粒转染后，24,48h时吸光度A值变化不明显，而72h后吸光度A值明显下降.说明72h后细胞增殖开始得到抑制.转染阴性对照质粒HK的细胞与未进行转染的HepG2细胞相比，转染后24,48,72,96,168h细胞生长和增殖均未受到影响（图4）.3讨论RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是通过双链RNA介导同源性mRNA的特异性降解，导致转录后基因沉默，作为一种高效、特异的基因调节技术，目前已经成为研究基因功能的有力工具.RNAi现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了新的方法.利用RNAi技术抑制hTERT,Survivin的表达，可以起到抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞调亡，达到治疗肿瘤的目的7-8，显示出RNAi技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜力.小干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）可在哺乳细胞中诱导特异性基因沉默.siRNA可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径合成，但化学合成成本昂贵，内切酶可导致非特异性效应，且有siRNA瞬时转染介导的沉默效应持续时间短的缺点.如果将转录siRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游，可在细胞内持续转录产生小RNA分子，通过自身折叠形成发夹样（hairpin）结构，即内源性siRNA,可与靶基因结合降解mRNA，实现靶基因的持续抑制，可克服上述缺点.我们将靶向抑制COX2基因的siRNA的DNA转录模板插入到质粒pGenesil2的U6启动子下游，转录的mRNA通过自身折叠形成发夹样结构（shRNA）,经Dicer酶切割形成siRNA,供探讨其对靶基因COX2抑制效应.我们构建的靶向抑制COX2基因的重组表达质粒转染肝癌细胞HepG2后COX2基因及蛋白显著下调，抑制率分别为69.9和50.3，而对内参基因actin没有影响，提示利用RNAi技术抑制COX2基因表达是切实可行的.MTT实验显示，pshRNACOX2重组质粒转染HepG2细胞72h后，细胞增殖明显减慢，与未转染细胞组相比有显著性差异（P<；0.05），并可持续至少1wk.本研究表明，利用RNAi技术可抑制COX2表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，为高表达COX2基因的恶性肿瘤基因治疗新途径提供了实验依据.基金项目：重庆市自然科学基金项目（2006BB5271）【参考文献】1SinghB,BerryJA,ShoherA,etal.COX2overexpressionincreasesmotilityandinvasionofbreastcancercellsJ.IntJOncol,2005,26(5):1393-1399.2郭贵龙，姚榛祥，吴坚.环氧化酶2基因在人乳腺癌中的表达及临床意义J.中华医学杂志,2003，83（19）：1661-1664.3LuS,YuG,ZhuY,etal.Cyclooxygenase2overexpressioninMCF10Fhumanbreastepithelialcellsinhibitsproliferation,apoptosisanddifferentiation,andcausespartialtransformationJ.IntJCancer,2005,116(6):847-852.4YuanA,YuCJ,ShunCT,etal.Totalcyclooxygenase2mRNAlevelstumorangiogenesisandprognosisinnonsmallcelllungcancerpatientsJ.IntJCancer,2005,115(4):545-555.5WangW,BerghA,DamberJE.Cycloogenase2expressioncorrelateswithlocalchronicinflammationandtumorneovascularizationinhumanprostatecancerJ.ClinCancerRes,2005,11(9):3250-3256.6Iwamot