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shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.docshRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响.doc -- 5 元

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shRNA抑制COX2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响作者杨义明刘预涂植光陈亚芹刘靳波【摘要】目的应用RNA干扰技术抑制COX2基因,观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法构建靶向抑制COX2基因表达的短发夹双链RNAshRNA真核表达载pshRNACOX2,转染肝癌细胞HepG2,用RTPCR和WesternBlot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX2的抑制效应,MTT法检测对HepG2细胞生长的影响.结果与未转染组相比,pshRNACOX2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX2mRNA及蛋白表达,抑制率分别为69.9%和50.3%并可抑制HepG2细胞生长,72h后有统计学差异Plt0.05.结论pshRNACOX2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX2基因表达,从而抑制肿瘤细胞增殖.【关键词】RNA干扰重组表达载体环氧化酶2肝肿瘤【Abstract】AIMToinvestigatetheeffectsofinhibitionofcyclooxygenase2(COX2)withRNAinterferenceRNAionthegrowthofhepatocellularcarcinomaHepG2cells.METHODSTheeukaryoticexpressionplasmidofshorthairpinRNAshRNAtargetingCOX2genepshRNACOX2wasconstructedandtransfectedintohepatocellularcarcinomaHepG2cellstheexpressionsofCOX2mRNAandproteinweredetectedwithreversetranscriptionalpolymerasechainreactionRTPCRandWesternBlotassay,respectively.ThegrowthofHepG2cellswasdetectedbyMTT.RESULTSComparedwithuntransfectedgroup,recombinantexpressionvectorpshRNACOX2resultedinthereductionofCOX2mRNAandproteinby69.9and50.3respectively,andthegrowthofHepG2cellswassignificantlyinhibitedafter72hPlt0.05.CONCLUSIONRecombinantexpressionvectorpshRNACOX2cansignificantlyinhibittheexpressionofCOX2gene,andsuppressthegrowthoftumorcells.【Keywords】RNAinterferencerecombinantexpressionvcectorscyclooxygenase2liverneoplasms0引言环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶,包括COX1和COX2两种同工异构体.近年来研究表明,许多肿瘤,如结肠癌,乳腺癌,前列腺癌,肺癌,肝癌等COX2呈高表达状态,并在肿瘤的发生、发展及转移中起重要的作用[16].研究表明选择性COX2抑制剂可以抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞调亡,而成为肿瘤基因治疗的靶点.我们采用RNA干扰RNAi技术抑制COX2基因表达,观察对肝癌细胞生长的影响,为利用RNA干扰技术作为肿瘤基因治疗途径提供实验依据.1材料和方法1.1材料真核表达质粒pGenesil1购于武汉晶赛公司,含有人鼠人共用U6启动子和编码绿色荧光蛋白的报告基因.COX2靶基因序列AACATGGAATTACCCAGTTTG.shRNA转录DNA模板正向链为5′GATCCCATGGAATTACCCAGTTTGTTCAAGAGACAAACTGGGTAATTCCATGTTTTTGTCGAA3′,反向链为5′AGCTTGTCGACAAAAACATGGAATTACCCAGTTTGTCTCTTGAACAAACTGGGTAATTCCATGG3′,以上片段由上海生工公司合成.经Blast与现有人类基因无同源性的序列5′GACTTCATAAGGCGCATGC3′作为阴性对照,称为HK(武汉晶赛合成).肝癌细胞株HepG2,大肠杆菌JM109由本实验室保存.RPMI1640(Hyclone),新生小牛血清(杭州四季青公司产品),阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000Invitrogen,HindⅢ,BamHⅠ,RTPCR试剂(大连宝生物公司产品),COX2一抗(SantaCruz产品),COX2二抗,DAB显色试剂(北京中杉公司产品).肝癌细胞株HepG2用含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养基于37℃,50mL/LCO2培养箱常规培养,待细胞铺满瓶底80%左右时传代.1.2方法将合成的单链DNA片段用退火缓冲液稀释,等摩尔混合.94℃5min,缓慢降至室温形成互补双链.HindⅢ,BamHⅠ双酶切质粒pGenesil1,凝胶回收大片段线性DNA,T4连接酶4℃过夜连接,转化感受态大肠杆菌JM109,铺含卡那霉素的LB抗性板培养16h,挑取菌落,增菌,提取质粒,酶切鉴定并测序确认.实验分为3组未转染细胞HepG2组,pshRNACOX2组,阴性对照HK组.用2.5g/L的胰酶常规消化对数期生长的细胞,稀释成1108/L,每孔2mL,接种于六孔培养板,待细胞铺满80%左右时转染.首先用无血清无双抗RPMI1640培养基洗涤2遍.质粒4μg,加无血清无双抗RPMI1640培养基250μL,脂质体10μL,加无血清无双抗RPMI1640培养基250μL,静置5min,将二者轻轻混匀,静置20min,加六孔入培养板常规培养,4~6h换生长培养液,24h转种培养瓶.G418筛选初始终浓度800mg/L,4d左右大部分未转染细胞将被处死,维持终浓度400mg/L,2~3wk收集细胞,供RTPCR和WesternBlot分析.1.2.1肿瘤细胞中COX2mRNA和蛋白的检测常规胰酶消化收集细胞,冷PBS洗涤2遍,按试剂盒说明书提取细胞总RNA,逆转录成cDNA.PCRCOX2引物序列P15′TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT3′,P25′AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT3′,扩增片段长度304bp.内参βactin引物序列P15′GGGACCTGACTGACTACCTC3′P25′CGTCATACTCCTGCTTCCTG3′,扩增片段长度543bp.PCR循环94℃40s,55℃30s,72℃50s,38个循环.WesternBlot主要步骤用RIPA(含PMSF蛋白酶抑制剂)细胞裂解液提取总蛋白,蛋白变性上样,行100g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳,转NC膜,用50g/L脱脂奶粉的TBST封闭2h,加COX2多抗(1∶200),4℃过夜,TBST洗涤3次(10min/次),二抗(1∶5000)室温2h,洗涤3次,每次10min,DAB显色.数码照相.1.2.2MTT实验检测细胞生长情况用2.5g/L胰酶将对数期生长细胞消化下来,稀释成1108个/L,转种96孔板,每孔200μL,置于37℃,50mL/LCO2培养箱培养,分别于24,48,72,96,168h时,每孔加终浓度为5g/LMTT200μL,继续培养3h,终止反应.弃去上清液,加DMSO200μL/孔,充分振荡10min,酶标仪(波长570nm)测定吸光度A值.每组3个复孔,取其平均吸光度A值,比较个组细胞生长情况.统计学分析RTPCR和WesternBlot结果用Quantityone软件分析灰度值,计算抑制率.MTT结果采用均数±标准差表示,组间均数比较用单因素方差分析,Plt0.05为有统计学意义.2结果2.1psRNACOX2重组质粒测序和转染挑取卡那霉素抗性板上生长的菌落,增菌并提取质粒,HindⅢ,BamHⅠ双酶切切出400bp左右的DNA片断,经测序插入片断序列正确(图1).pshRNACOX2重组质粒转染48h时,转染率为50左右(图2).2.2shRNACOX2重组质粒对COX2表达的影响与未转染细胞相比,pshRNACOX2重组质粒对βactin无抑制作用,而对靶基因COX2mRNA有明显的抑制作用,抑制率为69.9%,未转染细胞与阴性对照之间没有差异(图3A).与未转染细胞与未转染细胞相比,βactin及阴性对照HK几乎无变化,而转染pshRNACOX2质粒的细胞COX2蛋白表达水平明显下降,抑制率为50.3%(图3B).2.3pshRNACOX2重组质粒转染对细胞增值的影响与未转染细胞相比,pshRNACOX2重组质粒转染后,24,48h时吸光度A值变化不明显,而72h后吸光度A值明显下降.说明72h后细胞增殖开始得到抑制.转染阴性对照质粒HK的细胞与未进行转染的HepG2细胞相比,转染后24,48,72,96,168h细胞生长和增殖均未受到影响(图4).3讨论RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是通过双链RNA介导同源性mRNA的特异性降解,导致转录后基因沉默,作为一种高效、特异的基因调节技术,目前已经成为研究基因功能的有力工具.RNAi现象的发现也为肿瘤的基因治疗提供了新的方法.利用RNAi技术抑制hTERT,Survivin的表达,可以起到抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞调亡,达到治疗肿瘤的目的[78],显示出RNAi技术在肿瘤基因治疗中的巨大潜力.小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可在哺乳细胞中诱导特异性基因沉默.siRNA可通过化学合成、体外转录或核酸内切酶降解等途径合成,但化学合成成本昂贵,内切酶可导致非特异性效应,且有siRNA瞬时转染介导的沉默效应持续时间短的缺点.如果将转录siRNA的DNA模板克隆至RNA聚合酶III的下游,可在细胞内持续转录产生小RNA分子,通过自身折叠形成发夹样(hairpin)结构,即内源性siRNA,可与靶基因结合降解mRNA,实现靶基因的持续抑制,可克服上述缺点.我们将靶向抑制COX2基因的siRNA的DNA转录模板插入到质粒pGenesil2的U6启动子下游,转录的mRNA通过自身折叠形成发夹样结构(shRNA),经Dicer酶切割形成siRNA,供探讨其对靶基因COX2抑制效应.我们构建的靶向抑制COX2基因的重组表达质粒转染肝癌细胞HepG2后COX2基因及蛋白显著下调,抑制率分别为69.9%和50.3%,而对内参基因βactin没有影响,提示利用RNAi技术抑制COX2基因表达是切实可行的.MTT实验显示,pshRNACOX2重组质粒转染HepG2细胞72h后,细胞增殖明显减慢,与未转染细胞组相比有显著性差异(Plt0.05),并可持续至少1wk.本研究表明,利用RNAi技术可抑制COX2表达,进而抑制肿瘤细胞增殖,为高表达COX2基因的恶性肿瘤基因治疗新途径提供了实验依据.基金项目重庆市自然科学基金项目(2006BB5271)【参考文献】[1]SinghB,BerryJA,ShoherA,etal.COX2overexpressionincreasesmotilityandinvasionofbreastcancercells[J].IntJOncol,2005,26513931399.[2]郭贵龙,姚榛祥,吴坚.环氧化酶-2基因在人乳腺癌中的表达及临床意义[J].中华医学杂志,2003,83(19)16611664.[3]LuS,YuG,ZhuY,etal.Cyclooxygenase2overexpressioninMCF10Fhumanbreastepithelialcellsinhibitsproliferation,apoptosisanddifferentiation,andcausespartialtransformation[J].IntJCancer,2005,1166847852.[4]YuanA,YuCJ,ShunCT,etal.Totalcyclooxygenase2mRNAlevelstumorangiogenesisandprognosisinnonsmallcelllungcancerpatients[J].IntJCancer,2005,1154545555.[5]WangW,BerghA,DamberJE.Cycloogenase2expressioncorrelateswithlocalchronicinflammationandtumorneovascularizationinhumanprostatecancer[J].ClinCancerRes,2005,11932503256.[6]IwamotoA,IkeguchiM,Matsumotoetal.Tumorcyclooxygenase2genesuppresslocalimmuneresponsesinpatientswithhepatocellularcarcinoma[J].Tumroi,2006,922130133.[7]张鹏辉,涂植光,杨明清,等.RNA干扰技术靶向hTERT基因治疗肝癌的实验研究[J].癌症,2004,23(6)619625.[8]闫歌,蒲丹,唐霓,等.RNA干扰技术对肝癌细胞内源性Survivin基因表达的影响[J].生物化学与生物物理进展,2004,31(9)829832.
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abingge上传于2013-12-18

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