siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用.doc

siRNA对胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子基因表达的作用【关键词】RNA干扰；胃肿瘤；血管内皮生长因子类；基因表达摘要目的研究siRNA对人胃腺癌细胞株SGC-7901血管内皮生长因子（VEGF）基因表达的影响。方法利用体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段，转录针对VEGFmRNA的siRNA，通过脂质体2000将合成的siRNA转染入SGC-7901细胞，设置转染VEGF错义序列组、脂质体组、空白对照组作为对照，用MTT法检测细胞抑制率，流式细胞仪检测细胞周期的改变，RT-PCR检测转染后VEGFmRNA表达水平的变化，ELISA法检测细胞培养液中VEGF蛋白分泌量的变化。结果所设计的两个靶位点siRNA均能有效抑制胃腺癌细胞的生长，并使细胞周期阻滞于G0/G1期；VEGFmRNA的表达也受到有效抑制，明显减少；同时，对应的VEGF蛋白水平也显著降低，作为阴性对照的错义序列组siRNA则没有出现这种变化。结论体外转录合成的siRNA可抑制胃腺癌SGC-7901细胞VEGF基因的表达。关键词RNA干扰；胃肿瘤；血管内皮生长因子类；基因表达ABSTRACTObjectiveToevaluatethegeneexpressionofVEGFbyRNAinterferenceinhumangastriccancer.MethodssiRNAstargetingVEGFmRNAwasobtainedbyinvitrotranscription，whichwastransfectedintohumangastriccancercelllinesSGC-7901withLipofectamine2000.Thenon-transfectedcells，cellstreatedwithLipofectimineandcellstreatedwithSCRweretakenascontrols.MTTwasusedtodetecttheinhibitiverateofcellgrowth.Flowcytometrywasusedtodetectthechangesofcyc-lingofthecell.TheinhibitiveeffectofsiRNAonmRNAlevelwasdetectedbyRT-PCR，thesecretionofVEGFproteininthesu-pernatantbyELISA.ResultsThesmallinterferingRNA（siRNA）targetinghumanVEGFeffectivelyinhibitedtheproliferationofgastriccancerSGC-7901.Itaffectedthedistributionofcellcycle，increasedcellpopulationinG0/G1phaseanddecreaseditinSphase.TheexpressionofVEGFmRNAwassignificantlyinhibitedinSGC-7901；otherwise，VEGFproteinnotablydecreased，buttheeffectsdidnotappearincontrolscramblesiRNA.ConclusionThelevelofVEGFgeneexpressionofSGC-7901cellscanbedeclinedbytransfectedwithsiRNA.KEYWORDSRNAinterference；gastricneoplasms；vascularendothelialgrowthfactor；geneexpression肿瘤血管的形成受多种因子的调节，其中血管内皮生长因子（VEGF）是作用最强、特异性最高的一种能刺激细胞运动和肿瘤血管生成的因子，与肿瘤的发生、发展关系密切。将外源性或内源性双链RNA（dsRNA）导入细胞后引起与该段RNA同源的mRNA产生特异性降解，其相应的基因受到抑制，这种发生在转录后的基因静寂现象被称为RNA干扰（RNAi）13。体内外实验证实，2123bp的siRNA（smallinterferenceRNA）可特异性地发挥RNAi作用4。胃癌是我国最常见的消化道肿瘤，其病死率居各种恶性肿瘤之首57。探索治疗胃腺癌的新方法具有重要临床价值。本实验以VEGF基因为靶标，设计合成siRNA，通过脂质体转染的方法将其转入胃腺癌细胞株SGC-7901，研究其静寂VEGF基因表达的效应，为临床进一步应用提供理论依据。现将结果报告如下。1材料和方法1.1材料及其来源SGC-7901细胞购自中国协和基础学院细胞中心。DMEM培养基、LipofectamineTM2000、TRIzolReagent、RPMI1640购自Invitrogen公司。T7Ri-boMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒、AccessRT-PCRIntroductorySystem购自Promega公司。四唑氮蓝（MTT）购自Sigma公司。人VEGFELISAKit购自武汉博士德生物工程有限公司。1.2siRNA的制备从GenBank中获取已知的人VEGFmRNA序列（ACCESSION:AB021221）。依据Promega公司提供的设计软件和试剂盒设计合成siRNA序列，见表1。表1设计合成的siRNA序列（略）1.3细胞培养SGC-7901细胞用含体积分数0.10新生牛血清的RPMI1640培养基，于37、体积分数为0.05CO2条件下培养。1.4MTT法检测细胞抑制率取对数生长期的SGC-7901细胞，配制6107/L浓度的细胞悬液，加到96孔板内（Corning，美国），每孔加100L。设空白对照组、脂质体组、错义序列组（错义序列组SCR序列与siRNA2序列有相同的GC组成，但是和人的mRNA没有明显的同源性，以此作为阴性对照8）、siRNA各剂量组，每组5孔，接种24h后弃去上清，采用脂质体包裹的方式转染siRNA。siRNA1和siRNA2两组分别设立4个浓度，分别为100、200、400、1000nmol/L，分别定义为低、中、高、极高剂量组；siRNASCR组只设200nmol/L，加含各浓度的siRNAOpti-MEM培养基100L；脂质体组只加脂质体，空白对照组只加Opti-MEM培养基100L，置于37、含体积分数0.05CO2、无血清培养基中继续培养6h，每孔补加新生牛血清10L，继续培养。脂质体组Lipo-fectamineTM2000用量为每孔0.5L，按Lipo-fectamineTM2000使用说明书操作。于24h后分别加入MTT10L，振荡15min，酶标仪读出吸光度（A）值。计算细胞抑制率。1.5流式细胞仪观察转染siRNA后细胞的凋亡各组细胞以1.5105/L密度接种于25cm2培养瓶，以1.4方法转染后继续培养48h，胰酶消化离心收集并悬于PBS中，4、体积分数0.70的乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙锭（PI）的染色液染色30min。应用流式细胞仪（EPICS-ELITE-ESP）进行细胞周期分析，每个样本约检测11000个细胞，计算各期细胞数占细胞总数的百分率。1.6RT-PCR检测转染细胞VEGFmRNA表达水平各组细胞以1.0105/L密度接种于6孔板，24h后弃去上清，加入siRNA1、siRNA2、siRNASCR200nmol/L，按1.4方法转染24h后胰酶消化，离心收集。TRIzol提取各组细胞总RNA，取1g总RNA进行RT-PCR扩增。VEGF引物:上游引物:5-TCCGGGCCTCCGAAACC-3，下游引物:5-CCTGGTGAGATCTGG-3，扩增产物为421bp；内参照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）引物:上游:5-ACTGCCACCCAGAAGACT-3，下游:5-GCT-CAGTGTAGCCCAGGAT-3，扩增产物为292bp。将PCR扩增产物在20g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳观察并照相，然后应用天能分析软件对条带进行扫描，检测各组VEGFmRNA与其对应的内参GAPDHmRNART-PCR产物的吸光度（A）值，计算AVEGF/AGAPDH的比值。1.7VEGF蛋白分泌量分析收取转染24h后细胞上清用于检测VEGF蛋白分泌量。严格按试剂盒说明操作，将不同浓度的VEGF标准品（7.8、15.6、31.2、62.5、125.0、250.0、500.0、1000.0ng/L）以及不同组细胞上清液于Rayto2100C酶标仪中检测450nm吸光度（A）值。读板后仪器自动绘制标准曲线并计算出各待测样本的VEGF含量。2结果2.1siRNA对SGC-7901细胞生长的抑制siRNA1、siRNA2的低、中、高剂量组的吸光度值与空白对照组比较，差异均有极显著意义（F=12.264，q=9.82710.260，P<；0.01）；极高剂量组的吸光度值与脂质体组比较差异有显著意义（q=7.231，P<；0.05）。错义序列组、脂质体组与正常对照组比较差异无显著性（P>；0.05）。不同剂量各组之间比较，中剂量组吸光度值最低，抑制率最高（q=10.19810.260，P<；0.001）。见表2。2.2细胞转染siRNA后对细胞周期的影响与空白对照组比较，siRNA作用的细胞G0/G1期（细胞静止期和DNA合成前期）比例升高，S期（DNA合成期）比例降低；错义序列组、脂质体组与空白对照组比较无明显差异。见表3。2.3细胞转染siRNA后各组VEGFmRNA表达水平电泳结果显示，空白对照组、脂质体组、错义序列组421bp处均见清晰条带，siRNA各组条带均明显减弱（见图1），各组内参照GAPDH条带一致。空白对照组、脂质体组、siRNASCR组、siRNA1组、siRNA2组AVEGF/AGAPDH比值分别为0.8560.009、0.8340.020、0.8150.017、0.4560.030、0.4680.019，siRNA1、siRNA2与空白对照组、脂质体组、错义序列组比较，差异均有极显著意义（F=244.945，q=27.42730.560，P<；0.01），其他各组比较差异无显著性。2.4siRNA转染后24h各组VEGF蛋白分泌量的变化siRNA1和siRNA2组的VEGF蛋白分泌量明显低于其他3组，差异均有显著性（F=33.131，q=9.03612.154，P<；0.01）。见表4。表2转染siRNA各组SGC-7901细胞24h抑制率（略）表3流式细胞仪检测细胞周期变化（略）图1转染siRNA后SGC-7901细胞VEGFmRNA表达水平（略）DNAMarker；siRNA1；siRNA2；脂质体组表4各组SGC-7901细胞上清VEGF蛋白分泌量的比较（略）3讨论胃腺癌是人类常见的癌症之一，严重威胁人类的健康和生命，发病率呈逐年上升的趋势。手术治疗可以使其中一部分病人得到治愈，但更多的病人面临错失手术时机以及术后肿瘤复发的局面。在分子生物学迅速发展的今天，寻找一条有效的胃腺癌基因水平的治疗方法具有重要的临床价值。微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分，抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题。肿瘤血管的形成受多种因子调节，其中最重要的一种是VEGF，它不仅促进血管生成，还增加血管通透性，促进转移，改变宿主免疫功能。VEGF基因位于染色体的6p21.3，全长28kb，编码VEGF的基因长约14kb，由8个外显子和7个内含子交替构成。其mRNA的不同剪接可以产生5种异构体，即VEGF121、145、165、189及2069。其中VEGF165是最为常见的形式，在包括胃腺癌在内的多种肿瘤中有表达10，11，在肿瘤微血管生成过程中扮演重要角色。通过抑制VEGF的表达抑制肿瘤微血管形成是当前抗肿瘤研究的热点之一。RNAi作为生命科学领域的新技术，其应用非常广泛，从单细胞生物一直到人，作为基因表达干预的理想方法，可应用于病毒和肿瘤的基因治疗12，13。本研究以人胃腺癌细胞系SGC-7901为对象，利用分子生物学技术设计、体外转录针对VEGF基因的两组siRNA，转染体外培养的SGC-7901细胞，遏制VEGF基因的表达，研究胃腺癌的防治方法。结果表明，siRNA对VEGF基因从mRNA转录到蛋白质表达均具有明显的抑制效果，抑制了胃腺癌细胞SGC-7901的增殖，促进细胞凋亡，改变细胞周期，降低VEGFmRNA表达水平及蛋白表达水平。由此可见，在胃腺癌的抗血管生成基因治疗中，VEGF可以成为有效的靶位点。本文实验所用体外转录试剂盒所转录出来的siRNA纯度高，可直接应用于体外培养细胞的转染。脂质体带正电，可以靠静电作用结合RNA形成RNA-阳离子脂质体复合物，同时又吸附在带负电的细胞膜表面。因此，脂质体转染法在短期应用的基因治疗中具有明显优点。总之，本文为RNAi应用于肿瘤的基因治疗提供了一些实验基础，验证了应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤相关基因的表达，从而抑制瘤细胞的增殖、防治肿瘤的基因治疗思路，为下一步动物实验奠定了基础。当然，针对VEGF的RNAi技术临床应用于胃腺癌治疗尚需要进一步的细胞实验以及动物实验。参考文献1FIREA.RNA-triggeredgenesilencingJ.TIG，1999，15（9）:358-363.2FIREA.Potentandgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegansJ.Nature，1998，391:806-811.3项锋钢，马桂馨.肺癌组织中血管内皮生长因子受体Flt1及KDR的表达及其与肿瘤转移和预后的关系J.青岛大学医学院学报，2004，40（1）:8-10.4杨光，曹国军，李洁，等.SiRNA抑制SARS冠状病毒感染Ve-roE6细胞J.医学分子生物学杂志，2004，1:270-273.5吴汉平，吴开春，李玲，等.人环氧合酶-2（hCOX-2）编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细