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VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用.docVEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用.doc -- 5 元

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VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用作者刘都户,张学庸,黄裕新,樊代明【关键词】胃肿瘤关键词胃肿瘤血管内皮生长因子基因转染摘要目的构建血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF165)真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用.方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165mRNA真核表达载体用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞(SGC7901)省系观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标.结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强.与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0)明显高于未转染细胞(4.0).瘤细胞接种裸鼠后33d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积(2351±638)mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积(1534±363)mm3.结论VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.KeywordsstomachneoplasmsvascularendothelialgrowthfactorgenetransfectionAbstractAIMToconstructaeukaryoticexpressionvectorofVEGF165(vascularendothelialgrowthfactor)gene,andtomoredirectlyestablishtheroleofVEGFintheoncogenesisofhumangastriccarcinoma.METHODSVEGF165senseRNAexpressionvectorwasconstructedbyinsertingtheVEGF165cDNAintoSGC7901cellsbylipofecttechnique.Thenthecellcycle,proliferativeabilityinvitroandgrowthinnudemiceoftransfectedcellswereexamined.RESULTSIntroductionoftheVEGFsenseconstructintoSGC7901cellsresultedinamarkedincreaseintheexpressionofVEGFspecificmRNAandproteinbydotblotandimmunofluorescencestaininganalysisintransfectedtumorcells.Cellcycleanalysisshowedthat,comparedwiththeparentalcellsthenumberoftransfectedcellshadanincrease(0.44)inG2phaseandadecrease(0.17)inSphase,anditscolonyformingrate(9.0)washigherthanthatofthecontrolcells(4.0)Thevolumeoftumor(2351±638)mm3inthenudemiceinoculatedwiththecellstransfectedbyVEGF165expressionvectorgreatlyincreasedincomparisonwiththat(1534±363)mm3innudemiceinoculatedwithSGC7901cells.CONCLUSIONAsstartingangiogenesis,VEGFmightpromotethegrowthofsolidtumorinaddition,itmightcorrelatewiththeproliferationoftumorcell.0引言目前的研究已经表明,血管生成是恶性肿瘤迅速增殖并转移扩散的主要条件之一[1].随着人们对血管生成诱导剂的深入研究,已发现有许多生长因子,如转化生长因子刺激新生血管形成的作用是通过全部或部分诱导血管内皮生长因子(VEGF)表达而实现的.VEGF是一类特异性血管内皮刺激因子,它高效特异地作用于血管内皮细胞,对其有强烈的促分裂作用和趋化作用[24]①增强微血管通透性,促进血浆纤维蛋白外渗,为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络②通过与内皮细胞上两个特殊受体flt和flk(KDR)作用,直接刺激内皮细胞增殖,并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶,这不仅可促进内皮细胞移动,有利于血管生成,而且还有利于癌细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散,此方式为肿瘤的浸润、转移创造条件[5,6].另有实验表明,胃癌组织高水平表达VEGF,其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关[7].我们通过基因转染技术使胃癌细胞过表达VEGF,更直接地研究VEGF对肿瘤生长的影响.1材料和方法1.1材料限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、无DNA酶的Rnase购自Promega公司,LipofectAmine由Gibco公司提供,G418由Sigma公司提供,RNA地高辛标记试剂盒(SP6/T7)购自BoehringerMannheim公司,FITC标记的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC7901、宿主菌E.coliDH5α和JM109均为本校西京医院全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的人VEGF165cDNA基因被克隆在pGEM3Zf()的BamHI位点质粒pGEMhVEGF由美国加利福尼亚大学医学