VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用.doc

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用作者：刘都户，张学庸，黄裕新，樊代明【关键词】胃肿瘤关键词:胃肿瘤；血管内皮生长因子；基因转染摘要:目的构建血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF165）真核表达载体，研究其对胃癌生成的作用.方法用DNA重组方法，将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中，构建VEGF165mRNA真核表达载体；用阳性脂质体介导的基因转染技术，将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系；观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标.结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示，正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强.与未转染细胞相比，转染细胞的G2/M期细胞增加（0.44）而S期细胞减少（0.17），克隆形成率（9.0%）明显高于未转染细胞（4.0%）.瘤细胞接种裸鼠后33d，过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351638）mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534363）mm3.结论VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长，另外，VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.Keywords:stomachneoplasms；vascularendothelialgrowthfactor；genetransfectionAbstract:AIMToconstructaeukaryoticexpressionvectorofVEGF165（vascularendothelialgrowthfactor）gene，andtomoredirectlyestablishtheroleofVEGFintheoncogenesisofhumangastriccarcinoma.METHODSVEGF165senseRNAexpressionvectorwasconstructedbyinsertingtheVEGF165cDNAintoSGC-7901cellsbylipofecttechnique.Thenthecellcycle，proliferativeabilityinvitroandgrowthinnudemiceoftransfectedcellswereexamined.RESULTSIntroductionoftheVEGFsenseconstructintoSGC-7901cellsresultedinamarkedincreaseintheexpressionofVEGF-specificmRNAandproteinbydotblotandim-munofluorescencestaininganalysisintransfectedtumorcells.Cellcycleanalysisshowedthat，comparedwiththeparentalcellsthenumberoftransfectedcellshadanincrease（0.44）inG2phaseandadecrease（0.17）inSphase，anditscolonyformingrate（9.0%）washigherthanthatofthecontrolcells（4.0%）；Thevolumeoftumor（2351638）mm3inthenudemiceinoculatedwiththecellstransfectedbyVEGF165expres-sionvectorgreatlyincreasedincomparisonwiththat（1534363）mm3innudemiceinoculatedwithSGC-7901cells.CONCLUSIONAsstartingangiogenesis，VEGFmightpro-motethegrowthofsolidtumor；inaddition，itmightcorre-latewiththeproliferationoftumorcell.0引言目前的研究已经表明，血管生成是恶性肿瘤迅速增殖并转移扩散的主要条件之一1.随着人们对血管生成诱导剂的深入研究，已发现有许多生长因子，如转化生长因子刺激新生血管形成的作用是通过全部或部分诱导血管内皮生长因子（VEGF）表达而实现的.VEGF是一类特异性血管内皮刺激因子，它高效特异地作用于血管内皮细胞，对其有强烈的促分裂作用和趋化作用2-4:增强微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗，为血管形成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网络；通过与内皮细胞上两个特殊受体flt和flk（KDR）作用，直接刺激内皮细胞增殖，并产生纤维蛋白溶酶原激活剂和胶原酶，这不仅可促进内皮细胞移动，有利于血管生成，而且还有利于癌细胞脱落进入血管或向邻近纤维蛋白和结缔组织基质扩散，此方式为肿瘤的浸润、转移创造条件5，6.另有实验表明，胃癌组织高水平表达VEGF，其表达量与肿瘤的恶性程度呈正相关7.我们通过基因转染技术使胃癌细胞过表达VEGF，更直接地研究VEGF对肿瘤生长的影响.1材料和方法1.1材料限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、无DNA酶的Rnase购自Promega公司，LipofectAmine由Gibco公司提供，G418由Sigma公司提供，RNA地高辛标记试剂盒（SP6/T7）购自BoehringerMannheim公司，FITC标记的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC-7901、宿主菌E.coliDH5和JM109均为本校西京医院全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的人VEGF165cDNA基因被克隆在pGEM-3Zf（+）的BamHI位点质粒pGEM-hVEGF由美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所Abraham教授惠赠；pcDNA3真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.BALB/c裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养.1.2方法1.2.1VEGF165真核表达载体的构建、鉴定、扩增及纯化采用小量酶切反应法，应用BamHI，EcoRI+HindIII，EcoRI，PstI分别对pGEM-hVEGF进行初步酶切鉴定，并对其进行T7测序.根据pGEM-3Zf（+）及pcDNA3图谱确定克隆策略.用EcoRI+XbaI消化pGEM-hVEGF后得到VEGF的cDNA可正向克隆于由此两种酶消化后的pcDNA3中.连接产物转化大肠杆菌进行扩增.挑单一菌落，以碱裂解法小量提取质粒，对其进行酶切鉴定，然后对阳性重组子进行大量质粒提取，并纯化再进行酶切鉴定.1.2.2VEG165基因转染及转染细胞的鉴定将SGC-7901细胞以1107L-1的密度接种于24孔培养板，待细胞贴壁后，加入不同浓度的G418，G418抗性克隆的筛选浓度为14d内杀死SGC-7901的最低浓度.按5105细胞/孔的量在6孔板中接种指数期生长的细胞，在37，50mLL-1CO2孵箱中培养过夜，直到细胞50%汇片.用无血清RPMI1640培养液洗涤细胞1次，然后将DNA/Liposome复合物及无血清RPMI1640液加入转染细胞孔中.孵育5h后，加入含200mLL-1小牛血清的完全RPMI1640培养液，培养48h后，将其传代于G418选择培养液，选择G418抗性克隆细胞并扩增培养，待进一步鉴定.VEGFRNA检测探针的制备，带有hVEGF165的质粒，经合适的核酸内切酶酶切后，对待转录的线性DNA质粒进行体外转录，加入Dig标记用的NTP混合底物，即可以T7RNA聚合酶转录出反义VEGFRNA，用以检测正义RNA表达；RNA斑点杂交，用异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA，变性后，将其点样于NC膜上，干燥后，80烘烤2h，6SSC浸湿，65水浴3h进行预杂交.加入地高辛标记的VEGFRNA探针，60水浴18h进行杂交.然后用SSC洗膜、加封闭液，加碱性磷酸酶标记的抗Dig抗体检测，NBT/BCIP呈色.1.2.3细胞生长试验集落形成试验:将对数生长期的细胞作梯度倍数稀释，接种于含10mL预温37培养液的培养皿中，轻轻晃动使细胞分散均匀.培养2wk左右，当出现肉眼可见的克隆时，终止培养，甲醇固定，姬姆萨染色，克隆计数，计算克隆形成率.细胞周期测定:分别取对数生长期的转染细胞5105，PBS洗后加入700mLL-1乙醇固定，加PI染料，4放置30min，进行FCM分析.流式细胞仪免疫荧光测定:将室温固定的细胞离心后，重新悬浮于染色液（PBS+1gL-1Triton-X-100+100mLL-1羊血清）中，封闭1h后，分别加入第一抗体及正常兔IgG，室温孵育60min，加入FITC标记的羊抗兔IgG.30min后，用PBS洗涤细胞，进行流式细胞仪检测.裸鼠移植瘤生长:经G418筛选的转染细胞，扩大培养后，分别以1.4106个细胞接种于BALB/c裸小鼠右大腿背侧皮下.测量肿瘤最大直径和横径.肿瘤体积为V=1/2（db2）8.对不同数据采用相应的分析方法进行统计学处理.2结果2.1pGEMhVEGF165的鉴定用限制性内切酶EcoRI和HindIII对pGEM-hVEGF165进行酶切，电泳后得到640bp片段.测序结果发现VEGF165cD-NA正向克隆于T7启动子的下游，序列完全正确.用计算机基因酶谱分析软件对hVEGFcDNA进行分析，其上不含EcoRI，HindIII，XbaI等限制性内切酶位点.2.2hVEGF165真核表达载体的鉴定对VEGF165cDNA正向插入pcDNA3构建的重组质粒，分别以EcoRI，XbaI，EcoRI+XbaI酶切后电泳，电泳相应片段大小与图谱序列大小一致.然后再用EcoRI+HindIII对其进行双酶切，未发现含有目的基因的相应大小片段.2.3目的基因导入人胃癌细胞的证据G418抗性筛选:G418筛选浓度为350gmL-1.与未转染的SGC-7901细胞相比，10d后可见转染pcDNA3空载体对照组、pcDNA-hVEGF实验组的细胞继续生长，而SGC-7901细胞大部分死亡，14d后全部死亡，G418抗性克隆（Fig1）.经G418筛选2mo后，转染细胞仍继续生长；核酸分子杂交:应用VEGF反义RNA单链探针进行杂交时，各组细胞中的RNA均出现杂交信号，但其中转染pcDNA-hVEGF的细胞（SGC-hVEGF）中的杂交信号明显增强（Fig2）；流式细胞仪测定细胞内VEGF免疫荧光染色:用FCM测定经FITC染色后的细胞荧光强度和阳性细胞数，间接反映细胞为VEGF含量变化.当阴性对照组细胞（一抗为正常兔IgG）的荧光强度为1.8%时，SGC-7901细胞为31.6%，SGC/hVEGF为75.4%.2.4细胞生长试验集落形成试验:当平板培养14d时，终止培养，并计算克隆数.SGC-hVEGF的克隆形成率为9.0%，SGC-pcDNA为4.8%，SGC-7901为4.0%；转染细胞的细胞周期分布:SGC-hVEGF细胞与SGC-7901未转染细胞相比，G2/M期细胞增加了0.44，而S期细胞减少了0.17，G0/G1期细胞无明显变化（Tab1）；VEGF对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响:实验分2组，SGC-hVEGF细胞接种的转染实验组和SGC-7901细胞接种的对照组，每组5只裸鼠.裸鼠在细胞接种后6d可见肿瘤长出，8d始测量肿瘤大小.结果可以看出，接种后8d时，各组间的肿瘤大小无差别.从13d开始，VEGF转染细胞所致的实体肿瘤生长速度增快（Tab2），肿瘤倍增时间缩短.33d时处死动物，取肿瘤组织进行组织学检查，与SGC-7901细胞组相比，转染VEGF细胞组的肿瘤组织切片可见血管丰富，细胞增生活跃，少见有组织缺血坏死现象.表1转染细胞周期分布（略）表2裸鼠移植瘤体积（略）3讨论肿瘤在直径2mm时，肿瘤细胞通过弥散作用吸取营养，当肿瘤进一步长大时，必须依赖新生的毛细血管提供充足的血液，因此，肿瘤细胞诱发血管生成因子，作用于内皮细胞，促进血管形成9.胃癌的生长依赖于血管生成，而且肿瘤组织前缘VEGF表达较其他部位明显，微血管密度较高，血管生成活跃，说明VEGF表达与血管生成部位是一致的，它有助于胃癌细胞的增殖，有利于胃癌的生长10，11.我们构建了hVEGF165真核表达载体，通过基因转染技术，使人胃癌细胞过表达VEGF，从而以更直接的实验方法研究了VEGF对肿瘤发生、进展的作用.Tischer等12首先对人VEGF基因的结构进行了分析研究，并完成了人VEGF165的cDNA克隆，包括信号肽全长约为600bp.他们并将VEGF165基因重组在pGEM-3Zf（+）载体的BamHI位点.我们用限制性内切酶分析其正确性，并对其进行了DNA测序分析，进一步确定了其可靠性及质量.根据实验目的，我们成功构建了VEGF165真核表达载体.克隆了一个基因之后，许多研究者希望将其导入各种类型细胞中，对其特征加以分析.而这一目标的实现需要将目的DNA有效地导入表达细胞.本实验转染宿主细胞为人胃癌细胞SGC-7901，目的是增强VEGF的表达，以观察其对人胃癌生成的生物学作用.哺乳动物细胞表达的蛋白质在翻译后被加工的机会较多（如糖基化），可提高产物正确构型的机率；另外，哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可