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VEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用.docVEGF165 表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用.doc

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VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用作者:刘都户,张学庸,黄裕新,樊代明【关键词】胃肿瘤关键词:胃肿瘤;血管内皮生长因子;基因转染摘要:目的构建血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF165)真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用.方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞(SGC-7901)省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标.结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强.与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%).瘤细胞接种裸鼠后33d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积(2351b2)[8].对不同数据采用相应的分析方法进行统计学处理.2结果2.1pGEM┐hVEGF165的鉴定用限制性内切酶EcoRI和HindIII对pGEM-hVEGF165进行酶切,电泳后得到640bp片段.测序结果发现VEGF165cD-NA正向克隆于T7启动子的下游,序列完全正确.用计算机基因酶谱分析软件对hVEGFcDNA进行分析,其上不含EcoRI,HindIII,XbaI等限制性内切酶位点.2.2hVEGF165真核表达载体的鉴定对VEGF165cDNA正向插入pcDNA3构建的重组质粒,分别以EcoRI,XbaI,EcoRI+XbaI酶切后电泳,电泳相应片段大小与图谱序列大小一致.然后再用EcoRI+HindIII对其进行双酶切,未发现含有目的基因的相应大小片段.2.3目的基因导入人胃癌细胞的证据①G418抗性筛选:G418筛选浓度为350μgmL-1.与未转染的SGC-7901细胞相比,10d后可见转染pcDNA3空载体对照组、pcDNA-hVEGF实验组的细胞继续生长,而SGC-7901细胞大部分死亡,14d后全部死亡,G418抗性克隆(Fig1).经G418筛选2mo后,转染细胞仍继续生长;②核酸分子杂交:应用VEGF反义RNA单链探针进行杂交时,各组细胞中的RNA均出现杂交信号,但其中转染pcDNA
编号:201312182205174145    类型:共享资源    大小:39.00KB    格式:DOC    上传时间:2013-12-18
  
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