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VEGF及CD147在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究.docVEGF及CD147在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究.doc -- 5 元

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VEGF及CD147在单核细胞来源的泡沫细胞中表达动力学的研究作者岳红红朱平吴振彪樊春梅赵清波鲍炜【摘要】目的研究CD147,VEGF在单核细胞来源的泡沫细胞中的表达动力学的,探讨CD147,VEGF与动脉粥样硬化的关系.方法以氧化型低密度脂蛋白诱导,建立人单核细胞系(U937细胞)分化的泡沫细胞模型,通过油红O特殊染色的形态学鉴定.将U937细胞在不同浓度氧化型低密度脂蛋白(oxLDL,0,25,50,100,200mg/L)条件下培养48h在100mg/LoxLDL条件下,在培养的不同时间点(0,6,12,24,48h)分别收集泡沫细胞和培养上清,采用流式细胞术检测细胞膜表面CD147,ELISA检测培养上清中VEGF的表达和RTPCR检测mRNA表达水平.结果CD147及VEGF表达出现最高峰时的oxLDL浓度分别为25mg/L和50mg/L与100mg/L的氧化型低密度脂蛋白作用6,48h后,CD147,VEGF表达分别出现最高峰VEGFmRNA水平出现最高峰时,oxLDL作用浓度及时间分别为200mg/L,48h.CD147mRNA水平出现最高峰时oxLDL作用浓度及时间分别为25mg/L,6h,此后,mRNA水平不变.结论VEGF及CD147在单核细胞来源的泡沫细胞表达均升高CD147表达上调早于VEGF,低浓度oxLDL促进CD147表达,高浓度促进VEGF的表达U937泡沫细胞中VEGF的mRNA水平与oxLDL的作用浓度及时间成正相关,泡沫细胞中CD147的mRNA与oxLDL的作用浓度及时间无关.【关键词】CD147血管内皮生长因子类泡沫细胞动脉硬化0引言泡沫细胞(foamcells)是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞,其主要来源有两个,一是血液单核细胞,二是血管中膜平滑肌细胞.一般认为在动脉粥样硬化形成的早期,血液中单核细胞进入内皮下间隙,在内膜下被氧化型低密度脂蛋白oxLDL、炎性介质等激活后分化为巨噬细胞,后者通过其表面的清道夫受体吞噬oxLDL形成泡沫细胞,并逐渐演变成脂纹及粥样斑块[1].动脉粥样硬化不仅是脂代谢紊乱的过程,也是炎症反应的过程.因此,泡沫细胞是粥样斑块中重要的炎症细胞[2].长期的慢性炎症性疾病可导致机体内免疫分子、炎症因子等炎性介质水平明显升高[3].不但可调节机体免疫反应,而且能够作用于外周组织导致一系列致动脉粥样硬化代谢功能改变[4].研究表明,在泡沫细胞形成过程中CD147分子及VEGF的表达上调.此外,新近在动脉粥样硬化斑块中也检测到CD147分子及血管内皮生长因子(VEGF)等炎症介质,提示其可能参与了动脉粥样硬化的发生[56].鉴于CD147分子及VEGF在炎性斑块中的作用,且目前鲜有对其在泡沫细胞形成过程中表达变化的研究,我们建立人类单核细胞(U937)源性泡沫细胞模型[7],进一步探讨CD147,VEGF等炎性介质在动脉粥样硬化发生中的作用.1材料和方法1.1材料低密度脂蛋白(LDL)及VEGF的ELISA检测试剂盒(CHENICON,US)硫代巴比妥酸(TBA)(南京建成生物工程研究所)FITC标记小鼠抗人CD147(R&D,US).FACSCaliburBectomDiekinson,FranklinLakes,NJ流式细胞仪.1.2方法1.2.1oxLDL的制备将LDL置于含10μmol/LCuSO4的磷酸缓冲液(PBS)中,37℃透析12h后,在1g/LEDTA的PBS中透析24h,0.2μm微孔滤膜过滤除菌备用.用硫代巴比妥酸物质的含量鉴定oxLDL,氧化后每毫克胆固醇中丙二醛含量为38.7μmol/g.1.2.2细胞株及泡沫细胞模型的建立U937细胞株系人类单核细胞系,由中国科学院上海细胞生物研究所提供,在含100ml/L胎牛血清的RPMI1640培养基中悬浮生长,置于50mL/LCO2培养箱中培养.将细胞稀释至51012/L,种于24孔板中每孔1mL,分别与不同浓度oxLDL(0,25,50,100,200mg/L)共孵育24h.将相同密度的U937细胞与oxLDL100mg/L共孵育不同时间(0,3,6,12,24,48h).U937泡沫细胞形态通过新配制的3ml/L油红O染色鉴定,胞质内出现红染颗粒的为脂质染色阳性.1.2.3细胞膜表面CD147流式检测将孵育后细胞悬液,经PBS洗涤2次后调整细胞密度为1109/L.取100μL细胞悬液加FITC标记的小鼠抗人CD147mAb2.5μL,充分震荡混匀后室温避光静置20min.经PBS洗涤后,再加入300μL的PBS.通过FACSCalibur流式细胞仪检测,使用CellQuest(BectonDickinson)软件分析.1.2.4ELISA检测VEGF分泌含量按照试剂盒操作步骤,以RPMI1640培养基作为空白,将不同浓度的VEGF标准品在酶标仪(美国BIOIAD公司出品)中检测并绘制VEGF标准曲线.将各组细胞离心,上清进行ELISA检测,通过标准曲线查得相应VEGF含量.1.2.5CD147及VEGFmRNA水平检测Trizol提取总RNA,以2μLRNA作为模板进行逆转录,PCR扩增,以GAPDH作为内参照.VEGF引物序列上游5′CTGCTGTCTTGGGTGCATTG3′,下游5′GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCG3′,扩增产物为334bpGAPDH引物序列上游5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′,下游5′AGATCCACAACGGATACTT3′,扩增产物为360bP.PCR反应条件94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,持续25个循环.CD147引物序列上游5′ACATCAACGAGGGGGAGACG3′,下游5′GGCTTCAGACAGGCAGGACA3′,扩增产物为480bp.PCR反应条件94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸90s,持续25个循环.统计学处理采用统计软件包进行数据分析,计量数据用x±s表示.组间均属比较用方差分析及Dunnettt两两比较检验,Plt0.05有统计学意义.2结果2.1U937泡沫细胞的鉴定光镜下对照组细胞(U937)内无红染颗粒,而处理组细胞体积增大,细胞质内可见较多的红染颗粒,提示细胞内脂质成分增加.2.2CD147分子在U937泡沫细胞膜表面表达的变化流式细胞术显示,与对照组(U937细胞)相比,U937泡沫细胞膜表面CD147表达的平均荧光强度升高.浓度作用曲线显示,当oxLDL作用浓度为25mg/L时,U937泡沫细胞膜表面CD147表达强度出现最高峰,较对照组升高约1.6倍(Plt0.01,n3),之后其表达强度逐渐下降(图2).时间曲线表明U937细胞与oxLDL80mg/L作用6h后膜表面CD147表达强度出现最高峰,较对照组升高约2.3倍(Plt0.01,n3),之后其表达强度逐渐下降.2.3U937泡沫细胞中VEGF的表达ELISA检测显示,细胞培养上清中VEGF的蛋白分泌含量与oxLDL作用浓度成正比.浓度曲线表明U937细胞在与200mg/LoxLDL作用后,VEGF分泌水平达峰顶,较对照组升高约2.1倍(aPlt0.05,bPlt0.001,n3,图4).时间曲线显示,U937细胞与oxLDL100mg/L作用48h后VEGF分泌水平达峰顶,较对照组升高约2.43倍(aPlt0.05,bPlt0.01,n3,图5).2.4CD147及VEGFmRNA的表达水平RTPCR结果显示,当U937细胞与25mg/LoxLDL的作用后CD147mRNA表达水平最高,之后其水平保持不变.当oxLDL的作用浓度为200mg/L时VEGFmRNA表达水平最高(图6).U937细胞与oxLDL100mg/L作用6h后CD147mRNA表达最高,之后其水平保持不变.作用48h后VEGFmRNA表达最高(图7).3讨论动脉粥样硬化是一个以修饰的脂质、单核细胞及富含胆固醇酯的泡沫细胞聚集为特征的复杂的病理过程,目前认为动脉粥样硬化也是一个慢性炎症反应过程[8].在粥样斑块中,泡沫细胞不仅是一种清道夫细胞,也是一种炎症调节细胞.CD147及VEGF蛋白及mRNA水平在泡沫细胞中的上调,提示在在粥样斑块中,CD147及VEGF可能参与了泡沫细胞形成的炎症反应过程[9].CD147是一种新发现的细胞表面黏附分子,又称为细胞外基质金属蛋白酶诱导因子extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer.EMMPRIN,可以刺激成纤维细胞的几种MMP的合成,参与基质的降解[10].Young[9]等通过免疫组化在人动脉内膜粥样硬化斑块富含巨噬细胞的区域中检测到CD147分子.在人心衰模型中,CD147与a3β1整合素形成复合体,通过外部信号及上调局部MT1,MMP的表达诱导MMP的产生从而降解基质,引发斑块的破裂促进心衰的发生.这些研究提示,CD147分子可能在动脉粥样硬化的发生中有着非常重要的作用[9].是迄今为止发现的唯一具有特异性促进血管内皮细胞有丝分裂作用的生长因子,并具有增加血管通透性的作用.VEGF的增加促进了动脉粥样硬化斑块内的血管形成,由于在血管形成的过程中,细胞粘附分子等产生增加,且由此促进炎性细胞对血管壁的粘附,进而加重动脉粥样硬化,并形成恶性循环[11].我们建立人类单核细胞(U937)源性泡沫细胞模型[6],采用流式细胞术、ELASA及RTPCR等方法检测,分析CD147,VEGF在U937泡沫细胞中的表达变化.研究发现,CD147表达出现最高峰时的oxLDL浓度为25mg/L,作用时间为6h.这表明短时间低浓度oxLDL可能促进单核细胞中CD147的表达,之后CD147表达逐渐降低,表明CD147的上调可能是单核细胞对oxLDL刺激后短期的急性反应,CD147可能在早期的泡沫细胞形成过程中起到了重要的作用.与之相反,VEGF表达出现最高峰时的oxLDL浓度为200mg/L,作用时间为24h.相比CD147,VEGF表达出现最高峰时需要较高浓度的oxLDL及较长的作用时间.这表明VEGF的表达可能滞后于CD147,VEGF可能是在动脉粥样硬化的发生中继CD147上调之后持续发挥作用的炎症因子.CD147,VEGF在单核细胞来源泡沫细胞中不同表达提示oxLDL可能是通过不同信号通路调节VEGF与CD147在单核/巨噬细胞中的表达.此外,我们还发现单核细胞与低浓度oxLDL(25mg/L)共孵育后CD147蛋白及mRNA表达上调,但此后随着oxLDL浓度的增加,泡沫细胞表面CD147分子逐渐减少,而在此过程中其mRNA水平则保持不变.推测这可能是由于CD147分子从泡沫细胞膜表面脱落所致.这些假设还需要在今后的实验中进一步研究.长期慢性炎症可导致机体内一些免疫分子及细胞因子的水平明显升高,不但可调节机体免疫反应,而且能够作用于外周组织加速动脉粥样硬化的发展[2,1213].如类风湿关节炎、红斑狼疮等.但免疫分子、炎症因子等炎性介质促进动脉粥样硬化发生的其机制目前尚不甚清楚.我们通过研究CD147,VEGF在单核细胞来源的泡沫细胞中的表达的变化,推测其表达可能通过与oxLDL的浓度时间依赖关系,从而发挥其生物学功能.充分认识这些机制将有助于进一步阐明炎性介质在动脉粥样硬化中的发病机制.【参考文献】[1]HanssonGK,RobertsonAK,SderbergNauclérC.Inflammationandatherosclerosis[J].AnnuRevPathol,2006,1297329.[2]ChoudhuryRP,LeeJM,GreavesDR.MechanismsofDiseasemacrophagederivedfoamcellsemergingastherapeutictargets[J].NatClinPractCardiovascMed,2005,26309315.[3]AbouRayaS,AbouRayaA,NaimA,etal.Chronicinflammatoryautoimmunedisordersandatherosclerosis[J].AnnNYAcadSci,2007,11075667.[4]NaveedS,DavidW,McCareyDW,etal.ExplainingHowHighGradeSystemicInflammationAcceleratesVascularRiskinRheumatoidArthritis[J].Circulation,2003,1082957.[5]CellettiFL,WanghJM,AmabilePG,etal.Vascularendothelialgrowthfactorenhancesatheroscteroticplagueprogression[J],NatMed,2001,74425429.[6]MajorTC,LiangL.Extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer(EMMPRIN)isinduceduponmonocytedifferentiationandisexpressedinhumanatheroma[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2002,2212001207.[7]李全忠,杨永宗,易光辉,等.U937泡沫细胞模型的建立[J].动脉粥样硬化杂志,1999,72152154.[8]KaplanMJ.Cardiovasculardiseaseinrheumatoidarthritis[J].CurrOpinRheumatol,18289297.[9]YoungYW,KuonHM,HwangKC,etal.UpstreamregulationofmatrixmetalloproteinasebyEMMPRINextracellularmatrixmetalloproteinaseinducerinadvancedatheroscleroticplaque[J].Atherosclerosis,2005,1803744.[10]GabisonEE,HoangxuanT,MauridA,etal.EMMPRIN/CD147,anMMPmodulatorincancer,developmentandtissuerepair[J].Biochimie,2005,87361368.[11]InoueM,ItohH,VedQM,etal.ProgressionofAtherosclerosisAtheroscleroticLesionsPossiblePathophysiologicalSignificanceofVEGFinVascularEndothelialGrowthFactor(VEGF)ExpressioninHumanCoronary[J].Circulation,19989821082116.[12]MongM,TohL,WilsonA,etal.Reducedarterialelasticityinrheumatoidarthritisandtherelationshiptovasculardiseasesriskfactorsandinflammation[J].ArthritisRheum,2003,488189.[13]寿涛,李芹,林俊,等.类风湿关节炎患者血管内皮功能研究,2006,10(9)558560.编辑黄良田
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abingge上传于2013-12-18

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