β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定.doc

半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定作者：邱文洪吴丽娜叶许楚娟易路阳郭凯文【摘要】目的：构建半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法：通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆半乳糖苷结合凝集素9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果：DNA测序和酶切鉴定证明半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论：成功构建半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。【关键词】Gal9；构建；真核表达载体半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员参与了许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1，2。半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于半乳糖凝集素家族(galectinfamily)成员，组织分布广泛，在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面，发挥着重要作用3。目前对Gal9发挥作用的具体机制仍知之甚少，值得进一步深入探讨和研究，从而使Gal9作为疾病治疗的新的靶点成为可能。为此，本研究拟通过构建表达人Gal9蛋白的真核表达载体，为进一步研究Gal9的作用机制打下基础。1材料和方法1.1材料T4连接酶、限制性内切酶(MBI)，Taq酶和RT试剂盒(Promega)，RNA提取试剂盒(Invitrogen)，质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，DNAmarker(Tiangen)，Trizol、1640培养基，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。1.2引物设计参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物:P15CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA3，下游引物:P25CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC3，下划线分别为Hind和EcoR酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176bp。1.3分离人外周血单个核细胞静脉取血，加入肝素溶液(1050u/m1血样本)抗凝，用pH7.2Hanks液将抗凝血稀释1倍；吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中，加入稀释的全血；2000r/min离心20min；吸取所有单个核细胞，用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。1.4单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1(+)将离心收集的单个核细胞1105加入Trizol1mL，混匀，室温5min；加0.2mL氯仿，涡旋15s，412000g，离心10min，吸取上清液至另一1.5mLEppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，放置10min，412000g，离心10min，去上清液，加入1mL预冷的浓度为750mL/L乙醇，充分混匀振荡，412000g，离心10min，去上清液，充分干燥，用50L含1mL/LDEPC的ddH2O溶解沉淀，获得细胞总RNA。取5L总RNA，按RTPCR试剂盒推荐方法以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2l逆转录产物为模板,加入10mMdNTP1.5ml,10PCR缓冲液5m,l50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,lPCR反应条件为:95预变性5min，94变性15s，55退火30s，72延伸1min，反应30个循环后，72延伸10min。取PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照WizardPCR产物纯化试剂盒说明书纯化，回收PCR产物，经Hind和EcoR双酶切，定向插入表达载体pcDNA3.1(+)的相应位点。该质粒命名为pGal9，经PCR、Hind和EcoR双酶切及测序鉴定序列的正确性。1.5统计学方法采用Prism4.0软件行单因素方差分析，以及组间比较。P<；0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Gal9的RTPCR扩增从单个核细胞中提取细胞总RNA，以此为模板，应用前述引物进行RTPCR，将扩增产物于10g/L琼脂糖电泳中，可见分布于Marker1.01.5kb的特异条带，与预计长度1176bp相符(图1)。2.2真核质粒pGal9构建和鉴定将RTPCR扩增产物，经Hind和EcoR双酶切后，克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序，同时进一步对阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行PCR，可扩增出与预计长度1176bp相符的目的片段，而空载体则为阴性结果(图2A)。阳性重组质粒经Hind和EcoR双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段(图2B)。测序结果表明，PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致(结果未附)。1Marker；2RTPCRproductofGal9gene图1RTPCR扩增Gal9基因CDS序列APCRanalysis：1Marker；2PCRproductofpGal9；3PCRproductofpcDNA3.1(+)；BDoublerestrictionenzymedigestionanalysis：1Marker；2pcDNA3.1(+)dynamitindigestedwithHindandEcoR；3pGal9dynamitindigestedwithHindandEcoR。图2真核表达质粒pGal9的PCR和双酶切鉴定3讨论半乳糖凝集素家族(galectinfamily)是含有一个保守糖识别域的半乳糖苷结合凝集素。半乳糖凝集素家族有15名成员，广泛参与许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1,2。半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于alectin家族成员，组织分布广泛，具有多种生物学活性，参与细胞聚集和粘附、增殖、死亡和调节炎症及免疫反应等多种生理和病理过程3。为进一步研究Gal9的作用机制，我们通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆Gal9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建了包含Gal9基因的真核表达载体pGal9。为鉴定真核表达载体pGal9，以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行PCR，证明获得的真核表达载体pGal9可扩增出与预计长度1176bp相符的目的片段，而空载体则未见PCR扩增产物。获得的真核表达载体pGal9经Hind和EcoR双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段。测序结果证明，PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致。通过上述实验可以证明我们成功构建并获得了包含Gal9目的基因的真核表达载体pGal9。在Gal9当初被发现时，引人注意的是ECA活性4，然而随着研究的不断深入，Gal9越来越多的生物学功能被人们所了解，这使得人们对Gal9乃至整个galectin家族的兴趣日益浓厚。研究发现，Gal9通过诱导Th1细胞凋亡，抑制Th17细胞的产生，增加调节性T细胞的生成，来改善小鼠自身免疫性疾病模型的严重性，如实验性脑脊髓炎(EAE)5和胶原性关节炎(CIA)6。相信今后的免疫学研究方向不仅关注于galectin家族的其他成员，还将对Gal9发挥作用的具体机制，尤其是对免疫系统的影响作进一步深入探讨，从而使Gal9作为免疫病理性疾病治疗的新的靶点成为可能。综上所述，我们成功克隆了能够正确表达Gal9目的基因的真核表达载体pGal9，为进一步研究的Gal9功能提供方便，并为进一步探讨Gal9对免疫系统的影响奠定了基础。【参考文献】1ElolaMT,WolfensteinTodelC,TroncosoMF,VastaGR,RabinovichGA.Galectins:matricellularglycanbindingproteinslinkingcelladhesion,migration,andsurvival.CellMolLifeSci,2007，64:1679700.2HasanSS,AshrafGM,BanuN.Galectinspotentialtargetsforcancertherapy.CancerLett,2007，253:2533.3HirashimaM,KashioY,NishiN,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalconditions.GlycoconjJ,2004，19:593600.4MitsuomiHirashima,YumikoKashio,NozomuNishi,etal.Galectin9inphysiologicalandpathologicalConditions.Glycoconjugate,2004，19:593600.5AndersonAC,AndersonDE,BregoliL,etal.PromotionoftissueinflammationbytheimmunereceptorTim3expressedoninnateimmunecells.Sci