激素性股骨头坏死中医病机学实验研究.pdf

论著激素性股骨头坏死中医病机学实验研究赵万军1肖鲁伟2周辉1韩勇1童培建3吴承亮2(1.浙江中医学院附属第二医院浙江杭州310007；2.浙江中医学院；3.浙江中医学院附属医院)摘要目的:探讨激素诱导的股骨头坏死中医发病机理。方法:用外源性糖皮质激素(醋酸氢化泼尼松)诱导家兔股骨头坏死模型为对象,33只雄兔随机分为三组,对照组、模型组、模型+右归饮组(右归饮组),动态观察下丘脑垂体肾上腺皮质(HPA)轴形态和功能,以及性激素水平变化。结果:模型组HPA轴出现形态萎缩功能抑制状态,表现为垂体、肾上腺重量减轻(P0.01),垂体前叶ACTH细胞减少及血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)含量降低(P0.05),肾上腺皮质萎缩及血浆皮质醇(CORT)降低(P0.01)。性激素水平紊乱,表现为雌二醇(E2)升高(P0.01),睾酮(T)降低(P0.05),E2T明显紊乱升高(P0.01)。右归饮能有效拮抗激素诱导的股骨头坏死HPA轴从形态到功能的抑制状态,纠正性激素水平的紊乱。结论:激素诱导的股骨头坏死中医病机学属于肾阳虚证。关键词股骨头坏死激素肾阳虚股骨头坏死中医药疗法右归饮治疗应用中图分类号:R681.8文献标识码:A文章编号:1005-0205(2005)02-0023-05ExperimentalResearchoftheTCMPathogenesisintheSteriod-inducedFemoralHeadofNecrosisZhaoWanjun,XiaoLuwei,ZhouHui,etalDepartmentofOrthopaedics,theSecondAffiliatedHosptial,ZhejiangCollegeofTCM,Hangzhou310007ABSTRACTObjective:AnexperimentalmodelofSteroid-inducedAvascularNecrosisoftheFemoralHead(ANFM)wasestablishedtoinvestigatetheTCMPathogenesis.Methods:33rabbitswerepeformedmodeltheregroups.INFHrabbitmodelwasestablishedbyinjectingHydroprednison.AsanexactinducatorfortheHypothalamic-Pituitary-Adrenal(HPA)axisandthelevelofsexhormone.Results:BoththemorphologyandthefunctionoftheHPAaxiswereinhibitedsignificantlyinINFHrabbits:PituitaryandAdrenalweightdecreased(P0.05),adrenalcortexwasatrophywiththeamountofplasmaCORTdecreaded(P0.01).Thelevelofsexhormonedisordered:E2increaded(P0.01).Tdecreaded(P0.05)andE2Tsignificantlyincreased.AfteradministeredYouGui(YG)totheexperimentalgroup,itwasfoundthatYGantagonisedtheinhibitionoftheHPAaxis,alterthedisorderedsexhormone.Conclusions:Inthisexperiment,INFHbelongedtothesymptomofDeficiencyofKidney-Yang.KEYWORDSAvascularnecrosisoffemourheadsteroidDeficiencyofkidney-yangAvascularnecrosisoffemourheadtherapyTCMYouGuiYingTheraputicusefeaturesinsteroidandnonsteroidassociatedosteonecrosis.ClinOrthop,1999,(368):149161收稿日期:2004-08-09基金项目:国家中医药管理局立项课题,并获浙江省中医药科学技术创新一等奖作者简介:赵万军(1967-),男(汉族),宁夏平罗人,副主任医师。2SaitoS,InoueA,OnoK,etal.Intramedullaryhaemorrhageasapossiblecauseofavascularnecrosisofthefemoralhead.Thehistologyof16femoralheadsatthesilentstage.JBoneJointSurgBr,1987,69(3)L3463513漆德芳.肝硬化.北京科技出版社,2001,3254FicatRP.Idiopathicbonenecrosisofthefemoralhead:earlydiagnosisandtreatmentbone.JointSurg(Br),1995,42:1405141132中国中医骨伤科杂志2005年4月第13卷第2期我们用实验的方法探讨激素所致的股骨头坏死的中医发病机理,及采用温补肾阳法预防激素性股骨头坏死,试图从神经内分泌学角度,选择下丘脑垂体肾上腺皮质(HPA)轴和性激素水平变化做为观察指标,探讨它们之间关系,以期为温补肾阳法防治激素性股骨头坏死提供实验依据,并为肾主骨理论提供实验证据。材料与方法1动物的选择、模型及右归饮的制备33只健康成年中国大耳白色雄性家兔,由浙江中医学院实验动物中心提供,体重平均2.51kg,室温221,光照与黑暗时间为每12小时更替,单笼饲养,期间给家兔标准颗粒饲料(浙江中医学院实验动物中心提供)及自由饮水。模型方法:按8mgkg剂量,每周一次臀肌注射醋酸氢化泼尼松(浙江仙居制药股份有限公司,浙卫药准(1993)1853-1),每只兔臀肌注射均在上午8:0010:00,每次注射激素时必须重新称重和计算激素用量。同时每周2次臀肌注射青霉素8万u,预防感染,到第9周结束,制备典型的骨坏死动物模型。右归饮的制备:全方由熟地18g、山药18g、山茱萸12g、构杞18g、仙灵脾18g、制附子6g、肉桂6g、甘草6g组成。根据文献中人兔用药剂量换算方法计算用药量,4保存备用。2分组及给药造模前先适应观察1周,33只雄兔随机分为三组。正常对照组10只；模型组12只；模型+右归饮组(简称右归饮组)11只。三组实验动物实验时间为9周。正常对照组:每周3次等体积生理盐水臀肌注射,同时以4mlkg蒸馏水灌胃。模型组:模型方法同上,同时以蒸馏水4mlkg灌胃,每天1次。右归饮组:造模方法同模型组,同时按4mlkg右归饮灌胃,每天1次。3标本制备实验动物于第4周、第9周,分别快速兔耳缘静脉抽血,肝素抗凝分离血浆,236冰箱保存。所有实验动物于第9周空气栓塞快速致死。取新鲜垂体、右侧肾上腺、股骨头,所有组织标本都固定在Boine液中,分离包膜,4过夜。4一般项目观察连续观察三组动物毛发光泽度、精神(眼神)、呼吸、活动状态、饮食、睡眠、二便。5解剖形态学观察垂体、肾上腺称重:细致、干净剥离垂体、右侧肾上腺。将固定12小时的垂体、右侧肾上腺滤纸吸干,MP120-2型电子天平称重。光镜观察:垂体、右侧肾上腺标本,Boine液固定,按常规脱水、透明、包埋、石蜡切片,厚约34Lm,依次置10张载玻片上,每组取相同序号做HE染色。将模型组股骨头冠状面剖开,Boine液固定2天,PlankRychdo液脱钙,系列酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,重型切片机切片7Lm,HE染色。6放射免疫检测快速兔耳缘静脉抽血8ml,肝素抗凝,800型离心沉淀器旋转30min分离血浆,取血浆4ml,236冰箱保存。125I2ACTH(DoubleAnilbody)放射免疫检测药盒、125I2CORT(Coat-A-CountContisol)放射免疫检测药盒、睾酮(Testosterone)放射免疫试剂盒(包被-抗体-计数)、雌二醇(Estradiol)放射免疫试剂盒(包被-抗体-计数),均由天津德普生物技术和医学产品有限公司提供(美国DPC公司生产),按药盒说明书近行检测ACTH、CORT、E2、T的浓度。7统计描述组内各项数据的比较采用重复测量的两因素统计方差分析及q检验；组间比较t检验。结果1模型组股骨头坏死组织病理学表现模型组表现为股骨头坏死的组织病理学证据:骨皮质变薄,骨小梁稀疏、变细、萎缩,骨髓腔扩大,常被脂肪组织代替,造血细胞明显减少,股骨头软骨下区骨细胞核边聚、固缩、核深染,有些核消失而使骨陷窝空虚增加。2一般项目观察正常对照组:眼睛明亮、眼角干燥、毛色光滑、行动活泼、鼻孔无粘液、粪便正常,增重26.41%。模型组:模型组第4周后出现畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、活动迟缓、食欲下降、消瘦、体毛干枯脱落、嗜睡等一系列类似肾阳虚的症状表现。诸症随给药天数的增加而加重,至第9周时更加明显,伴小便清长、大便溏薄,严重者甚至死亡,增重220%。右归饮组:食欲基本正常,偶有消瘦,无体毛干枯脱落,无竖毛现象,反应较灵活,大小便基本正常,增重24.3%。肛温变化:三组兔肛温前后变化分别为0.580.08、21.080.03、0.290.01。对照组肛温在正常范围内波动(38.539.7,平均39),模型组造模9周后肛温下降1,与对照组比较差异非常显著(P0.01)。右归饮组的肛温在正常范围内波动,与模型组比较差异非常显42ChineseJTradMedTraum&Orthop,April2005,Vol.13,No.2著(P0.01)(表1)。表1三组兔肛温变化(xqs)组别用药前用药后9周前后变化对照组39.10.27(n=10)39.70.35(n=10)0.580.08模型组39.20.25(n=12)38.10.22(n=8)3321.080.03右归饮组39.00.22(n=11)39.30.21(n=9)0.290.01注:与对照组比较:33P0.01；与模型组比较:P0.013下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴形态和功能变化3.1三组兔第9周垂体、肾上腺重量的变化模型组垂体、肾上腺明显减轻,与对照组比较差异非常显著(P0.01)。右归饮组的垂体、肾上腺较模型组重量增加明显(P0.05或P0.01)(表2)。表2三组兔第9周垂体、肾上腺重量变化(xqs)(mg)组别例数垂体肾上腺对照组1037.526.72158.516.74模型组828.064.283370.5413.2133右归饮组932.815.26143.418.32注:与对照组比较:33P0.01；与模型组比较:P0.05,P0.013.2三组兔下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴形态学变化正常组垂体、肾上腺形态正常肾上腺三个带(球状带、束状带、网状带)界线清楚,束状带细胞条索状排列较规则,细胞染色均匀。模型组肉眼观察:垂体、肾上腺体积缩小,色变深或带褐色,包膜由于纤维组织增生而稍厚。光镜观察:垂体、肾上腺明显萎缩,垂体前叶ACTH细胞数明显减少,胞体变小,染色变淡。肾上腺皮质萎缩,肾上腺束状带明显萎缩,表现为实质细胞体积变小和数量减少,萎缩的细胞仍保持原形,但排列较紊乱,胞浆往往比较浓染,核也浓缩深染。右归饮组的上述病理变化较模型组轻,萎缩的肾上腺得到改善,束状带细胞排列较整齐,少部分细胞核仍深染、浓缩,大部分恢复正常。3.3三组兔第4周、第9周血浆CORT及ACTH水平的变化模型组第4周血浆CORT及ACTH较对照组降低显著(P0.05或P0.05)(表3)。模型组、右归饮组第9周血浆CORT、ACTH较第4周下降。模型组CORT、ACTH水平较对照组下降显著(P0.05或P0.01)。右归饮组较模型组水平上升显著(P0.05)(表4)。表3三组兔第4周血浆CORT及ACTH水平变化(xqs)组别例数CORT(Lgdl)ACTH(pgml)对照组1029.38.4181.048.5模型组118.073.983332.125.13右归饮组108.064.2460.940.4注:与对照组比较:3P0.05,33P0.01表4三组兔第9周血浆CORT及ACTH水平变化(xqs)组别例数CORT(Lgdl)ACTH(pgml)对照组1030.39.4482.350.1模型组83.901.323327.922.43右归饮组95.321.6758.227.8注:与对照组比较:3P0.05,33P0.01；与模型组比较,P0.054血浆性激素(E2、T)水平变化模型组第4周E2水平均较对照组升高明显(P0.01)；右归饮组E2水平较模型低,两者比较无显著差异。模型组T水平较对照组降低明显(P0.01)。右归饮组T水平较模型组升高明显(P0.05)。模型组E2T比较对照组明显升高紊乱(P0.001)。右归饮组E2T较模型组降低明显(P0.05)(表5)。模型组第9周E2较对照组升高明显(P0.01)；右归饮组E2较模型组升高明显(P0.01)。模型组第9周E2水平较第4周降低。模型组第9周T较对照组降低明显(P0.05)；右归饮组T水平较模型组升高明显(P0.05)；第9周模型组、右归饮组T水平总体比第4周的T水平上升,以右归饮组更明显。模型组第9周E2T较对照组升高明显(P0.01)；右归饮组E2T较模型组略下降,两者比较无显著性差异；第9周模型组、右归饮组E2T均较第4周降低,以模型组为甚(表6)。52中国中医骨伤科杂志2005年4月第13卷第2期表5三组成年雄兔第4周E2、T水平变化(xqs)组别例数E2(nmolL)T(nmol)E2T(X1000)对照组100.0430.02214.63.712.9452.853模型组110.2030.084330.9310.647333218.05129.83333右归饮组871.51673.4440.73注:与对照组比较:33P0.01,333P0.001；与模型组比较,P0.05表6三组成年雄兔第9周E2、T水平变化(xqs)组别例数E2(nmolL)T(nmol)E2T(X1000)对照组100.0690.02512.658.815.4552.837模型组80.1290.05333.033.08342.5716.2333右归饮组90.3460.198.554.2840.4724.44注:与对照组比较:3P0.05,33P0.01；与模型组比较,P0.05,P0.01讨论激素性股骨头缺血性坏死(Steroid,inducedAvascularNecrosisoftheFemoralHead)是一种发病机理未明,早期诊断困难,到后期严重危害人健康的疾病。因其病程长、预后差、致残率高,成为骨伤科治疗上的疑难重症。近年来,由于临床上激素的广泛、长期使用,导致股骨头坏死有上升趋势。除引起医生的高度警惕勿盲目滥用激素外,还需寻找一种有效的方法来防治本病的进一步发展。治疗上,现代医学根据不同分期采取对症治疗和手术治疗,疗效尚不满意。中医药在早期(、期)的防治上有其独特的优势,每年都有大量的中医药防治激素所致股骨头坏死的报道,但由于本病的病因病机复杂,导致目前临床上对本病辨证论治方法多样,各地疗效标准不统一,缺乏可比性,这给本病的预后判断和验证带来困难,因此很有必要研究本病的辨证论治规律,使证型、方药规范化,以便更好地指导临床。1模型动物出现畏寒倦卧、精神萎靡、反应迟钝、消瘦、体毛干枯脱落、嗜睡、伴小便清长、大便溏薄等一系列类似肾阳虚的症状表现,这些症状表现与全国中西医结合学会虚证专业组1制定的“肾阳虚”标准基本相同。模型动物死亡率33.3%,体重减轻20%,这是由于外源性糖皮质激素促使蛋白分解造成负氮平衡,故体质减弱。肛温下降1.08,表现出“阳虚必寒”的特点来。右归饮组的上述症状比模型组明显减轻。表现为食欲基本正常,偶有消瘦,无竖毛、无体毛干枯脱落、反应稍灵活,大小便基本正常等。动物死亡率18.2%,体重减轻4.3%(P0.01),肛温在正常范围内波动(P0.01)。说明温补肾阳的右归饮能够拮抗激素所致兔股骨头坏死体重减轻,能够拮抗激素所致兔股骨头坏死的虚寒症象。2下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴形态和功能变化分析下丘脑分泌CRF(促肾上腺皮质激素释放因子)对垂体分泌ACTH有很强的刺激作用,ACTH可以通过受体CAMP系统促进皮质类固醇激素的合成。CORT是肾上腺皮质分泌的三种激素中最为重要的一种,它能促进蛋白质合成、调节水、盐代谢,影响细胞的代谢与功能等一系列生理功能。同时它具有负反馈调节机制,当血浆皮质醇浓度增高,可抑制FCR-ACTH的分泌2。这样下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴组成一个极为有效、又很灵活的机能轴,在调节机体多种机能、维持内环境的相对稳定方面发挥重要作用。中医认为肾为先天之本,藏有人体真阴、真阳。人体的生长、发育均靠肾气的推动,肾中精气盛衰与人体的生、长、壮、老密切相关,因此反映肾阳虚本质的指标应多从神经、内分泌方面寻找。本实验结果表明:激素诱导的股骨头坏死模型动物表现为HPA轴形态萎缩、功能抑制。模型动物表现为垂体、肾上腺重量减轻(P0.01),光镜观察垂体、肾上腺细胞形态明显萎缩；第4周、第9周CORT、ACTH水平均降低(P0.05,或P0.01),表明此时的HPA轴处于全面抑制状态。第9周的CORT、ACTH水平较第4周的更低,说明随着外源性糖皮质激素给药时间的延长,能加重HPA轴的受抑制程度。模型组CORT、ACTH水平降低,是由于一定量的外源性糖皮质激素使垂体前叶的ACTH释放量迅速受到抑制；从而使肾上腺皮质类固醇释放量也减少；肾上腺皮质萎缩3。温补肾阳的右归饮第9周能拮抗HPA轴的抑制状态,使CORT、ACTH水平升高62ChineseJTradMedTraum&Orthop,April2005,Vol.13,No.2(P0.05)。表现为垂体、肾上腺重量增加(P0.05或P0.01)；右归饮第4周未能拮抗HPA轴的抑制状态,这可能是由于第4周造模时间短,动物模型未能表现出“肾阳虚”症状,温补肾阳的右归饮未能表现出药效。至第9周,模型动物才表现出“肾阳虚”症状,温补肾阳右归饮才表现出药效来。从以药验证角度看,激素诱导的股骨头坏死辨证属“肾阳虚”证,而且随外源性糖皮质激素用药时间的延长,肾阳虚症状也越明显。本实验研究结果与上海医科大学沈自尹院士研究肾阳虚结果相似。他们认为:肾阳虚与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴、甲状腺轴、性腺轴有关,即肾阳虚具有不同靶腺轴、不同环节、不同程度的功能抑制或紊乱,其发病的主要环节在下丘脑(或更高中枢)4。他们5还认为下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴从形态到功能抑制即为肾阳虚模型,肾阳虚时性激素水平紊乱。3性激素水平变化分析糖皮质激素(GC)通过两种方式影响性腺功能6,即一方面控制垂体促性腺激素的分泌和直接抑制卵巢、睾丸的功能。体外细胞培养显示:GC可抑制促卵泡激素(FSH)诱导的雌激素和睾酮的产生、减弱黄体生成素释放激素(LH)引起的黄体生成素的分泌；另一方面,GC尚可通过抑制ACTH和使肾上腺皮质萎缩,使肾上腺产生雄烷二酮的量减少,使循环血中雄烷二酮和雌二醇水平降低7。其中GC抑制ACTH和使肾上腺皮质萎缩与我们的实验结果一致,但循环血中E2水平降低则与我们的实验结果不符,至于其机理有待进一步探讨。本实验结果显示:总体趋势上E2升高,T降低。模型组E2升高(P0.01),而T降低(P0.05或P0.001),E2T紊乱升高(P0.01)。温补肾阳的植物药右归饮能使E2,T均升高(P0.05),能拮抗紊乱升高的E2T,使之趋向恢复平衡(P0.05)。本实验结果与上海医科大学的王文健8、张新民9的观察结果相似。他们认为肾阳虚的E2水平上升,T下降,温补肾阳中药能明显提高男性老年人血浆T的水平。从上述实验结果分析表明,激素诱导的股骨头坏死与肾阳虚证之间密切相关,理由是:具有肾阳虚证的主要症状表现。动物出现畏寒倦卧,精神萎靡、反应迟钝、消瘦、体毛干枯脱落、嗜睡