证候蛋白质组学与中医证候学相关性探讨.pdf

中国中西医结合杂志2006年4月第26卷第4期CJITWM,April2006,Vol.26,No.4学术探讨证候蛋白质组学与中医证候学相关性探讨申定珠李家邦蒋荣鑫凌江红摘要以蛋白质组学为代表的后基因组时代的到来，必然使分子生物学经历从局部观走向整体观、从线形思维走向复杂思维的转变。基于蛋白质组学的发展趋势，总结了近年来中医证候学研究方法，提倡用二维电泳及生物信息学方法鉴定不同的蛋白质。将蛋白质组学引入中医证候分类及证候演变规律的研究，对从分子流行病学水平来探讨中医学与蛋白质组学乃至现代分子生物学研究相结合都是必须的。而蛋白质组学与传统中医药在研究生命科学的思维方法上逐步趋于一致，相互渗透，说明在探讨复杂性生命现象时中西医两种医学相结合的必然性和重要性。关键词后基因组时代；证候；蛋白质组学；证候蛋白质组学ExplorationonCorrelationofSyndromeProteomicsandSyndromatologyofTCMSHENDing-zhu，LIJia-bang,JIANGRong-xin，etalInstituteofIntegrativeChineseandWesternMedicine，XiangyaHospital，Cen-tralSouthUniversity，Changsha(410008)AbstractTheadventofthePost-HumanGenomeProjectEra，representedbytheraisingofproteomics,wouldinevitablyleadtothechangeofmolecularbiologyfromtopicalviewtoholisticwithitsthoughtturningfromlineartocomplexmode.Basedontheproteomicsdevelopmentinrecentyears,theauthorssummarizedthemethodologyofTCMsyndromatologicresearch，advocatedinusingtwo-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE)andbioinformaticstoidentifydifferentproteins.ProteomicsshouldbeledintotheresearchofTCMsyndromecategorizationandtheruleofevolution，whichisnecessaryforresearchingtheintegrationoftheTCMstudywithproteomicsandevenwithmodernmolecularbiologybasedonmolecularepidemiologylevel.OwingtothegraduallydevelopedcoherenceandmutualpenetrationofproteomicsandTCMonthethinkingmethodinstudy-inglifescience，ithasdenotedthenecessityandimportanceofintegrationofTCMandWesternmedicineinin-vestigatingthecomplexvitallifephenomena.KeywordsPost-HumanGenomeProjectEra；syndrome；proteomics；syndromeproteomics人类基因组图初稿的公布，揭示了基因组的精细结构，无疑是人类科学发展史上的一个重要里程碑。但基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性，与生命现象的复杂性和多变性存在着巨大反差，使得人们对于生命活动的直接执行者一蛋白质的重要性有了更深刻的理解。当今生物学研究已经进人了在生物大分子整体水平上将不同研究技术与手段有机地结合，以攻克生物学难题的所谓后基因组时代，其核心任务集中体现在基因组学(geromics)以及蛋白质组学(proteomics)等新学科领域的研究中川。因此，要了解基因的全部功能，进而阐明有机体的遗传、进化、发育、生长、衰老和死亡作者单位:中南大学湘雅医院中西医结合研究所(长沙410008)通讯作者:申定珠，Tel:(0E-mail:shensanl3163.等问题，以及与人类健康和疾病相关的医学问题，就必须对基因功能的最终表达产物一蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面和深入的研究。由于蛋白质组的研究是揭示基因组功能的基本途径，而对于蛋白质组学的研究也就成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。为此，本文将从整体观角度就证候蛋白质学与中医证候学的相关性做一简要介绍。1蛋白质组及蛋白质组学1994年，澳大利亚学者Wilkins提出蛋白质组(proteome)的概念，指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。它具有整体性、动态性和系统性的特点，一方面强调蛋白质组是对应于一个基因组的全部蛋白质所构成的整体；另一方面，明确提出蛋白质组还是一个在时间和空间上都动态变化着的整体。在该整体中，通过其相互作用，蛋白质之间密切有序的联系在一起，形成多个子系统，进而实现蛋白质自中国中西医结合杂志2006年4月第26卷第4期CJITWM,April2006,Vol.26,No.4身特定的生理功能。蛋白质组学(proteomics)则是从整体的角度，分析细胞内动态变化着的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间相互作用和联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一门新的学科。由此可见，蛋白质组即是生命活动的执行体，生命个体的复杂性与功能性在于蛋白质组，且其形态上、功能上的重大差别关键也在于蛋白质组。2整体观于中医学与蛋白质组学中的协调统一中医学的发展是伴随着古代朴素唯物主义哲学的发展及临床经验的日积月累而逐渐发展起来的，它是从系统的、宏观的方面来把握生命科学的典型特征。而现代医学的发展始终是伴随着现代科学技术发展的步伐，目前已达到分子生物学、分子遗传水平，它是从微观方面揭示人体科学的本质特征，可见它们的发展路径似乎是截然不同的。然而，产生于20世纪90年代的蛋白质组学摈弃了过去那种对每个基因逐一研究的方式，从整个蛋白质组的层次来阐明“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质，具有鲜明的“整体性”。因此，只要我们具备了蛋白质组的概念，便不难或很自然地与中医学的整体观相联系。把疾病看成是整体协调受到干扰所致，而把治疗方案定位于整体协调的恢复。蛋白质组学从一个机体或一个组织、一个细胞等不同层次“整体”的蛋白质活动的角度来揭示和阐明证候形成与发展的基本规律，其理论与技术特点，以及其整体、动态性的核心思想，与中医学的“整体观”和“辨证观”等理论体系有着惊人的类似之处，而这种研究思路与中医整体观和中药多靶点整合调节的特点亦不谋而合，具有明显的中医特色。3中医证候学与证候蛋白质组学3.1中医证候学中医学理论的基本特点之一即是辨证论治，论治取决于辨证。中医的“证”是生命物质在疾病过程中具有时相性的本质的反映，“候”的原意则是用以说明事物变化的情状，即所谓病变的临床表现。由于中医学对于疾病的认识侧重于整体、宏观、司外揣内，重视疾病某阶段机体的整体状态，辨证论治也即是通过对疾病表现在外的征象，进而推测演绎疾病的病因、病性、病位，由此归纳出证的概念。中医的证候，一方面是由疾病的根本矛盾所决定的，另一方面则是由其他因素(如患者的体质强弱、居住地区、生活嗜好、思想情绪及合病、并病、失治、误治等情况)所引起。因此，证候是疾病过程中某一阶段机体对内外致病因素的综合反应，在宏观上表现为特定的症状、体征及舌脉的组合；证候具有整体性，包括了体质特征、脏腑经络气血、阴阳等的失衡及相互间的关系，它反映了疾病的病因、病机及正邪斗争的概括和趋势；证候亦具有时相性，即动态变化的特点。“证候”说明了中医学是通过观察患者的异常表现来把握疾病本质的。3.2证候蛋白质组学在证候理论指导下，运用功能蛋白质组学的方法，通过探讨证候，特别是同病异证或异病同证的蛋白质差异表达及翻译后的修饰情况，揭示与某一证候形成相关的所有蛋白质及其特征，在整体蛋白质表达的水平上阐明证候的本质，则可称为证候蛋白质组学。中医证候学与证候蛋白质组学在探讨生命本质方面是一致的，从哲学的角度讲，两者讨论的都是非线形问题。中医学非常重视人体的统一性和完整性及其与自然界的相互关系，构成人体的各个组成部分之间，在结构上是不可分割的，在功能上是相互协调、相互为用的，在病理上是相互影响的，医学研究必须克服人为地割裂人体局部和整体的关系，避免把局部孤立化、绝对化，并在不干扰人体生命正常活动的情况下进行研究。中医学认为正常的生理和心理活动过程是机体内部及其内外环境的相对平衡和协调，疾病的发生发展则是致病因素作用下机体内部及内外环境相互关系的失调，针对证候是疾病发展过程中某一阶段的病理变化实质的概括，我们认为证本质是中西医结合研究最为重要的攻克对象。从中西医结合医学的角度，中医证本质的含义可以认为是引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的发生发展的动态变化过程，是在证的发生发展过程中产生的特殊物质川。正是基于证有明显的整体性，而蛋白质组研究亦是从整体水平上反应疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，所以这与中医辨证论治的认识方法有着极大的相似性。4证候蛋白质组学的研究方法及应用4.1研究方法由于证候是致病因子与体质因素相互作用的综合反应，这种综合反应的过程具有一定的物质基础，故而用现代科技手段和方法来揭示其物质基础并进行定量和定性，对证候及辨证的规范化具有十分重要的意义。尽管蛋白质组概念于1994年首次提出，但它的研究可以追溯到20多年前OFar-rely”创建的蛋白质高分辨双向凝胶电泳(two-dimen-sionalgelelectrophoresis,2-DE).OFarrell对大肠杆菌细胞抽提物双向电泳后，分离到1100个蛋白质组分，从此拉开了蛋白质组研究的序幕。目前，具有28年历史的双向凝胶电泳仍是蛋白质组学研究的核心技术。同时，生物质谱技术(bio-mass-spectrometry)以其极高中国中西医结合杂志2006年4月第26卷第4期CITWM,April2006,Vol.26,No.4的灵敏度和对结果的迅速获得使它成为蛋白质鉴定分析的主要支撑技术。蛋白质组的研究流程大体可分为分离、鉴定、分析三步闭，即先从组织或细胞提取蛋白质，进行双向电泳实现蛋白质的分离，含多种蛋白质的样品展开成为有近千个蛋白质点的繁星图；然后进行蛋白质样品显色，对不同疾病、不同证候的蛋白质与对照样品进行比较，寻找具有统计学意义和丰度差异的蛋白点，切下待分析的蛋白质斑点，胰蛋白酶胶内消化；接着，对消化后得到的多肚片段进行生物质谱分析测定，得到肤指纹图谱；最后，数据库检索对蛋白质进行鉴定及功能分析，利用生物信息学的方法进行比较研究。在此基础上，发现疾病的相关蛋白和具有重要应用前景的生物标记分子，研究疾病的病理机制，进而建立疾病的早期诊断和治疗监测方法。4.2方法应用以中西医结合治疗消化性溃疡为例，笔者认为其“证”具有相对稳定性，常见病因为情志不舒和饮食所伤，“木郁土虚”乃其共同病理变化，这就从病因、定位、定性上奠定了消化性溃疡“证”的定型性的基础，便于进行临床研究。但是，由于体质有强弱，脏腑素察有区别，体内有“留饮”、“癖血”、“瘤疾”、“故邪”之异，对证的个体反应各不相同。气候、地理环境、年龄、性别诸因素也会影响证表现的差异。同时，由于病变可以发生渐变、传变或突变，因此，尽管病因、病位、病性基本相同，消化性溃疡还是可能出现不同的类型，临床多分为肝郁脾虚、肝胃不和、气滞血疲型等。在我们承担的国家三类新药健胃愈疡片和国家四类新药健胃愈疡颗粒的系列临床、实验研究中，发现其对消化性溃疡中肝郁脾虚、肝胃不和型疗效明显。从前期分子生物学角度的研究揭示:MK,Bcl-2,Bax,Fas/FasL,hTFF1、EGFR,HGF,EGF,VEGF,PDGF等一系列细胞因子参与了溃疡的愈合过程。同时，影响消化性溃疡复发的重要因素一溃疡愈合质量(QOUH)也与各种细胞因子的活动密切相关。从蛋白质组水平研究消化性溃疡，最终确立消化性溃疡证候蛋白质组学的分类标准，探讨其演变规律，并进一步研究中药制剂健胃愈疡片及健胃愈疡颗粒治疗消化性溃疡之肝郁脾虚、肝胃不和型及其兼夹证的分子机理，深层次探讨溃疡相关蛋白质表达谱的变化，深人了解消化性溃疡的发生发展及复发机制，为新药开发提供理论基础。可见，对于消化性溃疡中医证型的划分具有一定的物质基础。笔者归纳消化性溃疡的中医证候流行病学情况时，分析了消化性溃疡之胃溃疡、十二指肠溃疡之间的证候演变规律，确立了消化性溃疡的证候标准与证候演变趋势。5问题及展望由于中医的证候是宏观、综合性的全身评价，中医证候所涉及的范围往往遍及机体的多脏腑、组织或功能系统，该特点不仅大大增加了研究的难度与复杂性，而且由于宏观与微观看待问题角度上的极大差异，极微观的证候学很难体现证候的本质。同时，由于人类对自身理解的限制、实验条件及伦理学的制约，使得中医证候蛋白质组学的研究面临采样困难和样品是否具有代表性两大难点。此外，由于蛋白质组学的研究往往可获得成千上万的数据，能否恰当地对其进行处理和分析，是目前研究的另一难点。借助于强有力的蛋白质组学理论与技术支撑，创新性发展我国传统中医药学的优势，这既是机会，也是挑战。,急之，现代生物学的发展历程是从局部走向整体，从简单线形思维走向复杂思维，特别是从蛋白质组学的整个动态发展反映出传统中医药学与其在研究生命科学的思维方法上越来越趋于统一，且相互渗透，说明在探讨复杂生命现象时中西医两