siRNA 沉默人类血红素敏感基因1 对膀胱癌T24 细胞的影响.doc

siRNA沉默人类血红素敏感基因1对膀胱癌T24细胞的影响汤磊1李瑞晓于垂恭袁建林武国军#汤磊：第四军医大学，西京医院泌尿外科，硕士研究生，710032，email：李瑞晓：第四军医大学，西京医院泌尿外科，硕士研究生，710032于垂恭：第四军医大学，西京医院泌尿外科，博士研究生，710032袁建林：第四军医大学，西京医院泌尿外科，医学博士，科室主任，博士生导师，710032武国军：第四军医大学，西京医院泌尿外科，医学博士，科室副主任，硕士生导师，710032email：siRNA沉默人类血红素敏感基因1对膀胱癌T24细胞的影响汤磊1李瑞晓于垂恭袁建林武国军#1第四军医大学西京医院泌尿外科，710032()#第四军医大学西京医院泌尿外科，710032（）摘要目的观察人类血红素敏感基因1（HRG-1）基因在膀胱正常组织和膀胱肿瘤组织中的表达情况，通过RNA干扰技术抑制HRG-1在膀胱癌T24细胞表达水平，观察生长增殖的变化。方法应用免疫组化SP法检测85例膀胱肿瘤（膀胱乳头状瘤25，低级别膀胱癌30，高级别膀胱癌30）和20例膀胱正常组织石蜡标本中HRG-1表达情况，并进行相关临床病理分析。设计针对HRG-1基因的siRNA，转染膀胱癌T24细胞，应用免疫印迹法和RT-PCR分析HRG-1siRNA的表达，MTT和流式细胞术（FCM）检测增殖凋亡的变化。结果正常膀胱组织和膀胱癌组织中HRG-1表达有显著性差异(P0.05)；HRG-1的阳性表达与膀胱肿瘤病例分级、临床分期之间有显著性差异(P0.05)；转染siRNA后，HRG-1表达水平下降，MTT和FCM检测发现，细胞增殖曲线受到抑制，HRG-1-siRNA组与空载体转染组及未转染组比较，细胞凋亡比例增加，差异均具有统计学意义(p0.01)。结论HRG-1基因可能参与了膀胱癌的发病，siRNA-HRG-1处理T24细胞后，细胞的增殖受到抑制，同时凋亡比例增加。关键词：膀胱肿瘤，人类血红素敏感基因，RNA干扰基因，细胞凋亡siRNAInterferenceofHRG-1onbladdercancerT24invitroTANGLei*，LIRui-xiaoYUChui-gong,YUANJian-lin,WUGuo-jun，eta1*DepartmentofUrology，XijingHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xian710032，ChinaCorrespondingauthor：WuGuo-jun(email:)AbstractObjectiveToobservetheHRG-1geneexpressionincarcinomaofurinarybladderandnormalurinarybladdertissues，andtoinvestigatetheeffectofHRG-1-siRNAontheproliferationandapoptosisofhumanbladdercancercellline.MethodsImmunohistochemistywasusedtodetecttheexpressionofHRG-1in85casesofbladdercarcinomaand20normalbladdertissues,andThesiRNAofHRG-1wasdesigned,synthesizedandtransfectedintobladdercancercelllineT24.ResultsTheHRG-1geneexpressionhadsignificantdifferencesbetweenbladdercarcinomaandnormalbladdertissues(p0.05)；HRG-1genepositiveexpressionhadmarkeddifferencesbetweenthepathologicalgradesandclinicalstagesofbladdercarcinoma(p0.05).AftertreatedwithsiRNA,theexpressionlevelofHRG-1proteinandHRG-1mRNAinT24cellsdecreasedobviously(p0.05).TheapoptosisrateofT24cellstransfectedwithHRG-1-siRNAwassignificantlydifferentfromControl-siRNAgroupandblankgroup(p80%为+。选取具有代表性视野采集图片。1.4细胞培养人膀胱癌细胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1均购买于中国科学院上海细胞库。膀胱癌细胞株T24、5637、BIU-87及人膀胱上皮细胞SV-HUC-11常规复苏后，在10%胎牛血清的1640培养液中培养，培养条件：在5%二氧化碳浓度、饱和湿度及37下进行。1.5蛋白印迹检测(Western-blot)蛋白裂解液提取细胞总蛋白。按BCA法进行总蛋白定量，取5ug蛋白质总量样品进行120g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后将凝胶转移到硝酸纤维膜(NC)膜上，丽春红染色观察转膜的效果，标记Marker的位置。5%脱脂牛奶室温封闭1h，鼠抗人HRG-1单克隆一抗、鼠抗人GAPDH多克隆一抗室温孵育1h，4过夜，选用荧光素标记的兔抗鼠二抗，室温孵育1h，然后使用计算机-荧光扫描仪系统对膜进行扫描，保存结果留待分析。1.6siRNA分析T24细胞常规接种于6孔板，用不含双抗的培养液培养，细胞长满60-80%后，通过脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)转染siRNA于T24细胞。siRNA-HRG-1（NM-017842），HRG-1-siRNA序列为：5-GUGGUCUCCCAGGAAGCUGUdTdT-3,5-ACAGCUUCCUGGGAGACCACdTdT-3，Control-siRNA序列为：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3,反义链为5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3。操作严格按照产品说明书操作。37孵育6h后，跟换培养液，继续孵育。通过RCR和western检测HRG-1基因沉默水平。1.7反转录PCR分析胰酶消化收集对数生长期的细胞，每1107细胞加1mlTrizol裂解液(TaKaRa公司)，其余步骤严格按产品说明书操作，提取的总RNA经紫外分光光度计定量后，逆转录成cDNA。逆转录产物用于聚合酶链反应(PCR)，引物合成与北京奥科公司合作完成，HRG-1引物序列为：5-ATGCCCACCGCTACCGGGCT-3。5-CTACACCTTGACCTCTTGAC-3，理论扩增长度360bp，GAPDH引物序列为：5-AGGTCCACCACTGACACGTT-3，5-GCCTCAAGATCATCAGCAAT-3。反应条件如下：HRG-1循环参数为95变性5min，9530S、5930S、7230S(35个循环)，727min；GADPH循环参数为95变性5min，9530S，5730S，7230s(30个循环),727min。各取30ulPCR反应液在10g/L琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙锭(EB)染色后照相。KodakDigitalScienceID软件系统扫描。1.8增殖凋亡检测MTT:收集对数生长期的细胞，包括siRNA处理的T24细胞（转染24h后），以1104/ml接种于96孔板中，每孔加入200ul，每板接种6个复孔，1640培养基培养。12h后选择一块，每孔加入20ul（5mg/ml）MTT试剂。37C孵育4h，弃上清，每孔加入150ulDMSO，震荡10min，490nm波长测吸光度值，取平均值；以后每隔12h，取出一块板，重复上述操作。FCM:将T24细胞以5105接种于6孔板中，siRNA处理24,48h后，收获细胞转移至离心管，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，无水乙醇固定，并设空白对照。然后用350ul结合缓冲液重悬细胞，每组处理细胞分别加入10ul碘化丙锭(PI)和凋亡检测试剂5ulAnnexinV-FITC(Bipec公司)，4下避光染色15min，上机检测。细胞周期凋亡分析采用美国BectonDiekinson公司的CellQuitPlot分析软件分析细胞增殖和凋亡的变化。1.9统计学处理采用SPSS170统计软件分析，采用了卡方检验、单因素方差分析及多样本两两比较采用SNK-q检验,以p0.05为差异有统计学意义。2结果2.1HRG-1基因在膀胱肿瘤组织和正常膀胱组织中的表达HRG-1的阳性反应物质主要在胞浆内。HRG-1在膀胱正常组织中的阳性表达率为25(5/20)，而在膀胱肿瘤组织中的阳性表达率为71.8(61/85)，两组表达率差异有统计学意义(X2=15.166，P0.001)，可认为HRG-1在膀胱肿瘤组织中阳性表达率高于膀胱正常组织(表1，图1)。HRG-1的表达水平与性别、年龄无相关性，与临床病理分级呈正相关（r=0.38，p0.01），也就是说，HRG-1的阳性表达强度随着肿瘤恶性程度的增高而加强（表2）。2.2HRG-1在不同膀胱癌细胞株的表达水平Western-blot结果显示：在蛋白的表达水平上，4种不同细胞株HRG-1都有表达，且3个膀胱癌细胞株中的表达均高于人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-11，3个膀胱癌细胞株中，以T24的HRG-1表达水平最高，而5637、BIU-87的表达水平相当且低于T24(图2)。2.3siRNA处理T24细胞株后，HRG-1基因表达水平检测测得最佳感染浓度和最佳感染时间为40nm，48h。HRG-1的mRNA和蛋白表达水平通过RT-PCR和western来检测。与空载体转染组和未转染组相比，HRG-1的表达水平通过siRNA处理后，表达下降。HRG-1-siRNA转染组与空载体转染对照组及未转染组T24细胞相比较，T24细胞中HRG-1蛋白水平和mRNA明显下降，差异均具有统计学意义(p0.05)(图3)。2.4siRNA处理T24细胞株后，对细胞增殖凋亡的影响T24细胞株转染24h后，MTT检测发现：siRNA处理T24细胞后，HRG-1-siRNA较其空载体组和空白组的细胞增殖受到明显抑制，差异有统计学意义（p0.01）（图4）。FCM检测发现：转染24h后，HRG-1-siRNA凋亡率为(12.872.04)%，对照组为(3.371.07)%，空白组为(3.340.88)%；48h后，HRG-1-siRNA凋亡率为(14.732.16)%，对照组为(3.670.94)%，空白组为(3.721.13)%。感染组细胞凋亡较对照组和空白组凋亡比例明显增加，差异有统计学意义（p0.01）,表明HRG-1-siRNA可促使T24细胞发生凋亡(图5)。3讨论膀胱癌是我国泌尿系肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，是继前列腺癌、肺癌、结肠癌之后，为男性高发恶性肿瘤第四位。在女性恶性肿瘤亦排在十位之后4。肉眼血尿是膀胱癌最常见的临床症状，尤其是出现间断性全程无痛血尿时应考虑到膀胱癌的可能。2001年Elbashir等首次把特异性的siRNA转入人癌细胞中，结果发现靶向蛋白的表达量比转染下降了90%5。近年来，siRNA的研究受到广泛的关注。HRG-1是人类溶质转运蛋白SLC家族的一个新成员，以前一直作为假定蛋白存在，其功能和作用还一直不为人们所知，直到2008年，Rajagopal6等利用秀丽隐杆线虫和相关寄生虫具有天然的血红素营养缺陷性，敲除斑马鱼HRG-1基因，发现其出现了脑积水等情况，而且，重度红细胞生成表型缺陷可被HRG-1蛋白修复，这些实验证实HRG-1所表达的蛋白是蠕虫及脊椎动物细胞内血红素的稳态和正常生长发育所必需的。因此将其正式命名为HRG-1（heme-responsivegene1）。本实验发现，HRG-1基因在膀胱癌中发挥着重要的作用。免疫组化发现HRG-1的阳性表达率在膀胱肿瘤组织中明显低于正常膀胱组织，表达水平与年龄性别无相关性，与肿瘤病理分期呈负相关。Western-blot检测均发现3种膀胱癌细胞株(T24、5637和BIU-87)的HRG-1表达水平均高于人膀胱上皮细胞(SV-HUC-11)，T24的表达量为最高，我们利用siRNA干涉技术处理T24细胞，实现HRG-1基因的瞬时低表达，通过MTT和FCM检测发现，HRG-1-siRNA可以抑制T24细胞的增殖，凋亡比例增加。这表明下调HRG-1的表达水平，可以抑制膀胱癌细胞的增殖，凋亡比例增加。通过HRG-1基因的相关研究的报道，我们猜测，HRG-1基因作为血红素敏感性基因，它可能是通过细胞的分化、呼吸、代谢等生物学进程来调节细胞的发生和发展影响血红素转运的同时影响到血红素对细胞的分化作用7-10；其次，HRG-1作为一种跨膜蛋白，可能影响着细胞的携氧能力，从而影响着血管的形成，这也可能是它在癌组织中高表达的原因之一，这也为膀胱癌的诊断和治疗提供了一定的可能性。1A.KarimKader.BladderCancer.TheScientificWorldJOURNALJ.(2011)11,256525662WangYong,ShaoChen,ShiChanghong,ZhangLei,QinWeijun,LiFan.ChangeofthecellcyclerelatedafterflutiamidetreatmentinprostatecancercellsanditsmolecularmechanismJ.AsianJofAndrol,2005,7(4):375-3803SHAOC，WANGY，YUEHH，eta1Biphasiceffectofandrogensonprostatecancercellsanditscorrelationwithandrogenreceptorcoactivatordopadecarb0xylaseJJAndrol，2007，28(6)：8048124JemalA,SiegelR,WardE,etal.Cancerstatistics2008J