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短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用.doc短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用.doc -- 5 元

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短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用马桂美1,2,车建美1,刘波1,史怀1,陈铮1(1.福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建福州3500032.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福州350002)摘要短短芽胞杆菌分布广泛,并且在不同生长阶段,菌落形态也有所不同。目前已经完成2株短短芽胞杆菌的全基因组测序,也了解了短短芽胞杆菌部分基因的功能,如编码二硫化物氧化还原酶的基因bdb、α乙酰乳酸脱羧酶的基因aldB、耐碱性木聚糖酶xylB基因和细胞壁的合成基因等,特别是具有抗菌活性的短杆菌酪肽的合成过程及所需酶的基因均有研究。由于短短芽胞杆菌具有分布广泛、抗逆性和分泌胞外蛋白等优点,已被用于生物防治、作为分泌表达外源蛋白的宿主和微生物降解等方面。虽然其有广泛的应用,但基因功能的研究才刚刚起步。关键词短短芽胞杆菌,基因,微生物降解,生物防治StudyonthefunctionalgenesofBrevibacillusbrevisanditsapplicationMaGuimei1,2,CheJianmei1,LiuBo1,ShiHuai1,ChenZheng1(1.AgriculturalBioresourceResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350003,China2.KeyLaboratoryofBiopesticideandChemicalBiology,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou350002,China)AbstactBrevibacillusbrevisdistributedwidely.Indifferentgrowthstages,thecolonymorphologywouldpresentdiversity.Atpresent,thewholegenomicsequencesoftwostrainsB.brevisweresequenced.AtpresentanumberoffunctionalgenesofB.brevishavestudied,suchasbdbgenewhichencodedthioldisulfideoxidoreductase,aldBgenewhichencodedaacetolactatedecarboxylase,xylBgenewhichencodedalkalinexylanaseandthesynthesisofcellwallgenes.Genesexpressedintyrocidinesynthesisprocessanditsrequiredenzymeshavealsobeenstudied.B.brevishadtheadvantagesofwidedistribution,resistant,secretedextracellularproteinsandsoon.Ithadalreadybeenusedforbiologicalcontrolling,secretionexpressforeignproteinhostandmicrobialdegradation,etc.Buttheresearchoffunctionalgenesisjustgettingstarted.KeywordBrevibacillusbrevis,gene,microbialdegradation,biocontrol引言短短芽胞杆菌(Brevibacillusbrevis)细胞壁结构简单,分泌蛋白能力强,不含内毒素,具有临床和环境方面的安全性(Cook,1993Cooketal.,1996)。由于其可形成抗逆性强的芽孢,提高了短短芽胞杆菌的环境适应能力和与土著微生物的竞争力,这些优点都为短短芽胞杆菌的广泛应用提供了便利。短短芽胞杆菌应用范围非常广泛,主要包括生物防治、环境治理、工业生产和有毒物质降解等等。但由于目前对其功能基因研究的还不是很透彻,因而造成了对其作用机理无法深入探究。本文主要就短短芽胞杆菌的生物学特性、分子检测以及相关功能基因和应用范围等进行了综述,以期为短短芽胞杆菌的应用和作用机理研究提供一定的依据。基金项目973计划前期研究专项(No.2011CB111607),农业部引进国际先进农业科学技术重点项目(No.2011G25),公益性行业(农业)科研专项(No.200903034),福建省财政专项福建省农业科学院科技创新团队建设基金(No.STIFY03)和福建省产业技术开发项目(闽发改高技20101002号)作者简介马桂美(1988),安徽省宿州市人,硕士研究生,研究方向为微生物分子,Tel18046037468Emailmgm658743163.com。通讯作者刘波(1957),男,福建省惠安县人,博士,研究员,研究方向为微生物生物技术与农业生物药物。Tel13905917339Emailliubofaas163.com1、短短芽胞杆菌的生物学特性1.1形态学特性短短芽胞杆菌菌体呈杆状,革兰氏阳性,产芽孢。生长阶段不同,菌体形状也发生一定的变化,延迟期菌体呈细长的杆状,对数期菌体呈短而粗的杆状,稳定期菌体又呈现细长的杆状。周生鞭毛,菌体约为0.82.2μm。1.2分子检测细菌分类方法主要包括GC含量测定、DNA杂交和16SrDNA序列分析等。但短芽胞杆菌间的GC含量差异较大,变化范围为4755(Udaka,Tsukagoshietal.1989),因此Udakaetal.(1993)利用DNADNA杂交及细胞脂肪酸组成、醌组成及免疫分析进行短芽胞杆菌的分类。随着分子生物学的迅速发展,Osamuetal.(1996)利用已得到的短芽胞杆菌属的16SrDNA序列(图1),设计出1对引物用于检测短芽胞杆菌属菌株,为Brev174F(5′AGACCGGGATAACATAGGGAAACTTAT3′)和1377R(5′GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC3′),并在短芽胞杆菌的分类中成功应用。图1短芽胞杆菌16S引物设计(Osamuetal.,1996)Fig.1SequenceofthedetectionprimerformembersoftheBacillusbrevisgrouptheBacillusbrevisclusterprimerBREV174Fandalignmentofthe16SrRNAgenesequencesofBacillusspeciesandrelatedorganisms.2、短短芽胞杆菌全基因组研究目前,全世界范围内,已完成2株短短芽胞杆菌基因组序列,其中1株是福建省农业科学院农业生物资源所筛选得到的具有防腐保鲜功能的短短芽胞杆菌FJAT0809GLX,总长为6Mb,预测得到5666个基因,平均长度933bp,基因密度达到87.83,基因组GC含量为47.30(车建美,2011)。另一株为短短芽胞杆菌NBR100599(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomeprj/29147),其基因组序列总长为6.3Mb,预测得到6121个基因,基因组GC含量为47.30。3、短短芽胞杆菌功能基因的研究3.1巯基二硫化物氧化还原酶基因bdb二硫键在一些功能蛋白中起着很重要的作用,二硫键在试管中可以自发的合成,但是其合成速率较生物体中慢(PetersandDavidson,1982),因此推断,生物体中存在催化二硫键形成的基因或蛋白。在大肠杆菌中发现dsbA基因,DsbA蛋白是大肠杆菌的周质蛋白,但其含有一段CysProHisCys多肽序列,此序列与硫氧还蛋白和二硫化物异构酶蛋白活性位点结构相似。dsbA基因突变体会造成一些周质蛋白的缺失,如碱性磷酸酶、外膜蛋白A(OmpA)、β内酰胺酶(CookRJ,1993)和鞭毛基体的P环蛋白(DaileyandBerg,1993)等缺失。Tatsuyaishiharaetal.(1995)从短短芽胞杆菌中克隆出编码二硫化物氧化还原酶的bdb基因,bdb基因的序列如图2,序列长度为354bp,编码117个氨基酸残基的多肽,N端27个氨基酸残基具有典型的分泌型信号肽的特征,并且具有二硫化物氧化还原酶的保守结构CysXXCys,该结构也是二硫氧化还原酶的活性中心(PetersandDavidson,1982),Bdb、DsbA和PDI均存在此结构。为了验证bdb基因的功能,将bdb基因转入dsbA基因缺失的大肠杆菌中,因dsbA基因缺失的大肠杆菌不能借助鞭毛自由移动,因此Tatsuyaishiharaetal.(1995)选用大肠杆菌的dsbA缺失突变体作为克隆表达的受体,将短短芽胞杆菌bdb基因转入大肠杆菌内,观察大肠杆菌的行为变化和碱性磷酸酶活性,重组bdb基因的大肠杆菌恢复了自由移动的能力,并且碱性磷酸酶的活性明显升高。图2短短芽胞杆菌bdb基因序列(Tatsuyaishiharaetal.,1995)Fig.2Nucleotideanddeducedaminoacidsequencesofthebdbgene.Onlythesequenceoftheantisensestrandisshown.ApotentialShineDalgarnosequenceandapossibleinitiationcodonareboxed.The11residueNterminalaminoacidsequenceofBdbisolatedfromB.breviscarryingpNHBdb,determinedbytheEdmanmethod,isunderlined(Tatsuyaishiharaetal.,1995).3.2α乙酰乳酸脱羧酶基因aldBα乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中发挥着重要作用,啤酒发酵中双乙酰是啤酒风味成熟的关键,双乙酰的含量过高时,会影响啤酒的风味。α乙酰乳酸脱羧酶可将双乙酰的前体α乙酰乳酸快速催化降解为乙偶姻,不经过双乙酰的生成步骤,不仅可以使啤酒很快的成熟,而且在很大程度上减少了啤酒中α乙酰乳酸的残存。酵母菌中不存在α乙酰乳酸脱羧酶基因,只能通过添加α乙酰乳酸脱羧酶制剂及采用基因工程酵母菌。Borgeetal.(1990年)等发现一株短短芽胞杆菌可以产生α乙酰乳酸脱羧酶,将α乙酰乳酸脱羧酶的基因aldB进行了克隆,采用双脱氧方法得到α乙酰乳酸脱羧酶基因aldB的序列(图3),并与产气肠杆菌和枯草芽胞杆菌中的α乙酰乳酸脱羧酶基因aldB序列进行比对,相似性分别达到97和98。α乙酰乳酸脱羧酶基因aldB的长度为1300bp,编码285个氨基酸,N端有典型的信号肽序列,该序列中无明显的启动子类似序列,该序列的184bp前具有核糖体结合位点,195bp处是起始编码区。图3aldB基因序列(Borgeetal.,1990)Fig.3DNAsequenceofaldBandflankingregions3.3耐碱性木聚糖酶基因xylB木聚糖酶广泛分布于细菌、真菌及藻类等微生物中,由于其来源不同,性质也有所差异。胡春霞等(2009)参照已发表的环状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌木聚糖酶基因序列设计引物,扩增短短芽胞杆菌中的木聚糖酶基因。短短芽胞杆菌中的木聚糖酶基因序列约为642bp,可编码213个氨基酸残基,前28个氨基酸为信号肽序列,具有典型的信号肽特性。重组到大肠杆菌中的木聚糖酶基因可顺利表达,短短芽胞杆菌中的木聚糖酶耐高温,并属于耐碱性的木聚糖酶。3.4短杆菌酪肽生物合成相关基因目前大多研究认为,短短芽胞杆菌的抑菌机理是分泌短杆菌肽、短杆菌酪肽和几丁质酶等活性物质。短杆菌酪肽是环状的十肽抗生素,是孢子形成稳定期的产物。早在1987年,Mohamedetal.对短短芽胞杆菌的肽类抗生素的生物合成酶(tycA)进行了研究。此酶不仅对短短芽胞杆菌具有调节作用,对枯草芽胞杆菌也具有一定的调节作用。tycA基因编码短杆菌酪肽合成酶Ⅰ,tycA的转录在短短芽胞杆菌的指数生长后期(即芽孢形成初期)有所降低。图4是tycA基因序列,tycA与tycB同时转录,tycB位于tycA基因序列的3末端(图5),tycA与tycB之间存在94bp的间隔区,此间隔区为操纵子(Lundstrometal.,1992)。短杆菌酪肽的合成至少需要3种多功能酶的催化(BorgeDiderichsenet.al.1990),这3种酶分别是TycA、TycB、和TycC,三种酶相互作用,以相应的氨基酸为底物合成短杆菌酪肽(图6)(Henningetal.,1997)。图4tycA基因序列(Mohamedetal.,1987)Fig.4NucleotidesequenceofnontranscribedstrandofthetycApromoterregion.1isthe5terminusofthetycAmRNA.Underlinednucleotidesindicatetheputative10and35regionsofthepromoterandtheputativeribosomebindingsiteofthetycAmRNAopenreadingframe.图5tycA与tycB基因序列及之间的操纵子(Gerhardetal.,1989)Fig.5Nucleotideandpredictedaminoacidsequencesofthe1,145bpSstIIAvaIfragmentoverlappingthe3endoftycAandthe5endoftycB.图6三种酶在短杆菌酪肽生成中的协同作用(Henningetal.,1997)Fig.6PrimarystructureoftyrocidineA.Boxesindicateresiduesincorporatedbythethreetyrocidinesynthetases,TycA,TycB,andTycC.3.5短短芽胞杆菌细胞壁基因短短芽胞杆菌47分泌大量的胞外物质,其细胞壁具有特殊的三层结构,三层细胞壁由外至内分别被命名为外层(4.2nm)、中间层(8.5nm)和内层(2.13.7nm),最内层可能是肽聚糖层。不同生长阶段,细胞壁在形态学上存在一定程度的变化,在生长初期,细胞在外层细胞壁的庇护下生长,随着分泌蛋白的增加,其形态也会发生一定的变化(Hidehikoetal.,1981)。Hideoetal.(1987)克隆并描述了短短芽胞杆菌47细胞壁蛋白基因5区域。该片段具有1个编码中层细胞壁的开放阅读框,并且具有2个翻译起始位点,每个位点都包含一个与短短芽胞杆菌rRNA3末端和起始密码子高度同源的序列。图7是细胞壁蛋白基因操纵子的5端核苷酸序列。此序列从TTG密码子开始编码(TTG被认为是芽胞杆菌的起始密码子),存在2个潜在的核苷酸结合位点,即为图7中的SD1和SD2,从第二个翻译起始位点开始翻译的细胞壁蛋白具有23个氨基酸的典型信号肽序列,而从第一个翻译起始位点开始时,典型信号肽序列前具有31个电荷富集的氨基酸。Adachietal.(1990)研究发现,第一个翻译起始位点的使用频率是第二个的三分之一,因此推测第一个翻译起始位点可能是在特殊条件下发挥作用。将短短芽胞杆菌47的细胞壁蛋白基因操纵子5区域重组到大肠杆菌中,中层细胞壁蛋白可以高效表达,进一步证明了此序列是短短芽胞杆菌47的细胞壁蛋白基因的操纵子。Hideoetal.(1989)对短短芽胞杆菌47的细胞壁蛋白基因做了进一步的研究,结果表明,细胞壁蛋白基因是一个由5个串联启动子控制的转录单元(图8)。串联的启动子具有强的起始转录功能,P2和P3在细胞壁蛋白分泌的过程中起主要作用,不同的是P2使用频率较高,P2是细胞壁蛋白分泌的必须启动子,是分泌表达必不可少的结构,而P3只有细菌处在指数生长期才会被使用。短短芽胞杆菌47独特的细胞壁结构导致其转化方法也有所不同,Wataruetal.(1983)研究了短短芽胞杆菌47的转化。转化方法为TrisPEG转化法,并成功的将质粒pHW1和pUB110转入其细胞内,这为后期短短芽胞杆菌基因的研究奠定了基础。图7短短芽胞杆菌47细胞壁蛋白基因5区域(Hidehikoetal.,1987)Fig.7Nucleotidesequenceofthe5regionofthecellwallproteingeneoperon.图8细胞壁蛋白基因启动子(Takahiroetal.,1989)Fig.8MapofvariousDNAfragmentscontainingputativecwppromoters.3.6dnaK基因Hirokoetal.(1998年)对短短芽胞杆菌HPD31的dnaK基因进行了研究(Geneabank中的登录号为AB009842)。以枯草芽孢杆菌的dnaK基因为探针,采用原位杂交的方法分离出短短芽胞杆菌中的dnaK基因,并进行了测序。核苷酸序列分析显示,该序列由3个开放阅读框组成。纯化的DnaK蛋白显示出ATP酶活性,并且与谷胱甘肽S转移酶DnaJ和谷胱甘肽S转移酶GrpE协同促进蛋白的折叠。3.7hps和phi基因hps和phi基因编码3己酮糖6磷酸合成酶和6磷酸3己酮糖异构酶,它们是磷酸核酮糖途径中甲醛固定所必须的。基因克隆后的序列分析显示,hps和phi基因是磷酸核酮糖的操纵子。4、短短芽胞杆菌的应用短短芽胞杆菌分布广泛,生命力强,能适应不同的生境。不同生境中的短短芽胞杆菌会呈现不同的特征,也会有不同的应用。4.1作为分泌表达外源蛋白的宿主蛋白的分泌表达是细胞普遍存在的蛋白表达方式,分泌表达的蛋白具有如下优点可溶性、正确折叠、有生物活性、易获得、无需破碎细胞,仅利用简单的纯化手段即可获得。目前常用的原核分泌表达系统还存在不足,如大肠杆菌作为分泌表达外源蛋白受体时,容易形成包涵体,产物分泌表达水平低,而且经常分泌至周质空间而非胞外(Baneyxf,1999)。枯草芽胞杆菌分泌性强且无致病性,但胞外的蛋白酶活性高,容易引起产物的降解(SarvasM,1995)。短短芽胞杆菌具有分泌蛋白能力强和胞外蛋白酶活性低等特点(Udaka,19891993),因此短短芽胞杆菌是比较理想的外源蛋白表达宿主。Ukara(1976)和Takagietal.(1989)已经将短短芽胞杆菌作为外源蛋白表达宿主,成功表达了人类表皮生长因子和喜温植物的α淀粉酶。Jongetal.(2010)为研究短短芽胞杆菌的杀虫活性,特将苏云金芽孢杆菌的灭蚊晶体蛋白基因重组到短短芽胞杆菌中,携带cry11Aa基因的苏云金芽胞杆菌表达载体,在cryAc启动子的介导下转入短短芽胞杆菌,重组的短短芽胞杆菌成功表达Cry11A蛋白,转化菌株对两类双翅目的幼虫具有杀虫活性。Masahiroetal.(1996)也利用短短芽胞杆菌作为表达受体,将产气夹膜杆菌的α毒素基因克隆出来,构建分泌表达载体,转入到短短芽胞杆菌47中,重组的短短芽胞杆菌成功表达α毒素蛋白,并且其产量是枯草芽胞杆菌的10倍。Satoshietal.(2000)等将编码成熟大肠杆菌热稳定的肠毒素B亚基的基因克隆出来,并插入pNU212载体中,将重组载体介导转入短短芽胞杆菌中,此基因在短短芽胞杆菌HPD31中高效表达。4.2短短芽胞杆菌在生物防治中的应用Edwardsetal.(2001)报道,短短芽胞杆菌对大白菜的灰霉病菌具有防治作用,在短短芽胞杆菌或短杆菌肽S存在时,能够有效抑制灰霉病菌的生长。Vivasetal.(2006)利用菌株之间的相互作用,对短短芽胞杆菌进行了研究,当短短芽胞杆菌与菌根菌共同存在时,可以抑制植物对重金属的吸收,促进植物生长。易有金等(2007)从烟草茎秆中分离到内生细菌短短芽胞杆菌,发现其对由青枯雷尔氏菌引起的烟草青枯病具有一定的防效。郝晓娟等(2007)利用短短芽胞杆菌JK2防治番茄枯萎病,对番茄枯萎病的盆栽防效和田间防效分别为83.82和74.7。短短芽胞杆菌JK2的滤液能抑制枯萎病菌的菌丝生长,对病原菌孢子的萌发也具有明显的抑制作用,同时,还可引起菌丝的消解、产生泡状物、破坏生长点、引起细胞内含物外溢等。短短芽胞杆菌A57,是新疆农业科学院自棉花根际土壤中分离得到的,陈莉等(2008)对其在防治棉花立枯病、枯萎病等病原真菌引起的植物病害进行了研究,短短芽胞杆菌A57对棉花的立枯病、枯萎病等病原真菌具有明显的抑制作用。短短芽胞杆菌A57可影响枯萎病菌的菌丝生长,致使其菌丝体扭曲、断裂、及畸形泡状物和原生质泄漏,对分生孢子的生长也有一定的影响,短短芽胞杆菌A57附近的分生孢子表现出畸形,并且芽管萌发处有泡状物。4.3微生物降解微生物采油为采油技术的发展提供了新方向,微生物采油不仅降低采油成本,而且无污染,越来越受到重视。郭万奎等(2007)根据大庆油田的环境,筛选出能够降解高碳链饱和烃的短短芽胞杆菌,并且在大庆外围特低渗透油田开展的微生物试验取得了理想效果。在污染区可分离到具有降解污染物能力的短短芽胞杆菌。Archnaetal.(2000)对短短芽胞杆菌和环状芽胞杆菌降解六氯环己烷方面进行了研究,分离自六氯环己烷污染土壤的短短芽胞杆菌和环状芽胞杆菌,可以分解六氯环已烷的α、γ、β和δ异构体。短短芽胞杆菌也具有降解苯酚的能力,Arutchelvanetal.(2006)对短短芽胞杆菌降解高浓度苯酚的动力学进行了研究。4.4其它方面的应用Uttametal.(1999)对兼性厌氧的嗜热和适温的短短芽胞杆菌中的碱性蛋白酶进行了研究。摇瓶培养获得的碱性蛋白酶在pH10.5和37°C具有最大活性。碱性蛋白酶是胞外蛋白,具有热稳定性,并且可以和多数清洁剂兼容,这些特征显示其适合作为洗涤剂助推剂。短短芽胞杆菌分泌的碱性蛋白酶,可促进各种洗涤剂的清洁功能的发挥。Marinaetal.(2007)的研究结果表明,短短芽胞杆菌分泌的短杆菌酪肽可抑制疟原虫的发展和生命循环的进行。5、小结短短芽胞杆菌的抗菌谱广、对人畜安全、对环境无污染及促进植物生长等优点,符合绿色、可持续的农业发展需求,为其广泛应用提供方便。目前多数研究认为,短短芽胞杆菌主要通过分泌短杆菌酪肽和短杆菌肽抑制微生物的生长代谢。虽然短短芽胞杆菌在生物防治上应用较多,在国内外均有报道,但其抑菌机制还不清楚。目前国内短短芽胞杆菌的研究还停留在分离筛选及其抑菌活性的测定上,对于短短芽胞杆菌基因功能的研究目前还停留于克隆表达的层面,随着分子生物学的迅速发展,其基因功能和抑菌机制必将被人类所了解。参考文献(根据所投稿刊物修改)CookRJ.MakinggreateruseofintroducedmicroorganismsforbiologicalcontrolofplantpathogensJ.AnnRevPhytopathol,1993,315380.CookRJ,BruckartWL,CoulsonJR,etal.SafetyofmicroorganismsintendedforpestandplantdiseasecontrolaframeworkforscientificevaluationJ.BiolControl,1996,7333351.ShidaO,TakagiH,KadowakiK,etal.IntJSystBacteriol,1996,46939~946.Peters,T.,andL.K.Davidson.ThebiosynthesisofratserumalbumininvivostudiesontheformationofthedisulfidebondsJ.Biol.Chem,1982,2578847–8853.Bardwell,J.C.A.,K.McGovern,andJ.Beckwith.Identificationofaproteinrequiredfordisulfidebondformationinvivo.Cell,1991,67581–589.Dailey,F.E.,andH.C.Berg.MutantsindisulfidebondformationthatdisruptflagellarassemblyinEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,901043–1047.TatsuyaIshihara,HideakiTomita,YukoHasegawa,et.al.CloningandCharacterizationoftheGeneforaProteinThiolDisulfideOxidoreductaseinBacillusbrevisJ.JouranlofBacteriology,1995,745749.Lundstrom,J.,G.Krause,andA.Holmgren.AProtoHismutationinactivesiteofthioredoxinincreasesitsdisulfideisomeraseactivity10fold.J.Biol.Chem.,1992,2679047–9052.BorgeDiderichsen,UliaWedstid,LisbethHedegaard,et.al.CloningofaldB,WhichEncodesaAcetolactateDecarboxylase,anExoenzymefromBacillusbrevisJ.JouranlofBacteriology,1990,43154321.
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