姜黄素对Hepa1-6 肝癌细胞凋亡及ROS 影响.doc

姜黄素对Hepa1-6肝癌细胞凋亡及ROS影响杜琴，邓珊，沈克平，胡兵（上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，中医肿瘤研究所，上海20032）摘要目的：观察姜黄素对小鼠肝癌Hepa1-6细胞凋亡及活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)水平的影响。方法：不同浓度姜黄素处理Hepa1-6肝癌细胞，MTT比色法检测细胞增殖，Hoechst33258染色检测细胞凋亡形态变化，流式细胞术检测细胞凋亡，WesternBlot法检测活化型caspase-3，2-7-二氯氢化荧光素乙二脂（DCFH-DA）染色法结合荧光酶标仪检测姜黄素对胞内ROS产生的影响。结果：240mol/L姜黄素作用24h、48h均可抑制肝癌Hepa1-6细胞增殖，并呈现一定的时间与剂量依赖性。520mol/L姜黄素作用48h后Hepa1-6细胞呈现凋亡形态变化，细胞凋亡率呈一定程度剂量依赖性，同时可检测到活化型caspase-3、以及ROS产生。结论：姜黄素可以抑制Hepa1-6细胞增殖，促使Hepa1-6细胞凋亡，可能与活化caspase-3及提高细胞内ROS水平相关。关键词肝癌；姜黄素；细胞凋亡；caspase-3；ROSEffectsofCurcuminonROSproductionandapoptosisinMurineHepatocarcinomaHepa1-6CellsDuQin,DengShan,ShenKeping,HuBing（DepartmentofOncologyandInstituteofTraditionalChineseMedicineinOncology,LonghuaHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,20032）Objective：Toobservetheeffectsofcurcuminonapoptosisandreactiveoxygenspecies(ROS)productioninmurinehepatocarcinomaHepa1-6cellsinvitro.Methods：Hepa1-6cellsweretreatedwithdifferentdoseofcurcumin.CellproliferationwasdetectedwithMTTassay.Apoptoticmorphologywasvisualizedbyhoechst33258staining.Cellapoptosiswasdetectedbyflowcytometryanalysis.Caspase-3wasdetectedbywesternblot.IntracellularROSproductionwasdetectedby2,7-dichlorofluorescindiacetate(DCFH-DA)staining.Results：Comparedwiththecontrols,upontreatmentwith240mol/Lofcurcuminfor24hto48h,Hepa1-6cellsproliferationwassignificantlyinhibitedinatimeanddosedependentmanner.520mol/LofcurcuminalsoinducedapoptosisandapoptoticmorphologychangeinHepa1-6cells.Aftertreatmentwith520mol/Lcurcumin,caspase-3wasactivatedaccompaniedbygenerationofROS.Conclusion：Curcuminmayinhibitcellproliferation,induceapoptosisinmurinehepatocarcinomaHepa1-6cells,andmayinvolvementofcaspase-3activationandROSproduction.KeyWordsHepatocarcinoma；Curcumin；Apoptosis；Caspases-3；Reactiveoxygenspecies姜黄素（Curcumin)是从姜科植物姜黄、郁金等根茎中提取的一种有效组分，具有抗炎、抗突变及抗肿瘤等作用1，已证实姜黄素可抑制乳腺癌、肺癌及胃肠道肿瘤等多种肿瘤细胞基金资助：上海市基础研究重点项目（09JC1413600）；龙华医院国家中医临床研究基地“龙医团队、龙医学者”项目（LYTD-04）。通讯作者：胡兵（1971-），男，博士，副研究员，硕士生导师。研究方向：肿瘤生物学、功能基因组与抗癌中药作用及配伍E-mail:生长24，本研究在Hepa1-6细胞模型中观察了姜黄素对肝癌细胞的作用及可能机制。1材料与方法1.1试验用药姜黄素（Curcumin）购于sigma（Cat.C7727-100MG，纯度94%），用二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成10mmol/L储备液，0.22m滤器过滤除菌，-20保存备用。实验前用DMEM稀释成工作液，DMSO终浓度0.1%。1.2细胞株小鼠肝癌Hepa1-6细胞购自中国科学院上海细胞库。培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基（含青、链霉素各100U/ml）中，37，5%CO2饱和湿度环境的条件下连续培养。1.3试剂MTT（美国Amresco产品），DMEM高糖培养基（ThermoFisher产品），胎牛血清（SAFCBiosciences公司），caspase-3、-Tubulin抗体（CellSignalingTechnology公司），AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（Invitrogen公司），细胞凋亡荧光Hoechst33258检测试剂盒（南京凯基生物），活性氧检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所），其他试剂均为分析纯。1.4仪器细胞培养箱（美国NAPCO-5410型），酶标仪（美国ThermoVarioskan），倒置显微镜(日本NikonDXM1200)，流式细胞仪(美国BDcalibur公司)，电泳和转膜装置（美国BIO-RAD公司），Odyssey双色红外荧光成像系统扫描仪（美国LI-COR）。1.5方法1.5.1细胞增殖检测取对数生长期Hepa1-6细胞，常规胰酶消化、计数，按3103/100L/孔接种于96孔板中，过夜贴壁后实验组加入不同浓度姜黄素（2mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L），对照组加入等体积DMSO，空白组不做处理。每组3个复孔；分别继续培养24h、48h每孔加入新鲜配制的浓度为5mg/mL的MTT溶液20l，继续培养4h后弃培养基，每孔加DMSO150l，轻轻振荡10min，用酶标仪于490nm处检测各孔光密度值(opticaldensity，OD)值，按公式计算细胞存活率：存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）100%。细胞实验重复3次。1.5.2细胞凋亡形态观察常规消化、接种Hepa1-6细胞于24孔板，贴壁24小时后加入终浓度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黄素干预Hepa1-6细胞，对照组加入等体积DMSO，48h后弃培养基，PBS洗涤2次，加入4%甲醛溶液，4固定10min，PBS洗涤2次，滴加Hoechst33258荧光染色液100L，室温染色10min，荧光显微镜观察细胞形态并随机拍照。1.5.3流式细胞仪检测收集终浓度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黄素作用后细胞，PBS洗涤三次，调细胞浓度3105/ml，4，1500rpm，离心5min，加入100L结合缓冲液重悬细胞，加入0.5LAnnexinV-FITC混匀后，加入5LPI混匀，室温、避光、反应10min，上机，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。1.5.4ROS活性检测终浓度为5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黄素作用Hepa1-6细胞48h后，更换含DCF-DA10mol/L无血清DMEM培养液，37孵育20min后，弃培养液，无血清DMEM培养液洗涤3次，镜下观察；同时收获细胞，调整细胞浓度2106/mL，黑色96孔板每孔100L细胞悬液，每组设3复孔，荧光酶标仪测DCFOD值，488nm激发波长，525nm发射波。1.5.5Westernblot收集药物作用后Hepa1-6细胞，常规裂解，离心去除DNA，加入蛋白质上样缓冲液100变性15min，用10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳，湿转法将蛋白质转移至硝酸纤维膜，5%脱脂奶粉封闭1h后，加入Caspase-3或-Tubulin抗体4孵育过夜，PBST洗膜后与荧光标记二抗（1:2500）37孵育1h，PBST反复洗涤34次后Odyssey双色红外荧光成像系统扫描图像入计算机。1.6统计学处理数据以xs表示，采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，组间差异比较采用单向方差分析，按=0.05的检验水准，P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1姜黄素对Hepa1-6细胞增殖作用MTT实验结果显示，240mol/L姜黄素可以不同程度地抑制Hepa1-6细胞增殖，浓度在5mol/L或以上与对照组比较，差异显著（P0.05），并随姜黄素浓度增加和作用时间延长抑制作用明显增强。见表1。表1姜黄素对Hepa1-6肝癌细胞增殖影响(xs，n=3)组别剂量（mol/L）存活率（%）24h48h对照组0100.002.12100.001.93姜黄素296.343.8195.424.47姜黄素591.170.59*87.711.57*姜黄素1087.022.45*82.960.05*姜黄素2079.882.21*62.572.98*姜黄素4042.010.81*13.381.39*注：与对照组比较，：*P0.05,*P0.012.2姜黄素对Hepa1-6细胞凋亡形态观察研究采用Hoechst33258染色观察姜黄素对Hepa1-6细胞凋亡形态的影响，结果如图1所示，对照组Hepa1-6细胞呈弱荧光染色，不同浓度姜黄素作用后Hepa1-6细胞可以吸收Hoechst33258，发出较强烈的蓝色荧光，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒，染色质凝聚、边缘化及细胞核裂解等凋亡细胞核形态。见图1。图1姜黄素对Hepa1-6细胞凋亡形态影响（100）2.3姜黄素对Hepa1-6细胞凋亡率影响AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞仪检测显示，终浓度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黄素作用48h，Hepa1-6细胞凋亡率分别为（6.031.08）%、（11.390.24）%、（16.550.94）%，其中10mol/L、20mol/L组细胞凋亡率与对照组比较有明显统计学差异（P0.01）。见图2。Cur10mol/LControlCur5mol/LCur20mol/LControlCur5mol/LCur10mol/LCur20mol/L图2姜黄素对Hepa1-6细胞凋亡影响2.4姜黄素对Hepa1-6细胞内ROS影响DCFH-DA荧光染色后，姜黄素组细胞可见绿色荧光，ROS荧光强度随姜黄素浓度增加而增强，荧光酶标仪检测显示终浓度5mol/L、10mol/L、20mol/L姜黄素作用后ROS荧光强度分别为对照组1.21、2.09、11.73倍（P0.05）。见图3。图3姜黄素对Hepa1-6细胞ROS影响（100）2.5Caspase-3活化蛋白的表达Caspase-3是细胞凋亡过程中关键执行分子，caspase-3以酶原形式存在于胞浆中，在细胞凋亡早期阶段，caspase-3被激活剪切后产生的17kD和12kD片断，Hepa1-6细胞经5、10、20mol/L姜黄素作用48h后可以检测到caspase-317kD产物，提示姜黄素可以活化caspase-3，见图4。图4姜黄素对Hepa1-6细胞caspase-3活化作用3讨论原发性肝癌（简称肝癌）是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居全球第7位，我国及东南亚国家发病率尤高，预后极差，5年生存率为3%5%5,6。肝癌隐匿，进展迅速，大多肝癌患者就诊时已失去手术机会，同时由于肝癌对放射及细胞毒性药物治疗不敏感或因肝功能异常不能耐受常规治疗，亟待寻找高效、低毒的新的治疗手段。目前国内外多项研究已证实，姜黄素可通过抑制微管的动态不稳定性、激活有丝分裂点、诱导凋亡及阻滞细胞周期等多种途径抑制肿瘤细胞生长2,7，本研究结果发现姜黄素对Hepa1-6肝癌细胞增殖有显著的抑制作用，提示姜黄素对肝癌细胞具有一定程度抗癌作用。细胞凋亡或程序性细胞死亡（Programmedcelldeath），是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在基因调控的自动结束生命的过程，是肿瘤药物治疗主要效应机制之一；凋亡细胞可以呈现特殊的形态学改变，如染色质浓缩、凝聚，细胞核碎裂，产生凋亡小体等8。本研Cur20mol/LCur10mol/LCur5mol/LControl-TubulinCleavedcaspase-3Curcumin(mol/L)020105究显示姜黄素作用后Hepa1-6细胞可吸收Hoechst33258，发出强烈的蓝色荧光，细胞核或细胞质内可见浓染致密的蓝色荧光颗粒及明显核形态变化；同时AnnexinV-FITC/PI，流式细胞仪检测显示不同浓度姜黄素作用后Hepa1-6细胞出现明显凋亡，提示姜黄素可诱导Hepa1-6细胞发生凋亡，细胞凋亡可能参与姜黄素抗肝癌作用。caspase-3是细胞凋亡执行蛋白酶，正常情况下，caspase-3以酶原形式存在于胞浆中，在细胞凋亡过程中，多种凋亡信号最终引起caspase-3活化，被剪切后产生的17kD和12kD片断，进而裂解下游蛋白底物，诱发细胞凋亡，因此，细胞凋亡研究常以检测caspase-3活化产生的17kD产物的形式来鉴定其活化8,9。本研究结果显示姜黄素作用后Hepa1-6细胞可以检测到caspase-3剪切产生17kD产物，提示姜黄素可以活化caspase-3，参与诱导Hepa1-6细胞凋亡。目前研究广泛地证实ROS与细胞凋亡、细胞生长抑制之间有密切关系，细胞内ROS水平的变化可以引起肿瘤细胞一系列与细胞增殖、凋亡相关信号通路的变化，如NF-B、ASK1/JNK等信号通路，活化caspase-3；ROS产生先于caspase-3的活化，提高结肠癌细胞或肝癌细胞内ROS水平能抑制癌细胞生长1014。本实验结果发现姜黄素可以显著提高细胞内ROS水平，提示ROS可能参与姜黄素诱导Hepa1-6细胞生长抑制及细胞凋亡，具体的凋亡信号通路有待进一步研究。参考文献1.GodA,KunnumakkaraAB,AggarwalBB.CurcuminasCurecuminFromkitchentoclinic.BiochemicalPharmaeo,2008；5(4):7878092.BanerjeeM,SinghP,PandaD.Curcuminsuppressesthedynamicinstabilityofmicrotubules,activatesthemitoticcheckpointandinducesapoptosisinMCF-7cells.FEBSJ,2010；277(16):343734483.SahaA,KuzuharaT,EchigoN,eta1.Apoptosisofhumanlungcancercellsbycurcuminmediatedthroughup-regulationofgrowtharrestandDNAdamageinduciblegenes45and153.BiolPharmBull,2010；33(8):129112994.PatelBB,GuptaD,ElliottAA,eta1.CurcumintargetsFOLFOX-survivingcoloncancercellsviainhibitionofEGFRsandIGF-1R.AnticancerRes,2010；30(2):319325.5.JemalA,BrayF,CenterMM,eta1.Globalcancerstatistics(2011).CACancerJClin,2011；61(2):69906.HagymsiK,TulassayZ.Epidemiologyriskfactorsandmolecularpathogenesisofprimarylivercancer.OrvHetil,2008；149(12):5415487.TeitenMH,GaaschtF,CronauerM,eta1.Anti-proliferativepotentialofcurcumininandrogen-dependentprostatecancercellsoccursthroughmodulationoftheWinglesssignalingpathway.IntJOncol,2010；38(3):6036118.deBruinEC,MedemaJP.Apoptosisandnon-apoptoticdeathsincancerdevel