咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用.doc咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用.doc

收藏 分享

资源预览需要最新版本的Flash Player支持。
您尚未安装或版本过低,建议您

咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用宦才娟,汪萌芽(皖南医学院细胞电生理研究室,安徽芜湖241002)EFFECTSOFMIDAZOLAMONMOTONEURONSINNEONATALRATSPINALCORDINVITROHUANCAIJUAN,WANGMENGYACELLELECTROPHYSIOLOGYLABORATORY,WANNANMEDICALCOLLEGE,WUHU,ANHUI241002,CHINAABSTRACTOBJECTIVETOOBSERVETHEEFFECTSOFMIDAZOLAMONMOTONEURONSMNSINNEONATALRATSPINALCORDSLICESMETHODSTHECONVENTIONALINTRACELLULARRECORDINGTECHNIQUESWEREUSEDTOOBSERVETHEEFFECTSOFMIDAZOLAMATDISTINCTCONCENTRATIONONMNSOFSPINALCORDSLICESISOLATEDFROMNEONATALRATS814DOLDRESULTSINTHE5MNSSTEADILYRECORDED,NOTONLYADEPOLARIZATIONRESPONSEOF182108MVWITHINCREASEOFMEMBRANERESISTANCEWASINDUCEDBYPERFUSIONOFMIDAZOLAMAT0110MMOL/LFOR15MINOFEACHCONCENTRATIONSX,P005ORP001,BUTALSOAMPLITUDEOFACTIONPOTENTIALSWASDECREASEDP005,ANDEVENACTIONPOTENTIALSWERENULLIFIEDIN2MNSIN4MNSWITHDORSALROOTLETSTIMULATIONEVOKEDEXCITATORYPOSTSYNAPTICPOTENTIALSDREPSPS,BATHOFMIDAZOLAM0110MMOL/LREVERSIBLYDEPRESSEDDREPSPSINACONCENTRATIONDEPENDENTMANNERMOREOVER,IN3MNSWITHDREPSPFOLLOWEDBYINHIBITORYPOSTSYNAPTICPOTENTIALSDRIPSPS,DREPSPSWEREINHIBITEDANDDRIPSPSWEREENHANCEDBYMIDAZOLAMATLOWCONCENTRATION,WHEREASBOTHOFTHEMWERENULLIFIEDATHIGHCONCENTRATIONCONCLUSIONTHEFINDINGSSUGGESTTHATMIDAZOLAMMAYREVERSIBLYANDCONCENTRATIONDEPENDENTLYINHIBITTHEMNEXCITABILITYANDITSSYNAPTICTRANSMISSIONFROMSENSORYINPUTSKEYWORDSSPINALCORD;MOTONEURON;SYNAPTICTRANSMISSION;MIDAZOLAM;ELECTROPHYSIOLOGY摘要目的观察咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元(MN)的作用。方法采用常规细胞内记录技术,观察不同浓度的咪达唑仑对新生大鼠(814D)离体脊髓MN的作用。结果在5个记录稳定的MN,累积灌流0110MMOL/L咪达唑仑各15MIN,不仅产生可逆的、浓度依赖性去极化反应P005或P001,并伴有膜电阻的增大P005,而且抑制动作电位的幅度和发放频率P005,且10MMOL/L的咪达唑仑在其中2个MN完全取消动作电位的产生。在4个记录到背根刺激诱发出兴奋性突触后电位(DREPSP)的MN,0110MMOL/L咪达唑仑累积灌流各15MIN,亦呈现浓度依赖性抑制作用,其中01MMOL/L的咪达唑仑对DREPSP抑制性作用具有统计学意义N3,P005。而在记录到DREPSP合并有抑制性突触后电位(DRIPSP)的3个MN,低浓度咪达唑仑抑制DREPSP而增大DRIPSP,但高浓度亦完全取消DRIPSP。结论咪达唑仑对脊髓运动神经元兴奋性及其外周传入性突触传递具有浓度依赖性抑制作用。关键词脊髓;运动神经元;突触传递;咪达唑仑;电生理学咪达唑仑MIDAZOLAM是当前临床使用的唯一水溶性苯二氮艹卓BZ类药,依剂量的不同而具有镇静、催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗癫痫及中枢肌松等作用1。咪达唑仑具有起效快、苏醒快,对呼吸和循环功能干扰少,安全有效等特点,是较理想的静脉麻醉药,有广泛的应用前景2。尽管临床观察发现静脉注射咪达唑仑显示镇痛作用3,但有关咪达唑仑镇痛作用中是否涉及对脊髓运动神经元(MOTONEURON,MN)的影响,目前国内外尚未见研究报道。本文应用细胞内记录技术,观察咪达唑仑对新生大鼠脊髓切片MN的作用。1材料与方法11新生大鼠脊髓切片的制备取8~14D龄新生SD大鼠雌雄不拘,由南京青龙山动物养殖场提供,参照报道方法4,经乙醚麻醉后行椎板切除术,分离出含腰骶膨大的脊髓节段后,将脊髓用胶水CRAZYGLUE固定在琼脂块上,再将琼脂块固定于振荡切片机VIBRATOME的冰浴载物浴碟内,用剃须刀片横向切取厚度为400~500M的脊髓切片若干,在室温下置于用混合气体95%O25%CO2饱和的人工脑脊液ACSF中孵育、备用。在制备脊髓切片过程中,用0~4℃并经混合气体饱和的ACSF浸浴离体的脊髓节段,整个过程控制在15MIN以内。ACSF的成分为MMOL/LNAC11270,KC119,KH2PO412,CAC1224,MGSO47H2O13,NAHCO3260,GLUCOSEH2O100,PH74。基金项目安徽省自然科学基金(090413084作者简介宦才娟(1981),女,2008级硕士研究生,电话13665533836,电子邮箱HCJ520SINACOM;汪萌芽,男,教授,博士,硕士生导师,通讯作者(EMAILWANGMYWNMCEDUCN)12新生大鼠脊髓MN的细胞内记录新生大鼠脊髓切片于室温下孵育40~60MIN后,用吸管移入自制的全浸式记录浴槽,用上、下两个丝网相夹固定,持续灌流经混合气体饱和的ACSF,浴槽中灌流液的温度为室温22~25℃。用P97程控微电极拉制仪SUTTERINSTRUMENTCO,USA拉制含纤维玻璃微电极,内充3MOL/L乙酸钾,固定于微操纵仪MP1,NARISHIGE,JAPAN上,将探头HEADSTAGE上的银丝插入电极尾端内,用于胞内电流注入及电位记录。选用尖端阻抗为70~120MΩ的微电极,在体视显微镜下经微操纵仪对脊髓切片中腹角MN区域进行细胞穿刺。缓慢手动推进微电极,当微电极压在细胞膜上时,通过AXOCLAMP2B微电极放大器AXONINSTRUMENTINC,USA的附设遥控装置BUZZ进行触发,引发电极尖端的电磁振荡可使微电极刺入细胞内。记录到的膜电位信号经微电极放大器用桥平衡模式进行放大,桥平衡模式可经同一电极同时进行膜电位记录和电流注入。放大的膜电位信号经DIGIDATA1200接口AXONINSTRUMENTINC,USA输入计算机,用PCLAMP70软件AXONINSTRUMENTSINC,USA进行采样、记录并保存。13电刺激方法细胞内电流注射在微机内由PCLAMP70软件(AXONINSTRUMENTSINC,USA)程序设定,由微机触发,信号经DIGIDATA1200联机接口输入微电极放大器后,刺激电流由探头输出经微电极注入细胞内。腹外侧索(VLF)、背根(DR)及腹根(VR)电刺激由三通道电刺激器NIHONKOHDEN,JAPAN产生的方波脉冲分别经刺激器中一个通道输出,经隔离器NIHONKOHDEN,JAPAN以恒压模式至同芯双极刺激电极FREDERICKHAERCO,USA。刺激电极尖端放置到脊髓切片的腹外侧索区、背根和腹根残端上,用于激活下行、背根传入和腹根纤维。14给药方法咪达唑仑注射液徐州恩华药业有限公司,实验时临时用ACSF配制成所需浓度01,03,10MMOL/L,由恒流泵灌流给药,全程用混合气体饱和,灌流用药的前后条件(如灌流的速度与温度等)保持一致。每种浓度灌流15MIN,最后用ACSF洗脱。15分析方法记录到的资料,用PCLAMP80中的CLAMPFIT81软件(AXONINSTRUMENTSINC,USA)进行处理,数据分析用ORIGIN50软件。数据以SX表示,统计学显著性检验采用配对T检验,P005为有显著性意义。2结果选取静息电位RESTINGPOTENTIAL,RP负于-60MV且动作电位有超射,记录稳定的细胞,通过加在腹根残端上的同芯双极刺激电极进行逆行激活鉴定,若记录到具有全或无特点的动作电位逆行AP或碰撞试验阳性,即鉴定为MN,并进行如下实验和分析。21咪达唑仑对MN电学特性的影响在5个MN,给于0110MMOL/L的咪达唑仑累积灌流每一浓度各15MIN,观察用药前后膜电生理参数,结果见表1。可见咪达唑仑产生浓度依赖性去极化作用(配对T测验,P005或P001),在03MMOL/L浓度作用时斜率电阻的增大有显著性意义(N5,P005),作用可逆。表1咪达唑仑对MN电生理参数的影响(SX,N5)TAB1EFFECTSOFMIDAZOLAMONELECTROPHYSIOLOGICALPROPERTIESOFNEONATALRATSPINALCORDMNSINVITROSX,N5CONTROLN5MIDAZOLAMMMOL/L01N403N510N2RPMV–71194–532130–478107–36085RMM494825169758011061025ΤMS11539147671484014673ACTIONPOTENTIALAMPMV76391637155524157TLMV–53123–407113–35319OSMV1467427270SPIKEPOTENTIALAMPMV5987954814738348HALFWIDTHMS140423131403MAXLSLOPEMV/MS130937810195491417524MAXRSLOPEMV/MS–697287–632270–534200RISETIMEMS060110070602DECAYTIMEMS140628241304与对照组比较P005,P001,完全取消22咪达唑仑对MN动作电位的影响对5个诱发出动作电位的MN,给予0110MMOL/L的咪达唑仑累积灌流各15MIN,结果显示动作电位的幅度和超射值随着浓度的增加而逐渐降低,10MMOL/L的咪达唑仑完全取消了动作电位的发放(表1,图1)。03NA03NA03NA03NACONTROLMIDAZOLAMMMOL/L0310WASH40MV6MS图1咪达唑仑可逆性并浓度依赖性抑制MN的动作电位FIG1REVERSIBLYANDCONCENTRATIONDEPENDENTINHIBITORYACTIONOFMIDAZOLAMONACTIONPOTENTIALINAMNINVITRORPWAS–73MV23咪达唑仑对MN动作电位发放频率的影响对实验中记录到的MN给予不同强度(01~13NA,300MS)的细胞内去极化脉冲,大部分MN的放电频率呈现与电流强度相关性升高(IF关系曲线),对于其中5个MN给予01,03MMOL/L咪达唑仑灌流,观察到MN的IF关系曲线右移、斜率降低(图2),其中03MMOL/L咪达唑仑对0206NA时的放电频率抑制有统计学意义(N5,P005),说明咪达唑仑浓度依赖性抑制MN的动作电位发放频率。05101520253035400020406CONTROL01MMOL/L03MMOL/LN5N4N5FHZINACONTROLMIDAZOLAMMMOL/L0103WASH08NA08NA08NA20MS40MV08NAAB图2咪达唑仑对MN动作电位发放频率的影响A咪达唑仑浓度依赖性抑制动作电位发放频率的实验记录,左侧数字表示浓度,右侧数字表示诱发动作电位的细胞内去极化电流强度,该MN的RP为–73MV;B咪达唑仑对IF关系曲线的影响(SX);P005FIG2EFFECTSOFMIDAZOLAMONCURRENTINTENSITYFIRINGFREQUENCYIFINAMNACONCENTRATIONDEPENDENTINHIBITORYACTIONSOFMIDAZOLAMONCURRENTINTENSITYFIRINGFREQUENCYIFRELATIONOFMNSINVITROBPLOTTINGOFSPIKEFIRINGFREQUENCYFVSCURRENTINTENSITYIFROMARPWAS–73MVPAIREDTTESTVSCONTROLP00524咪达唑仑对MN背根兴奋性突触后电位的影响在记录到背根电刺激诱发出兴奋性突触后电位(DREPSP)的4个MN,给予0110MMOL/L的咪达唑仑各累积灌流15MIN,观察到咪达唑仑对DREPSP呈现可逆性抑制作用(图3,表2),其中01MMOL/L的咪达唑仑的抑制作用有显著性统计学意义(N3,P005),并呈浓度依赖性特征(图4)。另外,在记录到DREPSP合并抑制性突触后电位(DRIPSP)的3个MN,给予0110MMOL/L咪达唑仑各累积灌流15MIN,随着浓度增大DREPSP逐渐被抑制,而DRIPSP的幅度增大,但在10MMOL/L浓度DRIPSP也被完全取消,作用可被ACSF部分洗出。一个细胞的典型记录例示于图5。表2咪达唑仑对MNDREPSP的影响(SX,N4)TAB2EFFECTSOFMIDAZOLAMONDREPSPOFRATSPINALCORDMNSINVITROSX,N4CONTROLN4MIDAZOLAMMMOL/L01N303N210N2AMPLITUDEMV592317181014AREAUNDERCURVEMVMS241621098201072360509DURATIONMS847513865954390552LATENCYMS674133374867HALFWIDTHMS190158243489126MAXLSLOPEMV/MS704935320811MAXRSLOPEMV/MS12313233290913与对照组比较P005,完全取消20MS10MVCONTROL01WASHMIDAZOLAMMMOL/LDR图3咪达唑仑(01MMOL/L)对MNDREPSP的可逆性抑制作用箭头所指为DR电刺激伪迹,该MN的RP为–68MV。FIG3REVERSIBLEACTIONOFMIDAZOLAM(01MMOL/L)ONDREPSPINAMNINVITROWASHACSFRPWAS68MVARROWINDICATESDRSTIMULUSARTIFACT40MS4MVCONTROL5MIN10MIN15MINDRMIDAZOLAMMMOL/L03105MIN图4咪达唑仑(03,10MMOL/L)浓度依赖性抑制MN的DREPSP箭头所指为DR电刺激伪迹,该MN的RP为–73MV。FIG4CONCENTRATIONDEPENDENTINHIBITORYACTIONOFMIDAZOLAMONDREPSPSINAMNINVITRORPWAS73MVARROWINDICATESDRSTIMULUSARTIFACTCONTROL010310MIDAZOLAMMMOL/LWASH10MS4MVDR图5不同浓度咪达唑仑对MNDREPSP复合DRIPSP的作用箭头所指为DR电刺激伪迹,该MN的RP为–76MV。FIG5EFFECTSOFMIDAZOLAMONDREPSPANDDRIPSPINAMNINVITRORPWAS76MVARROWINDICATESDRSTIMULUSARTIFACT3讨论本实验运用细胞内记录技术,观察到咪达唑仑对新生大鼠脊髓切片MN膜电学性质、动作电位和电刺激背根产生的DREPSP均具有可逆性抑制作用,这可能与咪达唑仑增强GABAA受体活性、阻断NA通道等作用有关。咪达唑仑是临床上常用的一种苯二氮艹卓类BZ静脉麻醉药,BZ受体是GABAA受体主要识别位点之一,位于神经元的突触膜上,与GABAA受体相邻并偶联于共同的CL通道。与异丙酚复合应用于手术病人全身麻醉5,具有良好的镇静作用。目前认为其麻醉作用的分子机制与神经细胞膜上离子通道的活性变化有关6。多年来,Γ氨基丁酸GABA受体及其门控的CL通道复合物一直是全麻机制的研究焦点。BZ类药物可与其相应位点结合,使受体发生变构,促进GABA与低亲和力的GABA位点结合起到增强抑制的效果7。在对中枢神经系统的抑制作用中,有研究8显示咪达唑仑与GABAA受体复合体中的BZ位点结合数目越多,其药理作用也越强,原因可能是咪达唑仑与BZ受体结合后增强GABA与GABAA受体结合,使神经元上CL通道开放,促使CL内流,形成神经细胞膜的超极化状态,从而减少了神经元的兴奋性递质的释放,同时抑制了脑内神经突触对GABA的重摄取。由此可见,本文观察到咪达唑仑抑制脊髓MN的DREPSP的作用,可能是咪达唑仑作用于GABAA受体的结果,特别是在低浓度时,既抑制DREPSP又增强DRIPSP,提供了直接的证据。在我们的实验中,咪达唑仑对脊髓MN的膜电生理特性有影响,能引起去极化反应,并有抑制AP的幅度的趋势,同时对刺激脊髓背根产生的EPSP具有明显的抑制作用。有关高浓度咪达唑仑同时可取消动作电位、DREPSP和DRIPSP的作用,显然不可能是增强GABAA受体作用所致。已有研究表明临床浓度的咪达唑仑对交感神经元钠通道电流具有抑制作用9。也有研究10表明咪达唑仑对CA2和K通道具有抑制作用。本文观察到咪达唑仑对细胞内去极化电流刺激诱发的动作电位具有浓度依赖性抑制作用,在高浓度完全取消动作电位的发放,结合高浓度咪达唑仑也完全取消DRIPSP的作用,表明高浓度咪达唑仑的作用,至少涉及NA通道的阻断作用。咪达唑仑与异丙酚已经被广泛联合运用于临床麻醉中,两药联合运用既可确保患者产生镇静-遗忘效应,又有利于减少各自的用量,降低药物不良反应11,而我们实验室前期的研究显示临床浓度异丙酚对离体脊髓运动神经元有抑制作用,且认为高浓度时通过直接抑制谷氨酸受体而起作用12。结合本文对咪达唑仑作用的观察,提示咪达唑仑可能在MN靶点上与异丙酚有协同作用,其具体机制仍需进一步研究。参考文献1REVESJG,FRAGENRJ,VINIKHR,ETALMIDAZOLAMPHARMACOLOGYANDUSESJANESTHESIOLOGY,1985,6233103242刘金川,陈文彬,姚尚龙咪唑安定药理学特点及其临床应用研究进展J中国热带医学,2004,434854863GOODCHILDCS,NOBLEJTHEEFFECTSOFINTRATHECALMIDAZOLAMONSYMPATHETICNERVOUSSYSTEMREFLEXESINMANAPILOTSTUDYJBRJCLINPHARMACOL,1987,2332792854汪萌芽新生大鼠脊髓切片运动神经元的电生理参数测定J中国应用生理学杂志,1993,921641675O’SHEASM,WONGLC,HARRISONNLPROPOFOLINCREASESAGONISTEFFICACYATTHEGABAARECEPTORJBRAINRES,2000,85223443486夏梦,于布为作用于GABAR的静脉麻醉药异丙酚与咪唑安定之间相互作用的研究进展J国外医学麻醉学与复苏分册,2003,2442312347KOHNOT,KUMAMOTOE,BABAH,ETALACTIONSOFMIDAZOLAMONGABAERGICTRANSMISSIONINSUBSTANTIAGELATINOSANEURONSOFADULTRATSPINALCORDSLICESJANESTHESIOLOGY,2000,9225075158PARKJS,HIGASHIH,NAGATAK,ETALBICUCULLINERESISTANT,CLDEPENDENTGABARESPONSEINTHERATSPINALDORSALHORNJNEUROSCIRES,1999,3342612689郑吉建,庄心良,刘宝刚,等咪唑安定对交感神经元全细胞钠通道电流的抑制作用J中国临床药理学与治疗学,2000,5210811110YAMAKAGEM,MATSUZAKIT,TSUJIGUCHIN,ETALINHIBITORYEFFECTSOFDIAZEPAMANDMIDAZOLAMONCA2ANDKCHANNELSINCANINETRACHEALSMOOTHMUSCLECELLSJANESTHESIOLOGY,1999,90119720711许继元,李茂琴,张舟,等咪唑安定和丙泊酚联用对危重患者镇静遗忘作用的研究J中国危重病急救医学2008,20844945112CHENGLZ,WANGMYEFFECTSOFPROPOFOLONGLUTAMATEINDUCEDRESPONSESINMOTONEURONSOFNEONATERATSPINALCORDSLICES2005ABSTRACTVIEWER/ITINERARYPLANNERWASHINGTON,DCSOCIETYFORNEUROSCIENCE,2005,NO15814,ONLINE
编号:201312191412136384    类型:共享资源    大小:928.00KB    格式:DOC    上传时间:2013-12-19
  
5
关 键 词:
管理 组织 经营
  人人文库网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
关于本文
本文标题:咪达唑仑对新生大鼠离体脊髓运动神经元的作用.doc
链接地址:http://www.renrendoc.com/p-246384.html

当前资源信息

4.0
 
(2人评价)
浏览:20次
abingge上传于2013-12-19

官方联系方式

客服手机:17625900360   
2:不支持迅雷下载,请使用浏览器下载   
3:不支持QQ浏览器下载,请用其他浏览器   
4:下载后的文档和图纸-无水印   
5:文档经过压缩,下载后原文更清晰   

相关搜索

精品推荐

相关阅读

人人文库
关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

网站客服QQ:2846424093    人人文库上传用户QQ群:460291265   

[email protected] 2016-2018  renrendoc.com 网站版权所有   南天在线技术支持

经营许可证编号:苏ICP备12009002号-5