神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤.doc神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤.doc

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1TIANJINMEDICALUNIVERSITY,TIANJIN300070,CHINA;2AFFILIATEDHOSPITALOFMEDICALCOLLEGEOFCHINESEPEOPLE’SARMEDPOLICEFORCE,TIANJIN300162,CHINA;3FIRSTPEOPLE’SHOSPITAL,LINGYUAN122500,LIAONINGPROVINCE,CHINAFANGUANGMING★,STUDYINGFORMASTER’SDEGREE,ATTENDINGPHYSICIAN,TIANJINMEDICALUNIVERSITY,TIANJIN300070,CHINAPHOENIX2A2163COMCORRESPONDENCETOZHANGSAI,DOCTOR,DOCTORALSUPERVISOR,CHIEFPHYSICIAN,AFFILIATEDHOSPITALOFMEDICALCOLLEGEOFCHINESEPEOPLE’SARMEDPOLICEFORCE,TIANJIN300162,CHINAZHANGSAI718YAHOOCOMRECEIVED20100106ACCEPTED20100227神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤★范广明1,张文彬2,张赛2,王丽君3NERVEGROWTHFACTORCOMBINEDWITHNEURALSTEMCELLTRANSPLANTATIONFORTREATINGSPINALCORDINJURYINRATSFANGUANGMING1,ZHANGWENBIN2,ZHANGSAI2,WANGLIJUN3ABSTRACTBACKGROUNDTHEEFFECTSOFSIMPLENEURALSTEMCELLNSCTRANSPLANTATIONONREPAIROFDAMAGEDSPINALCORDARENOTIDEALPREVIOUSSTUDIESHAVESHOWNTHATNERVEGROWTHFACTORNGFHASBOTHEFFECTSOFNEURONNUTRITIONANDPROCESSGROWTHPROMOTION,CANEFFECTIVELYCONTRIBUTETOTHERECOVERYOFNEUROFUNCTIONFOLLOWINGSPINALCORDINJURYSCIOBJECTIVETOINVESTIGATETHEEFFECTOFNEURALSTEMCELLTRANSPLANTATIONCOMBINEDWITHNGFAPPLICATIONONTHERECOVERYOFMOTORFUNCTIONOFRATSWITHSCIMETHODSATOTALOF42SPRAGUEDAWLEYRATSWEREUSEDTOESTABLISHSPIMODELS,ANDTHENDIVIDEDRANDOMLYINTOTHREEGROUPSMEDIUM,SIMPLENSCSORNSCSNGFAT1WEEKFOLLOWINGINJURY,MEDIUM,SIMPLENSCSORNSCSNGFWERESEPARATELYINJECTEDINTODAMAGEDSITESAT1,2,4,6,8WEEKSPOSTINJURY,ALLANIMALSWEREEVALUATEDONTHEHINDLIMBBEHAVIORWITHBASSO,BEATTIEANDBRESNAHANBBBLOCOMOTORRATINGSCALEANDINCLINEDPLANETESTAT4WEEKSPOSTTRANSPLANTATION,HISTOPATHOLOGYHEMATOXYLINEOSINSTAININGANDBRDUIMMUNOHISTOCHEMISTRYWEREPERFORMEDAT8WEEKSPOSTTRANSPLANTATION,HORSERADISHPEROXIDASEHRPNERVETRACEANDSOMATOSENSORYEVOKEDPOTENTIALTESTINGWEREPERFORMEDTOOBSERVETHERECOVERYOFNERVEELECTROPHYSIOLOGYRESULTSANDCONCLUSIONAT4WEEKSFOLLOWINGINJURY,MOTORFUNCTIONOFTHERATHINDLIMBWASSIGNIFICANTLYIMPROVEDINTHESIMPLENSCSGROUPANDNSCSNGFGROUPTHERECOVERYWASRAPIDINTHENSCSNGFGROUPTHANTHESIMPLENSCSGROUPP005THERECOVERYWASSLIGHTINTHEMEDIUMGROUPPATHOLOGICALSECTIONSDEMONSTRATEDTHATNEURITEWASNOTFOUNDINTHEMEDIUMGROUPAFEWNEURITESWERESEENINTHESIMPLENSCSGROUP,ANDMANYNEURITESWEREOBSERVEDINTHENSCSNGFGROUPNUMBERSOFBRDUPOSITIVECELLSANDHRPPOSITIVENERVEFIBERSNSCSNGFGROUPSIMPLENSCSGROUPMEDIUMGROUP,THEREWASSIGNIFICANTDIFFERENCEAMONGGROUPSP001LATENTPERIODANDAMPLITUDEOFSOMATOSENSORYEVOKEDPOTENTIALSINTHENSCSNGFGROUPWERESUPERIORTOTHESIMPLENSCSGROUPP005,ANDSIGNIFICANTLYBETTERTHANTHEMEDIUMGROUPP001RESULTSSUGGESTEDTHATNSCTRANSPLANTATIONCANPROMOTETHERECOVERYOFHINDLIMBFUNCTION,ANDCOMBINEDWITHNGFPRESENTSSYNERGICEFFECTFANGM,ZHANGWB,ZHANGS,WANGLJNERVEGROWTHFACTORCOMBINEDWITHNEURALSTEMCELLTRANSPLANTATIONFORTREATINGSPINALCORDINJURYINRATSZHONGGUOZUZHIGONGCHENGYANJIUYULINCHUANGKANGFU2010;141425722578HTTP//WWWCRTERCNHTTP//ENZGLCKFCOM摘要背景单纯的神经干细胞移植对受损脊髓组织的修复作用并不理想,研究证实神经生长因子兼有神经元营养和促突起生长双重作用,可以有效的促进脊髓损伤后神经功能的恢复。目的观察神经干细胞移植联合应用神经生长因子对脊髓损伤后大鼠运动功能恢复的影响。方法SD大鼠42只,建立急性脊髓损伤模型后随机分成3组,伤后1周于损伤处分别注入培养液、单纯神经干细胞或神经干细胞联合神经生长因子。于伤后1,2,4,6,8周进行BBB评分和斜板实验等运动功能检测。伤后4周取材行病理切片苏木精伊红染色及BRDU免疫组化染色,伤后8周取材行辣根过氧化物酶示踪观察及体感诱发电位观察神经电生理恢复情况。结果与结论伤后4周单纯神经干细胞组、神经干细胞联合神经生长因子组大鼠后肢运动功能均有较明显恢复,神经干细胞联合神经生长因子组较单纯神经干细胞组快,差异有显著性意义P005。培养液组亦有所恢复,但程度较轻。病理切片显示培养液组未见神经轴索通过。单纯神经干细胞组可见少量神经轴索样结构,神经干细胞联合神经生长因子组可见较多神经轴索样结构。BRDU的阳性细胞数及HRP阳性神经纤维数神经干细胞联合神经生长因子组单纯神经干细胞组培养液组且各组之间差异有显著性意义P001。神经干细胞联合神经生长因子组大鼠体感诱发电位的潜伏期、波幅优于单纯神经干细胞组P005,明显优于培养液组P001。结果提示神经干细胞移植对于后肢功能的恢复有促进作用,联合应用神经生长因子有协同效果。关键词脊髓损伤;神经干细胞;神经生长因子;功能恢复;大鼠DOI103969/JISSN16738225201014021范广明,张文彬,张赛,王丽君神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤J中国组织工程研究与临床康复,2010,141425722578HTTP//WWWCRTERORGHTTP//CNZGLCKFCOM范广明,等神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤ISSN16738225CN211539/RCODENZLKHAH2573WWWCRTERORG1天津医科大学,天津市300070;2武警医学院附属医院,天津市300162;3凌源市第一人民医院,辽宁省凌源市122500范广明★,男,1978年生,辽宁省喀左县人,蒙古族,天津医科大学在读硕士,主治医师,主要从事颅脑创伤亚低温治疗,脑肿瘤手术治疗和干细胞移植治疗。PHOENIX2A2163COM通讯作者张赛,博士,博士生导师,主任医师,武警医学院附属医院,天津市300162ZHANGSAI718YAHOOCOM中图分类号R3942文献标识码B文章编号167382252010140257207收稿日期20100106修回日期2010022720100106015/MQ0引言以往的治疗脊髓损伤方法有手术、药物、理疗等1,但均未有突破性进展。神经干细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能,一定条件下可以分化成神经系统的各种细胞,因此在神经损伤修复方面有着良好的应用前景25。神经生长因子NERVEGROWTHFACTOR,NGF是神经系统最主要的神经营养因子之一,兼有神经元营养和促突起生长双重作用6。本实验将神经干细胞NEURALSTEMCELLS,NSCS联合NGF移植于大鼠脊髓损伤区,观察其对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的作用。1材料和方法设计随机对照动物实验。时间及地点实验于200902/08在武警医学院完成。材料实验动物孕1416D的WISTAR大鼠1只;健康雌性SD大鼠42只,10周龄,体质量250300G,购自中国医学科学院动物实验室动物质量合格证号SCXK津20050001。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求7。主要试剂实验方法NSCS的培养和鉴定取孕1416D的WISTAR大鼠1只,引颈处死,体积分数为75的乙醇浸泡消毒,剖腹取出胎鼠。取胎鼠大脑,去除脑膜和血管,浸泡在DMEM/F12液中,用吸管反复吹打成悬液,过100目孔筛网,接种培养瓶中,加EGF10MG/L,BFGF10MG/L,N2添加剂,于37℃,体积分数为5CO2培养箱中培养。3D后换液。加入含BRDU的培养基进行标记。脊髓损伤动物模型的建立选择雌性SD大鼠42只,实验室饲养2周后,用25氯胺酮20MG/KG腹腔注射麻醉,取俯卧位,固定在手术台上,备皮,常规消毒,选择T9棘突,沿后正中线切开背部皮肤及皮下组织,长2030CM,剥离椎旁肌并向两侧牵开,显露T8T9棘突及椎板,用大鼠椎板钳咬除T8棘突、T9棘突及椎板,显露硬膜。剪开硬膜,用由针头特制的刀口切除右半侧脊髓。以右侧后肢瘫痪为造模成功标准。术毕用青霉素盐水冲洗伤口,逐层缝合组织。早晚各挤尿1次,直至恢复排尿反射。动物分组42只急性脊髓损伤动物模型,随机分成3组N14培养液组,单纯NSCS组,NSCSNGF组。损伤1周后分别再次手术,显露出脊髓损伤区域,用微量注射器自损伤处头尾两端向损伤处分别缓慢注入10ΜLDMEM/F12培养液或10ΜL11010L1细胞悬液,3MIN内注射完毕,留针5MIN,用医用生物胶封闭针孔以防止细胞悬液顺针道外溢,逐层缝合伤口。NSCSNGF组大鼠损伤后2H腹腔注射NGF3ΜG/KGD,连续用药1周。各组动物术后均置于普通鼠笼喂养,每天人工排尿两次。BASSOBEATTLEBRESNAHANBBB运动功能评分测定8采取双盲法于造模后1,2,4,6,8,10周对3组大鼠进行BBB运动功能评分测定,共检测6次,取均值。斜板实验斜板试验是将斜板表面垫以6MM厚的橡胶垫,按大鼠身体轴线与斜板纵轴垂直的方向放置大鼠,逐渐增加斜板倾斜角度,大鼠在斜板上至少停留5S,记录斜板倾斜最大角度。分别在术后1,2,4,6,8周进行,每只大鼠测3次,取平均值。体感诱发电位的检测术后第8周,3组各取7只大鼠,参照文献9的方法用KEYPOINT4诱发电位仪测定体感诱发电位。10水合氯醛腹腔注射麻醉,将其平放在水平面上,后肢固定刺激电极。记录电极安放于冠状缝和矢状缝愈合线的相交处头皮下即后肢皮质感觉区,参考电极置于其后方05CM处。给予直流方波电脉冲刺激,以后肢轻微抽动为宜,电流强度为515MA,波宽02MS,频率3HZ,叠加次数5060次,记录体感诱发电位潜伏期及波幅的变化,观察神经电生理恢复情况。主要试剂来源DMEM/F12HYCLONE,USA胎牛血清SIGMA,USA重组大鼠基础碱性成纤维细胞生长因子BFGF、重组大鼠表皮生长因子EGFPEPROTECHN2添加剂胰岛素5MG/L,铁蛋白100ΜG/L,腐胺100ΜMOL/L,亚硒酸钠30NMOL/L,青霉素100U/ML,链霉素100U/ML,谷氨酞胺2MMOL/LPEPROTECH兔抗鼠NGR基因抗体、山羊抗兔抗体SIGMA,USANGF舒泰神药业有限公司,北京范广明,等神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM2574WWWCRTERORG苏木精伊红染色和免疫组化染色3组于伤后4周随机取2只大鼠取材,行伤处组织学检查以证实损伤程度。对组织切片进行苏木精伊红染色和抗BRDU免疫组化染色。每张切片在高倍镜200下任取10个视野,计算每个视野的BRDU阳性细胞数,取其均值。HRP逆行神经示踪术后8周,以生理盐水溶解HRP。每组随机取2只动物,麻醉后手术暴露脊髓。于T12髓背正中静脉左、右侧1MM处进针,进针深度15MM。以01ΜL/10MIN的速度注射50HRP1ΜL,注射完毕后留针15MIN。3D后水合氯醛麻醉,40G/L多聚甲醛心脏灌注,取出脊髓T3T12,浸入300G/L的蔗糖溶液4℃18H后制作成5ΜM的冰冻切片,DAB加强染色。在光镜下计数脊髓横切面上HRP阳性神经纤维束数目,各组随机抽取10张切片进行阳性纤维束计数。主要观察指标后肢运动功能,BRDU阳性细胞数,HRP阳性神经纤维束数目,体感诱发电位。设计、实施、评估者设计、实施为第一作者,评估为第二作者,采用盲法评估。统计学分析数据以X_S表示,采用SPSS150统计软件进行完全随机设计的方差分析。两组之间比较用DUNNETTT检验,以P005为差异有显著性意义。2结果21实验动物数量分析中途死亡4只,随即补充,进入结果分析仍为42只SD大鼠。22神经干细胞形态观察脑组织单细胞悬液接种于培养瓶后1H,大部分细胞沉积瓶底,圆形,无突起。同时可以观察到小的细胞团。1D后,神经干细胞团增多,较小,形状不规则。小部分细胞团贴壁。5D后,神经干细胞球增多,较大,形状规则,成球形。见图1。23BBB评分伤前各组BBB评分均为21分。伤后大鼠均表现为完全截瘫,后肢及尾无活动,排尿障碍,排便未见明显障碍。伤后4D时出现对针刺的回缩反应,伤后2周出现后肢运动,伤后4周可见明显后肢活动,伤后6周后肢可出现协调活动,排尿功能部分恢复,但仍有膀胱残余尿。伤后8周评分较6周略有上升。3组变化过程相同,单纯NSCS组,NSCSNGF组评分高于培养液组,伤后6,8周NSCSNGF组与培养液组差异有显著性意义。见表1。24斜板实验结果伤后6周NSCSNGF组与培养液组比较差异有显著性意义P001;NSCSNGF组与单纯NSCS组比较差异有显著性意义P005。NSCSNGF组效果优于单纯NSCS组。见表2。25体感诱发电位检测各组大鼠体感诱发电位潜伏期和波幅见表3。FIGURE1MORPHOLOGYOFPRIMARYCULTUREDNEURALSTEMCELLSUNDERAPHASECONTRASTMICROSCOPE40图1相差显微镜下观察培养的原代NSCS形态40表1伤后各组大鼠后肢功能BBB评分TABLE1BASSO,BEATTIEANDBRESNAHANBBBLOCOMOTORRATINGSCALEINFUNCTIONOFRATHINDLIMBINEACHGROUPFOLLOWINGINJURYX_S,N12TIMEWKMEDIUMGROUPSIMPLENSCSGROUPNSCSNGFGROUP106010501050121503160217014490753086406665058604B9904AC870069005B12507ACNSCSNEURALSTEMCELLS;NGFNERVEGROWTHFACTOR;AP001,BP005,VSMEDIUMGROUP;CP005,VSSIMPLENSCSGROUP表2伤后各组大鼠后肢功能斜角实验TABLE2TESTOFINCLINEDPLANEINTHERATHINDLIMBOFEACHGROUPAFTERINJURYX_S,N12,TIMEWKMEDIUMGROUPSIMPLENSCSGROUPNSCSNGFGROUP11000611107113052120081260614409415409202082520561990722008B27506AC82230925106B29007ACNSCSNEURALSTEMCELLS;NGFNERVEGROWTHFACTOR;AP001,BP005,VSMEDIUMGROUP;CP005,VSSIMPLENSCSGROUP表3移植后8周各组大鼠体感诱发电位检测TABLE3SOMATOSENSORYEVOKEDPOTENTIALTESTINGINRATSOFEACHGROUPAT8WKAFTERTRANSPLANTATIONX_S,N7GROUPLATENTPERIODMSAMPLITUDEMVMEDIUM152430027410746304763SIMPLENSCS13961005247A1245104332ANSCSNGF12321004378B1916905046BNSCSNEURALSTEMCELLS;NGFNERVEGROWTHFACTOR;AP005,BP001,VSMEDIUMGROUP范广明,等神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤ISSN16738225CN211539/RCODENZLKHAH2575WWWCRTERORG建立脊髓半横断损伤模型后,进行体感诱发电位检测发现各组动物的诱发电位波形完全消失。移植后8周,培养液组体感诱发电位少量恢复,NSCSNGF组体感诱发电位明显恢复,波幅增高图2。单纯NSCS组与培养液组比较差异有显著性意义P005图3,NSCSNGF组与培养液组比较差异有非常显著性意义P001。表明NSCSNGF组电信号从后肢到头皮传导时间比其他组都短,传导通路已经畅通,恢复较好。26苏木精伊红染色和免疫组化染色结果伤后4周培养液组可见损伤处脊髓组织断裂,为瘢痕连接,结构紊乱,有明显空洞形成图4。单纯NSCS组见星形胶质细胞在损伤的边缘聚集在完整的脊髓与受损脊髓的交界处形成瘢痕,组织空洞小于培养液组,而大于NSCSNGF组图5。NSCSNGF组见星形胶质细胞反应性肥大,在损伤的边缘聚集,并在脊髓受损伤的边缘形成瘢痕,部分细胞呈长梭形,突起与突起之间构成致密的网络,空洞消失图6。免疫组化染色检测大鼠脊髓损伤灶组织中的BRDU阳性细胞数见表4及图79。经过方差分析后两组之间的FIGURE2SOMATOSENSORYEVOKEDPOTENTIALWAVEFORMINTHENEURALSTEMCELLSNERVEGROWTHFACTORGROUP图2NSCSNGF组体感诱发电位波形FIGURE3SOMATOSENSORYEVOKEDPOTENTIALWAVEFORMINTHENEURALSTEMCELLSGROUP图3NSCS组体感诱发电位波形FIGURE4INTHEMEDIUMGROUP,TISSUEFRACTURE,SCARCONNECTIONANDDISORDERSTRUCTURE,WITHSIGNIFICANTCAVITATIONATTHEDAMAGEDSITEHEMATOXYLINEOSINSTAINING,40图4培养液组可见损伤处组织断裂,为瘢痕连接,结构紊乱,有明显空洞形成苏木精伊红染色,40FIGURE5INTHESIMPLENEURALSTEMCELLSGROUP,TYPICALNEURALCELLSLIKECHANGESATTHETRANSPLANTEDREGION;WITHSMALLTISSUECAVITYCOMPAREDWITHTHEMEDIUMGROUP,BIGTISSUECAVITYCOMPAREDWITHTHENEURALSTEMCELLSNERVEGROWTHFACTORGROUPHEMATOXYLINEOSINSTAINING,40图5单纯NSCS组可见在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变,组织空洞小于培养液组,而大于NSCSNGF组苏木精伊红染色,40FIGURE6INTHENEURALSTEMCELLSNERVEGROWTHFACTORGROUP,TYPICALNEURALCELLLIKECHANGESANDDISAPPEAREDCAVITYHEMATOXYLINEOSINSTAINING,40图6NSCSNGF组出现典型的神经细胞样形态学改变且空洞消失苏木精伊红染色,40范广明,等神经生长因子联合神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤POBOX1200,SHENYANG110004CNZGLCKFCOM2576WWWCRTERORG比较用DUNNETTT检验,各组之间差异有非常显著性意义P001。27HRP逆行神经示踪注入HRP后2D,HRP逆行运输,至T8以上节段可见HRP阳性颗粒标记的神经纤维数目NSCSNGF组单纯NSCS组培养液组,见表4及图1012。表4伤后各组大鼠BRDU阳性细胞数及HRP阳性神经纤维束TABLE4NUMBERSOFHORSERADISHPEROXIDASEHRPPOSITIVENERVEFIBERSANDBRDUPOSITIVENEURONINRATSOFEACHGROUPFOLLOWINGINJURYX_S,N10GROUPBRDUPOSITIVECELLNUMBER4WKPOSTTRAUMAHRPPOSITIVENERVEFIBERNUMBER8WKPOSTTRAUMAMEDIUM37915121042171SIMPLENSCS92536174121242NSCSNGF113217638532456NSCSNEURALSTEMCELLS;NGFNERVEGROWTHFACTOR;P001,VSBRDUPOSITIVECELLNUMBERAMONGGROUPSAT4WKPOSTTRAUMA;P001,VSHRPPOSITIVENERVEFIBERNUMBERAMONGGROUPSAT8WKPOSTTRAUMAFIGURE7INTHEMEDIUMGROUP,PARAFFINSECTIONSHOWEDSCATTERBRDULABELEDCELLSATTHEDAMAGESITEAT2WKFOLLOWINGTRANSPLANTATIONUNDERAMICROSCOPE40图7培养液组细胞移植后2周损伤处石蜡切片显微镜下观察可见仍有散在的BRDU标记的细胞40FIGURE8INTHESIMPLENEURALSTEMCELLGROUP,NUMBERSOFBRDULABELEDCELLSWERELESSTHANTHENEURALSTEMCELLSNERVEGROWTHFACTORGROUP,BUTMORETHANTHEMEDIUMGROUPATDAMAGESITEAT2WKFOLLOWINGTRA
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