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通心络胶囊干预载脂蛋白E 基因敲除小鼠MMP-1, MMP-9 及TIMP1 的研究.doc通心络胶囊干预载脂蛋白E 基因敲除小鼠MMP-1, MMP-9 及TIMP1 的研究.doc -- 5 元

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通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠MMP1、MMP9及TIMP1的研究StudyofTongxinluoCapsuleinInterventionofApolipoproteinEGeneKnockingOutMMP1,MMP9andTIMP1inMice韩旭李七一夏卫军赖仁胜陈小虎郭宏敏赵惠HanXu,LiQiyi,XiaWeijun,LaiRensheng,ChenXiaohu,GuoHongmin,ZhaoHui江苏省中医院(中国210029)TraditionalChineseMedicineHospitalinJiangsuProvinceChina,210029中图分类号R285.6文献标识码A文章编号1818-0086(2010)04摘要目的通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除〔ApoE(/)〕模型组小鼠基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(TIMP1)水平等指标的干预变化,探究其治疗冠心病(CHD)的机理。方法将40只ApoE(/)小鼠作为实验组,建立冠状动脉粥样硬化(AS)模型,随机分为模型组等5组,分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预,另选8只同系的小鼠作为正常对照组。通过对模型组小鼠血清MMP1、MMP9和TIMP1水平的观察,比较分析通心络胶囊对ApoE(/)小鼠冠状AS的调节作用并探讨其机理。结果通心络胶囊高剂量组小鼠血清MMP1和MMP9水平均低于模型组,而TIMP1水平高于模型组,与模型组相比,均有统计学意义(P0.05或P0.01)。通心络胶囊中剂量组小鼠血清MMP9水平低于模型组,与模型组相比有统计学意义(P0.05)。结论通心络胶囊具有抑制血管重构和稳定斑块的作用。关键词通心络胶囊ApoE(/)小鼠冠状ASMMP1MMP9TIMP1干预AbstractObjectivesToinvestigatemechanismofTongxinluoCapsulemanagingcoronaryheartdiseaseCHDbyobservingchangesresultingfrominterventionofapolipoproteinEgeneknockingoutApoE/MMP1,MMP9andTIMP1inmicemodel.Method40ApoE/mice,asexperimentalgroup,wereusedtoestablishcoronaryarteriosclerosisASmodelandthenwererandomlydividedinto5modelgroups.SimvastatinandTongxinluoCapsuleatdifferentdosagewereadministratedtomicerespectivelyasinterventionand8miceofsamekindwereselectedascontrolgroup.TongxinluoCapsuleseffectinregulatingcoronaryASinApoE/miceanditsmechanismwerecomparedandanalysedduringtheexperimentbyobservingserumMMP1,MMP9andTIMP1levelsinmodelmice.ResultsingroupadministratedhighdoseTongxinluoCapsule,serumMMP1andMMP9levelwerelowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,butTIMP1washigher.ThedifferenceissignificantstatisticallyP0.05orP0.01.InthegroupadministratedmoderatedosageTongxinluoCapsule,theserumMMP9waslowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,whichalsohasstatisticalsignificanceP0.05.ConclusionTongxinluoCapsuleisofsomeeffectintheinhibitionofvascularremodelingandstabilizationofplaques.KeywordsTongxinluoCapsule,ApoE/mice,coronaryAS,MMP1,MMP9,TIMP1,intervention1实验材料1.1药品与试剂通心络胶囊石家庄以岭药业股份有限公司生产,规格每粒0.38克。批号20060501。MMP1、MMP9、TIMP1测定试剂盒,购自晶美生物工程有限公司,美国OrionoDiagostica公司生产,批号00604。胆固醇,上海生化试剂厂,批号051124。1.2实验动物ApoE(/)小鼠,40只,鼠龄8周龄,雌雄各半,体重1822g。(品系C57BL/6J,购自美国Jackson实验室)由北京大学实验动物中心提供。同遗传背景C57BL/6J小鼠8只,鼠龄8周龄,雌雄各半,体重1822g。动物生产许可证号SCXK(京)20020001。南京中医药大学实验中心,实验动物使用许可证SYXK(苏)20020123。1.3实验仪器SYSMAX全自动生化分析仪日本SYSMEX公司TGL16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂UN754分光光度计上海第三分析仪器厂JA2003分析天平上海天平仪器厂AUP235G01实验室级专用超纯化水机重庆颐洋实业有限公司DKZ2型电热恒温振荡水槽上海精宏实验设备有限公司LDZ52低速自动平衡离心机北京医用离心机厂LRB12752计数器芬兰1.4实验条件小鼠单笼饲养,自由饮水,室温20±2℃。2实验方法2.1高脂饲料配制方法以5胆固醇,10猪油,0.1丙基硫氧嘧啶,加入小鼠标准饲料粉中。饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料。2.2ApoE(/)小鼠冠状动脉粥样硬化建立ApoE(/)小鼠适应性喂养一周后给予高脂饲料,连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠8只,雌雄各半作为正常对照组,2.3给药方法和剂量2.3.1正常对照组喂普通颗粒小鼠饲料,同时给予等量蒸馏水。2.3.2模型组喂高脂饲料,同时给予等量蒸馏水。2.3.3通心络胶囊1组除与模型对照组相同外,给予通心络胶囊2g(生药)/kg体重。2.3.4通心络胶囊2组除与模型对照组相同外,给予通心络胶囊4g(生药)/kg体重。2.3.5通心络胶囊3组除与模型对照组相同外,给予通心络胶囊8g(生药)/kg体重。2.3.6辛伐他汀组除与模型对照组相同外,给予辛伐他汀0.05g/kg体重。2.4血清MMP1、MMP9、TIMP1浓度水平测定采用定量夹心酶免疫分析技术。3统计分析方法描述性统计分析,定性指标以频数表,百分率或构成比描述定量指标以均数,标准差描述。两组对比分析,定性资料采用卡方检验,Fisher精确概率法,Wilcoxon秩和检验,CMH2检验。定量资料符合正态分布用t检验(组间进行方差齐性检验,以0.05作为检验水准,方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验),不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验,Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验,给出检验统计量及其对应的P值。以P≤0.05作为有统计学意义,以P≤0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。4实验结果从表1中可见,ApoE(/)小鼠造模后12周,模型组ApoE(/)小鼠血清MMP1和MMP9水平显著升高,而TIMP1水平显著降低,与正常组相比,均有统计学意义(P0.05或P0.01)。通心络胶囊高剂量组ApoE(/)小鼠血清MMP1和MMP9水平均低于模型组,而TIMP1水平高于模型组,与模型组相比,均有统计学意义(P0.05或P0.01)。通心络胶囊中剂量组ApoE(/)小鼠血清MMP9水平低于模型组,与模型组相比,有统计学意义(P0.05)。表1通心络胶囊对ApoE(/)小鼠血清MMP1、MMP9及TIMP1水平的影响(μg/L,X±S)分组剂量(g/Kg)动物数(n)MMP1MMP9TIMP1正常组8290.88±15.36482.63±47.65157.88±21.56模型组8330.63±38.33▲805.63±120.14▲▲63.38±11.76▲▲低剂量组28308.88±50.30656.63±83.2370.25±22.63中剂量组48312.13±38.68666.88±137.8987.25±30.41高剂量组88283.63±38.64648.88±112.1593.88±25.48辛伐他汀组0.058293.75±28.71568.50±104.4988.75±24.59注与正常组相比,▲▲P0.01,▲P0.05与模型组比较,P0.05,P0.01。5讨论AS的形成涉及脂质代谢紊乱、血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移和增殖等。大量研究已证实,细胞外基质(ECM)合成或降解失衡是AS形成过程中十分重要的环节,AS形成过程也是ECM重建即血管重构的过程2。基质金属蛋白酶(MMPs)是一族可降解ECM胶原的重要蛋白酶类,在AS发生期可促进VSMC向内皮的移位,其在分解冠脉粥样斑块纤维帽ECM,使纤维帽变薄、易于破裂方面起着重要作用3。研究发现,粥样斑块组织中,尤其是纤维斑块的肩部可检出大量巨噬细胞及多种MMPs。在泡沫化过程中多种细胞因子调节其他细胞分泌大量MMPs进一步降解ECM,促使脂质条纹的形成并加速粥样斑块的发展4。MMP1是MMPs家族重要的一员,主要降解间质胶原Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、X型胶原和蛋白聚糖的核心蛋白。研究表明MMP1的表达及活性增强与CHD的发生、发展密切相关5。Nikkari等6报道人类AS斑块脂质核心强烈表达MMP1,通过降解Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白,使纤维帽变薄,促进粥样斑块进入不稳定状态。另外,原位酶谱实验证明人的粥样斑块,尤其是机械张力最高之处,MMP1表达增加7倍,而该处又是斑块破裂常见之处,据此推测,在这些部位基质降解过度同时又有机械张力过度而使纤维帽破裂7。MMP9是MMPs家族中明胶酶的一种,研究表明8,MMP9与AS关系密切,可以高效降解基底膜的主要成分IV型胶原。Brown等9报道MMP9通常在新近斑块破裂的冠状动脉旋切标本中表达。Peterson等10研究发现MMP9含量在不稳定心绞痛病人斑块组织中明显高于稳定型心绞痛病人,MMP9的过表达,可使ECM降解活性增强,从而降低斑块强度,促使斑块破裂。冠状动脉内径狭窄程度也与MMP9呈正相关。TIMP1为MMPs的组织抑制剂11,Inokubo等12.13.14认为正常内皮细胞和平滑肌细胞有TIMP1和MMP9的表达,且两者处于平衡状态,以共同维持ECM合成与降解相对平衡,使斑块趋向稳定,不易破裂。MMP9升高、TIMP1的降低预示着硬化斑块的不稳定或破裂。在急性冠状动脉综合征的发生过程中,MMP9表达增加大于TIMP1表达增加,使冠状AS斑块纤维帽的胶原降解大于合成,导致斑块脆性增加并最终破裂15。George16研究证实用TIMP1或调节其与MMP9之间的比例可起到治疗AS的作用。我们既往研究提示通心络胶囊具有抑制ApoE/小鼠冠状AS的作用17,本实验结果表明该药还能通过抑制MMP1、MMP9和升高TIMP1血中浓度而具有抑制血管重构和稳定斑块作用,且其强度与药量的大小有关,推测其机制可能为①抑制VSMC的增殖和移行,②调节ECM的合成和降解,③稳定斑块纤维帽。参考文献1JnaL.Breslwo.MousemodelsofatheroselerosisJ.Seinece1996,V0L272685688.2温进坤,韩美.基质金属蛋白酶与血管壁细胞外基质重建J.生命的化学,2002225461463.3ShahPK,FalkE,BadimonJJ,etal.HumanmonocytederivedmacrophagesinducecollagenbreakdowninfibrouscapsofatheroscleroticplaquepotentialroleofmatrixdegradingmetaloproteinasesandimplicationsforplaqueruptureJ.circulation,1995,9215651569.4SmeglinA,FrishmanWH.ElastinolyticmatrixmetalloproteinasesandtheirinhibitorsastherapeutictargetsinatheroscleroticplaqueinstabilityJ.CardiologyinReview,200412141150.5GalinaK,UweS,ElenaR,etalEvidenceforincreasedcollagenolysisbyinterstitialcollagenasesland3invulnerablehumanatheromatousplaquesJcirculation,1999,9925032509.6NikkariST,OBrienKD,FergusonM,HatsukamiT,WelgusHG,AlpersCE,etal.Interstitialcollagenase(MMP1)expressioninhumancarotidatherosclerosisJ.Circulation,1995,921393398.7LeeRT,LibbyPTheunstableatheromaJArteriosclerThrombVascBiol,1997,1718591879.8PollanenPJ,KarhunenPJ,MikkelssonJetal.Coronaryarterycomplicatedlesionareaisrelatedtofunctionalpolymorphismofmatrixmetalloproteinase9geneanautopsystudyJ.ArteriosclerThrombVascBiol.2001,2114461450.9BrownDL,HibbsMS,KearneyM,etal.Identificationof92KDgelatinaseinhumancoronaryatheroscleroticlesions,AssociationofactiveenzymesynthesiswithunstableanginaJ.Circulation,19959121252131.10PetersonM,PorterKE,LoftusIM,etal.MarimastatinhibitsneointimalthickeninginamodelofhumanarterialintimalhyperplasiaJ.EurJVascEndovascSurg.2000,19461467.11CaiW,VosschulteR,AfsahHedjriA,etal.AlteredbalancebetweenextracellularproteolysisandantiproteolysisisassociatedwithadaptivecoronaryarteriogenesisJ.JMolCellCardiol,2000,329971011.12InokuboY,HanadaH,IshizakaH,etal.Plasmalevelsofmatrixmetalloproteinase9andtissueinhibitorofmetalloproteinase1areincreasedinthecoronarycirculationinpatientswithacutecoronarysyndromeJ.AmHeartJ,2001,141211217.13DolleryCM,HumphriesSE,McClellandA,etal.Expressionoftissueinhibitorofmatrixmetalloproteinases1byuseofanadenoviralvectorinhibitorssmoothmusclecellmigrationandreducesneointimalhyperplasiaintheratmodelofvascularballooninjuryJ.Circulation,1999,9931993205.14YoonYW,KwonHM,HwangKC,eta.lUpstreamregulrationofmatrixmetaloproteinasebyEMMPRINextracellularmatrixmetalloproteinaseinducerinadvancedatheroscleroticplaqueJ.Atherosclerosis,2005,180137~44.15FurmanC,LuoZ,WalshK,eta.lSystemictissueinhibitorofmetalloproteinase1genedeliveryreducesneointimalhyperplasiainballooninjuredratcarotidarteryJ.FEBSLet,t2002,531(2)122126.16GeorgeSJ.TherapeuticpotentialofmatrixmetaloproteinasesinhibitorsinatherosclerosisJ.ExpertOpinInvestigDrugs,2000,99931007.17李七一,韩旭,夏卫军等.通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲出小鼠冠状动脉硬化的影响J.南京医科大学学报,20092991237~1241.
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