通心络胶囊干预载脂蛋白E 基因敲除小鼠MMP-1, MMP-9 及TIMP1 的研究.doc

通心络胶囊干预载脂蛋白E基因敲除小鼠MMP-1、MMP-9及TIMP1的研究StudyofTongxinluoCapsuleinInterventionofApolipoproteinEGeneKnockingOutMMP-1,MMP-9andTIMP1inMice韩旭李七一夏卫军赖仁胜陈小虎郭宏敏赵惠HanXu,LiQiyi,XiaWeijun,LaiRensheng,ChenXiaohu,GuoHongmin,ZhaoHui江苏省中医院（中国210029）TraditionalChineseMedicineHospitalinJiangsuProvince(China,210029)中图分类号：R285.6文献标识码：A文章编号：18180086（2010）04摘要：目的通过通心络胶囊对载脂蛋白E基因敲除ApoE（-/-）模型组小鼠基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1（TIMP1）水平等指标的干预变化，探究其治疗冠心病（CHD）的机理。方法将40只ApoE（-/-）小鼠作为实验组，建立冠状动脉粥样硬化（AS）模型，随机分为模型组等5组，分别给予辛伐他汀及不同剂量的通心络胶囊进行干预，另选8只同系的小鼠作为正常对照组。通过对模型组小鼠血清MMP-1、MMP-9和TIMP1水平的观察，比较分析通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠冠状AS的调节作用并探讨其机理。结果通心络胶囊高剂量组小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊中剂量组小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比有统计学意义（P0.05）。结论通心络胶囊具有抑制血管重构和稳定斑块的作用。关键词：通心络胶囊；ApoE（-/-）小鼠；冠状AS；MMP-1；MMP-9；TIMP1；干预AbstractObjectivesToinvestigatemechanismofTongxinluoCapsulemanagingcoronaryheartdisease(CHD)byobservingchangesresultingfrominterventionofapolipoproteinEgeneknockingoutApoE(-/-)MMP-1,MMP-9andTIMP1inmicemodel.Method40ApoE(-/-)mice,asexperimentalgroup,wereusedtoestablishcoronaryarteriosclerosis(AS)modelandthenwererandomlydividedinto5modelgroups.SimvastatinandTongxinluoCapsuleatdifferentdosagewereadministratedtomicerespectivelyasinterventionand8miceofsamekindwereselectedascontrolgroup.TongxinluoCapsuleseffectinregulatingcoronaryASinApoE(-/-)miceanditsmechanismwerecomparedandanalysedduringtheexperimentbyobservingserumMMP-1,MMP-9andTIMP1levelsinmodelmice.ResultsingroupadministratedhighdoseTongxinluoCapsule,serumMMP-1andMMP-9levelwerelowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,butTIMP1washigher.Thedifferenceissignificantstatistically(P0.05orP0.01).InthegroupadministratedmoderatedosageTongxinluoCapsule,theserumMMP-9waslowerthanthatinmodelgroupwithoutintervention,whichalsohasstatisticalsignificance(P0.05).ConclusionTongxinluoCapsuleisofsomeeffectintheinhibitionofvascularremodelingandstabilizationofplaques.KeywordsTongxinluoCapsule,ApoE(-/-)mice,coronaryAS,MMP-1,MMP-9,TIMP1,intervention1实验材料1.1药品与试剂通心络胶囊：石家庄以岭药业股份有限公司生产，规格：每粒0.38克。批号：20060501。MMP-1、MMP-9、TIMP1测定试剂盒，购自晶美生物工程有限公司，美国OrionoDiagostica公司生产，批号：00604。胆固醇，上海生化试剂厂，批号：051124。1.2实验动物ApoE（-/-）小鼠，40只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。（品系C57BL/6J，购自美国Jackson实验室）由北京大学实验动物中心提供。同遗传背景C57BL/6J小鼠8只，鼠龄8周龄，雌雄各半，体重18-22g。动物生产许可证号：SCXK（京）2002-0001。南京中医药大学实验中心，实验动物使用许可证：SYXK（苏）2002-0123。1.3实验仪器SYSMAX全自动生化分析仪日本SYSMEX公司TGL16G台式高速离心机上海医用分析仪器厂UN754分光光度计上海第三分析仪器厂JA2003分析天平上海天平仪器厂AUP-2-35G-01实验室级专用超纯化水机重庆颐洋实业有限公司DKZ2型电热恒温振荡水槽上海精宏实验设备有限公司LDZ52低速自动平衡离心机北京医用离心机厂LRB-12752计数器芬兰1.4实验条件小鼠单笼饲养，自由饮水，室温202。2实验方法2.1高脂饲料配制方法以5%胆固醇，10%猪油，0.1%丙基硫氧嘧啶，加入小鼠标准饲料粉中。饲料粉经充分混合后由江苏省青龙山动物养殖场加工成颗粒饲料。2.2ApoE（-/-）小鼠冠状动脉粥样硬化建立ApoE（-/-）小鼠适应性喂养一周后给予高脂饲料，连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠8只，雌雄各半作为正常对照组，2.3给药方法和剂量2.3.1正常对照组喂普通颗粒小鼠饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.2模型组：喂高脂饲料，同时给予等量蒸馏水。2.3.3通心络胶囊1组除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊2g（生药）/kg体重。2.3.4通心络胶囊2组除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊4g（生药）/kg体重。2.3.5通心络胶囊3组除与模型对照组相同外，给予通心络胶囊8g（生药）/kg体重。2.3.6辛伐他汀组除与模型对照组相同外，给予辛伐他汀0.05g/kg体重。2.4血清MMP-1、MMP-9、TIMP1浓度水平测定采用定量夹心酶免疫分析技术。3统计分析方法描述性统计分析，定性指标以频数表，百分率或构成比描述；定量指标以均数，标准差描述。两组对比分析，定性资料采用卡方检验，Fisher精确概率法，Wilcoxon秩和检验，CMH2检验。定量资料符合正态分布用t检验（组间进行方差齐性检验，以0.05作为检验水准，方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验），不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验，Wilcoxon符号秩和检验。假设检验统一使用双侧检验，给出检验统计量及其对应的P值。以P0.05作为有统计学意义，以P0.01作为有高度统计学意义。以上统计分析均用SAS统计软件进行处理。4实验结果从表1中可见，ApoE（-/-）小鼠造模后12周，模型组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平显著升高，而TIMP1水平显著降低，与正常组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊高剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1和MMP-9水平均低于模型组，而TIMP1水平高于模型组，与模型组相比，均有统计学意义（P0.05或P0.01）。通心络胶囊中剂量组ApoE（-/-）小鼠血清MMP-9水平低于模型组，与模型组相比，有统计学意义（P0.05）。表1通心络胶囊对ApoE（-/-）小鼠血清MMP-1、MMP-9及TIMP1水平的影响（g/L，XS）分组剂量（g/Kg）动物数（n）MMP-1MMP-9TIMP1正常组8290.8815.36482.6347.65157.8821.56模型组-8330.6338.33805.63120.1463.3811.76低剂量组28308.8850.30656.6383.23*70.2522.63中剂量组48312.1338.68666.88137.89*87.2530.41高剂量组88283.6338.64*648.88112.15*93.8825.48*辛伐他汀组0.058293.7528.71*568.50104.49*88.7524.59*注：与正常组相比，P0.01，P0.05；与模型组比较，*P0.05，*P0.01。5讨论AS的形成涉及脂质代谢紊乱、血管平滑肌细胞（VSMC）的迁移和增殖等。大量研究已证实，细胞外基质（ECM）合成或降解失衡是AS形成过程中十分重要的环节，AS形成过程也是ECM重建即血管重构的过程2。基质金属蛋白酶（MMPs）是一族可降解ECM胶原的重要蛋白酶类，在AS发生期可促进VSMC向内皮的移位，其在分解冠脉粥样斑块纤维帽ECM，使纤维帽变薄、易于破裂方面起着重要作用3。研究发现，粥样斑块组织中，尤其是纤维斑块的肩部可检出大量巨噬细胞及多种MMPs。在泡沫化过程中多种细胞因子调节其他细胞分泌大量MMPs进一步降解ECM，促使脂质条纹的形成并加速粥样斑块的发展4。MMP-1是MMPs家族重要的一员，主要降解间质胶原、X型胶原和蛋白聚糖的核心蛋白。研究表明MMP-1的表达及活性增强与CHD的发生、发展密切相关5。Nikkari等6报道人类AS斑块脂质核心强烈表达MMP-1，通过降解型和型胶原蛋白，使纤维帽变薄，促进粥样斑块进入不稳定状态。另外，原位酶谱实验证明人的粥样斑块，尤其是机械张力最高之处，MMP-1表达增加7倍，而该处又是斑块破裂常见之处，据此推测，在这些部位基质降解过度同时又有机械张力过度而使纤维帽破裂7。MMP-9是MMPs家族中明胶酶的一种，研究表明8，MMP-9与AS关系密切，可以高效降解基底膜的主要成分IV型胶原。Brown等9报道MMP-9通常在新近斑块破裂的冠状动脉旋切标本中表达。Peterson等10研究发现MMP-9含量在不稳定心绞痛病人斑块组织中明显高于稳定型心绞痛病人，MMP-9的过表达，可使ECM降解活性增强，从而降低斑块强度，促使斑块破裂。冠状动脉内径狭窄程度也与MMP-9呈正相关。TIMP1为MMPs的组织抑制剂11，Inokubo等12.13.14认为正常内皮细胞和平滑肌细胞有TIMP1和MMP9的表达，且两者处于平衡状态，以共同维持ECM合成与降解相对平衡，使斑块趋向稳定，不易破裂。MMP-9升高、TIMP1的降低预示着硬化斑块的不稳定或破裂。在急性冠状动脉综合征的发生过程中，MMP-9表达增加大于TIMP1表达增加，使冠状AS斑块纤维帽的胶原降解大于合成，导致斑块脆性增加并最终破裂15。George16研究证实用TIMP1或调节其与MMP-9之间的比例可起到治疗AS的作用。我们既往研究提示：通心络胶囊具有抑制ApoE(-/-)小鼠冠状AS的作用17，本实验结果表明该药还能通过抑制MMP-1、MMP-9和升高TIMP1血中浓度而具有抑制血管重构和稳定斑块作用，且其强度与药量的大小有关，推测其机制可能为：抑制VSMC的增殖和移行，调节ECM的合成和降解，稳定斑块纤维帽。参考文献：1JnaLBreslwoMousemodelsofatheroselerosisJSeinece1996，V0L272：685-6882温进坤,韩美.基质金属蛋白酶与血管壁细胞外基质重建J.生命的化学,2002；22(5):461-463.3ShahPK,FalkE,BadimonJJ,etal.Humanmonocyte-derivedmacrophagesinducecollagenbreakdowninfibrouscapsofathero-scleroticplaque:potentialroleofmatrix-degradingmetal-oproteinasesandimplicationsforplaqueruptureJ.circulation,1995,92:1565-1569.4SmeglinA,FrishmanWH.Elastinolyticmatrixmetallopro-teinasesandtheirinhibitorsastherapeutictargetsinatheroscleroticplaqueinstabilityJ.CardiologyinReview,2004；12:141-150.5GalinaK,UweS,ElenaR,etalEvidenceforincreasedcollagenolysisbyinterstitialcollagenases-land-3invulnerablehumanathero-matousplaquesJcirculation,1999,99:25032509.6NikkariST,OBrienKD,FergusonM,HatsukamiT,WelgusHG,AlpersCE,etal.Interstitialcollagenase（MMP-1）expressioninhumancarotidatherosclerosisJ.Circulation,1995,92:1393-398.7LeeRT,LibbyPTheunstableatheromaJArteriosclerThrombVascBiol,1997,17:18591879.8PollanenPJ,KarhunenPJ,MikkelssonJetal.Coronaryarterycomplicatedlesionareaisrelatedtofunctionalpolymorphismofmatrixmetalloproteinase9gene:anautopsystudyJ.Arterios-clerThrombVascBiol.2001,21:1446-1450.9BrownDL,HibbsMS,KearneyM,etal.Identificationof92-KDgelatinaseinhumancoronaryatheroscleroticlesions,AssociationofactiveenzymesynthesiswithunstableanginaJ.Circulation,1995；91:2125-2131.10PetersonM,PorterKE,LoftusIM,etal.MarimastatinhibitsneointimalthickeninginamodelofhumanarterialintimalhyperplasiaJ.EurJVascEndovascSurg.2000,19:461-467.11CaiW,VosschulteR,Afsah-HedjriA,etal.AlteredbalancebetweenextracellularproteolysisandantiproteolysisisassociatedwithadaptivecoronaryarteriogenesisJ.JMolCellCardiol,2000,32:997-1011.12InokuboY,HanadaH,IshizakaH,etal.Plasmalevelsofmatrixmetalloproteinase-9andtissueinhibitorofmetalloproteinase-1areincreasedinthecoronarycirculationinpatientswithacutecoronarysyndromeJ.AmHeartJ,2001,141:211-217.13DolleryCM,HumphriesSE,McClellandA,etal.Express