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转基因水稻专利分析.doc转基因水稻专利分析.doc -- 5 元

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转基因水稻专利分析赵亚娟王学昭张静张博张薇一、前言水稻是世界主要的粮食作物之一,世界上有超过一半的人口以稻米为主食,但由于各种病虫害、不良气候与环境等的影响,严重制约了水稻的高产、稳产。转基因水稻针对这些影响改进品种,将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入水稻基因组中,使水稻具有新的性状,如抗病虫、抗除草剂、耐环境逆境、增产、优质优价、低耗等,其相关研究已经成为各国转基因技术研究的热点。自1988年首次获得可育的转基因水稻以来,基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用,已成功选育了一系列转基因水稻品系。2009年12月,中国在世界上首次颁发了转抗虫基因水稻华恢1号和杂交种Bt汕优63的安全证书。由于水稻在人类粮食中的举足轻重的地位,转基因水稻的安全性等问题也吸引了全世界的关注1。(一)研究内容及研究范围转基因水稻研究涵盖了实验研究,应用研究以及产业化等较长的流程,在整个上下游的研究、实验、开发与应用推广过程中,涉及到的不仅仅是农业生物领域的科学研究问题,还受到食品安全、环境评估、公众支持等相关因素的影响,其研究进展与应用推广在很大程度上受制于各国对待转基因水稻的政策。转基因水稻相关的研究与推广链如图1所示。包括在针对转基因水稻改造目标寻找合适的基因、基因构造、基因转移、培养细胞和植株再生、植株筛选与确认、田间试验和安全检测、通过安全检测(经过所在国家批准)后实现商业生产。图1转基因水稻研究生产链示意图2寻找合适基因针对拟改良的性状,寻找适合基因,了解基因的结构与进化演化,找到在染色体上的定位,并了解基因表达的调控。重新建构基因改造基因序列或结构,加强其表达。建构不同的启动子,以1绿色和平组织,谁是中国转基因水稻的真正主人。2参考整理自刘丽飞,GM作物的現況與前景以創新技術增加GM作物安全性。调控基因表达,例如利用组织专一启动子,使其只在叶部,根部或花器内表现,或者利用可调控启动子,使基因在高温、低温、缺水、照光及受伤等情况下表达等。基因转移进一步将基因导入植物体内,目前使用基因枪法或农杆菌法。植株再生与转殖确认将基因送入植物体内后进行植株培养,并采用分子生物学技术进行各项筛选与检测。田间试验与安全检测转殖作物的后代必须进行田间栽培试验,观察在自然环境下的生长表现。产品必须通过各项测试与评估,才可以释放给农民,进行栽培生产。商业生产得到所在国的法律允许后,可以开始商业生产。从研究的角度讲,转基因水稻的研发流程详见图2。研发过程包含的阶段3有分离与培养水稻胚胎分离基因或遗传元件基因修饰增加启动子和终止子等目的基因克隆并构建到转化载体中遗传转化培养胚胎并在筛选培养基上选择含目的基因的胚胎水稻幼苗再生以获得转基因水稻植株等。图2转基因水稻研发流程示意图4本报告中的转基因水稻整体专利分析是基于转基因水稻研发流程来构建数据集,进行分析的,重点技术部分的研究涉及到目标基因和转化载体两个方面。3绿色和平组织,谁是中国转基因水稻的真正主人。4同上。(二)研究思路及报告结构本报告以转基因水稻为研究对象,在定性资料调研和专家咨询的基础上,利用权威专利数据库,采用由面入点,由浅到深的分析思路对转基因水稻技术的整体专利布局和重点技术进行了分析,以期客观展现转基因水稻及重点技术的专利保护现状,为转基因水稻领域科技决策提供支撑。报告分三部分第一部分(第二章)转基因水稻研究进展和各国对转基因水稻相关政策。第二部分(第三章)转基因水稻领域整体专利分析。对转基因水稻领域国内外专利申请现状进行整体分析的基础上,揭示我国企业、大学、中国科学院5(以下简称中科院)、其他研究机构(指除中科院以外的研究机构,如农科院、医科院等)等不同性质的机构6在转基因水稻技术研究中的现状。分析内容包括转基因水稻领域国际7、国内8专利申请趋势转基因水稻领域国际、国内专利申请的技术布局我国企业、大学、中科院、其他研究机构等在转基因水稻技术研究中的技术研发现状优势技术布局技术研发资源(从机构和人员两个方面)储备参与转基因水稻研发的机构和人员数量变化趋势重点研发机构核心研发人员第三部分(第四章至第八章)选择Ti载体技术、凝集素基因、抗白叶枯病基因、抗稻瘟病基因、转Bt基因等转基因水稻研究中的重点技术(或相关基因)展开针对具体技术的深入分析。各重点技术的分析内容包括重点技术申请趋势分析重点技术来源国家分析重点技术申请人分析基于技术功效框架的专利技术分析,主要有申请与授权布局分析发明人布局分析技术保护区域分析5中国科学技术大学的专利数量计入中国科学院,而不是大学单元。6各机构性质的划分依据及详细判定规则见附录1。为了叙述方便,在本部分中,将企业、大学、中科院、其他科研机构均称之为单元。7本部分分析采用的国际专利数据来源于欧专局收录的美国、日本、瑞士、德国、英国、法国以及欧专局和世界知识产权组织受理的专利申请,因此本部分国际专利也特指以上专利受理机构收录的专利文献。8国内专利指向中国知识产权局专利局提交的专利申请。申请人总体布局分析在华授权专利分析基于被引指标的核心技术识别与分析潜在知识产权风险分析案例典型竞争对手专利布局分析需要说明的是,在第三部分的研究中,由于所采用的DII化学专利数据库中专利记录是以专利家族为单位进行组织的,一个专利家族代表了一项专利技术,如果该项专利技术在多个国家提交申请,则在统计分析中,一项专利对应多件专利。在针对以上五种技术所做的专利分析中,对专利的项数和件数做了区分,在此特作说明。最后,在以上分析的基础上给出报告的结论和启示。(三)数据来源转基因水稻国内外专利整体分析9所用的国内专利数据来源于中国国家知识产权与专利局提供的中国受理的专利数据库10。国际专利数据来源于欧洲专利局收录的美国(US)、日本(JP)、英国(GB)、法国(FR)、德国(DE)、瑞士(CH)六个国家以及欧洲专利局(EP)和世界知识产权组织WIPO(WO)两个国际组织受理的专利申请。数据检索时间截止到2009年12月30日。转基因水稻重点技术专利分析采用的数据来源于DII化学专利数据库,该数据库中包含40多个专利受理机构的专利文献,并且所有的专利文献都以专利家族为单位进行组织,有利于开展基于技术申请的分析。数据检索时间截止到2010年2月3日。(四)研究方法在进行相关知识调研的基础上,经过专家沟通,设定检索策略,并据此构建国内和国际转基因水稻11及重点技术专利分析数据集。借助于Access,EXCEL,TDA(ThomsonDataAnalyzer)等工具,对数据进行清洗和整理,从不同的角度揭示转基因水稻技术发展态势。9数据为截止2009年12月17日的国际、国内转基因水稻专利。10包括发明申请公开、发明授权、实用新型和外观设计数据。11中国专利和六国两组织专利数据检索策略详见附录2。二、转基因水稻研究现状与主要国家相关政策(一)转基因水稻研究现状水稻转基因技术始于原生质体培养,1985年首次成功地从水稻原生质体再生完整植株1986年Uchimiya等首先获得了卡那霉素抗性的转基因水稻愈伤组织1988年在粳稻品种中获得第一批转基因水稻植株。经过近20年的发展,转基因工程技术在水稻品种改良上得到了广泛的应用,已培育了一系列转基因水稻品系。1、水稻性状改良研究转基因水稻根据其目的可分为三类具有抗性的转基因水稻、高产和优质转基因水稻、具有药用价值的转基因水稻(详见表1)。表1主要转基因水稻性状及对应基因1212参考自黄德林,2007,转基因水稻战略研究,中国农业出版社。转基因性状基因一级二级具有抗性抗虫苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因(BT基因)CRYIA基因蛋白酶抑制剂(PI基因)豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CPTI基因)、抗线虫的半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(OCPIN2、SKIID86)、PIN2、SKTI抗稻飞虱等职务凝集素基因雪花莲凝集素(GNA)基因、豌豆外源凝集素基因(PLEC)其他如SCIP1、AHAS等抗逆抗涝基因PDCI,PDCII,PDCIII抗旱基因CMO基因、SP17耐碱基因CODA耐盐基因BETA、BAD的突变基因(FADGH)H、乙烯受体类蛋白基因抗寒抗冻基因抗除草剂抗草丁膦(phosphinothricin)的BAR基因抗草甘膦(glyphosate)的EPSPS基因原卟啉原氧化酶(protox)基因磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPC)基因、PCKTYPE基因抗咪唑啉酮类除草剂以及其他抗病水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基因RSVCP抗白叶枯Xa21基因抗稻瘟病烟草几丁质酶基因高产优质品质性状改良增加必须氨基酸(如赖氨酸、甲硫氨酸)水稻储藏蛋白基因(GLUTILIN)增加维生素含量八氢番茄合成酶及其脱氢酶基因、1.1具有抗性的转基因水稻在转基因水稻研究中,具抗性的转基因水稻研究最早且发展较快。其中,研究较成熟的有转苏云金杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因抗虫水稻和转Xa21基因抗白叶枯病水稻。(1)抗虫性应用于水稻抗虫性改良的外源基因主要有3种,一是从苏云金杆菌分离的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因Bt基因,二是从植物中分离出的昆虫蛋白酶抑制剂PI基因,三是植物凝集素基因。科学家分别应用基因枪法、农杆菌介导法、电击法等成功地将cryIAb、cryIAc基因导入水稻中,获得了转基因植株,经抗虫性检测,转基因植株对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟等具有明显的致死效应。浙江大学应用Bt基因转化育成的克螟稻已通过了浙江省科技厅的鉴定,1999年获准开展环境释放试验。(2)抗病性日本国家农业环境所成功地将水稻条纹叶枯病毒外壳蛋白基因RSVCP导入水稻获得转基因植株,接种后23周发现转基因植株只有23发病,而对照则有95100发病。Christou等将Xa21基因导入水稻后,显著提高了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性。何迎春等将烟草几丁质酶基因导入水稻获得了高抗纹枯病和稻瘟病转基因植株。四川农业大学将抗病和抗虫基因导入杂交稻的恢复系中,获得了转基因的双抗杂交稻等。(3)抗除草剂20世纪80年代,美国孟山都公司以其拥有广谱、高效除草剂农达草甘膦PROLAMIN4A、PSY、CNTL、LCY增加类路萝卜素降低稻米的直链淀粉含量、AMYLOPULLULANASE增加总蛋白质含量大豆球蛋白基因维生素合成基因丰产二磷酸核酮糖羧化酶基因(RUBPC)、钙调素蛋白激酶基因以及OSCEN1/2基因ADPG焦磷酸化酶的突变基因(GLGCTM)、AGP淀粉合成酶基因磷酸蔗糖合成酶基因分蘖等其他基因其他药用蛋白、抗体、疫苗等基因与生理生长(花色、激素以及矮化等)有关基因不育相关基因、花粉特异表达不育基因特异性启动子、转录因子等基因的优势,率先开展除草剂抗菌性基因的转移研究与抗性品种的开发。随后,美国艾格福公司AgrEvo抗广谱除草剂草铵膦转基因水稻和美国氰胺公司的抗咪唑啉酮类除草剂转基因水稻相继问世。中国用于水稻抗除草剂的基因主要是PPT乙酰转移酶基因,即抗Basta基因bar,目前也已获得抗Basta水稻。(4)抗逆性由于有关水稻抗逆基因的定位、克隆和分离工作难度较大,抗逆转基因水稻的研究报道还不多。目前已经导入水稻的抗逆基因主要有烟草中的CMO基因、甜菜碱生物合成酶基因codA和水稻耐淹能力有关的基因pdc,pdc,pdc,将其转入水稻中分别获得了具有抗旱、耐碱、耐盐和耐渍的转基因水稻植株。1.2高产和优质转基因水稻产量和品质是由多基因控制的综合性状,个别外源基因的导入只能使其组成成分中单一因子的水平获得提高,而对其综合水平没有明显的影响。目前提高水稻产量的基因工程的主要设想是将高光效C4植物的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和二磷酸核酮糖羧化酶基因(RuBpC)导入水稻中,在水稻叶片的叶绿体中表达以提高水稻光合效率,达到增加产量的目的。虽然Ku等将PEPC基因导入水稻,获得了光合效率提高近50的转基因水稻,但离获得高产品种还相距甚远,只是为水稻大幅度增产带来了新的希望。在品质改良方面,富脯氨酸基因、富甲硫氨酸和赖氨酸基因、八氢番茄合成酶及其脱氢酶基因、大豆球蛋白基因和高赖氨酸基因等都已被成功地导入水稻并获得了转基因植株,对于开发特用稻米产品具有非常重要的意义。在转基因优质水稻研究上,利用转基因技术改良稻米营养品质的研究相对较多,如高蛋白含量转基因水稻的研究。稻米除了提供热量外,也是蛋白质的一个重要来源。此外,还有一些研究通过转基因方法提高水稻微量元素含量,如β胡萝卜素、铁、锌等的含量。比较著名的例子是金色稻米,所谓金色稻米就是一种富含β胡萝卜素的稻米。除了金色稻米外,还有一种高铁含量的转基因水稻13。1.3具有药用价值的转基因水稻近些年来,水稻育种科学家还将转基因技术应用于具有药用价值的转基因水稻的研究,获得了不少转基因水稻可食疫苗,其中以有霍乱疫苗、花粉症疫苗及乙肝疫苗的研究较为成功,为这些疾病的治疗提供了更低成本、更为便捷、有效13张启发等,转基因水稻研究的回顾与展望,200954pp.26992717.的选择14。2、转基因水稻研究相关的技术与转基因水稻相关的技术主要有转基因方法、水稻基因的定位与克隆、培育栽培技术、选择标记技术以及转基因水稻检测技术等,此外转化受体系统的研究也是转基因研究的内容之一。下面重点对转基因方法进行阐述。2.1转基因方法水稻转基因方法始于原生质体培养,最初转化均采用原生质体为材料的PEG15介导法,后来相继发展了电激法16、基因枪法17及农杆菌介导法18等。这些方法各有优缺点。应用最早的是PEG法,最广泛和最成功的是基因枪法,而最有发展前途的是农杆菌介导法19。随着水稻转基因技术的成熟,人们不再仅仅满足于将外源基因导入到生物体基因组中。根据不同的实验目的,一些特殊的转基因技术如多基因转化、组织特异性/诱导性表达、叶绿素转化等正在研究发展20。其他转化方法如脂质体介导法、花粉管通道法、生殖细胞浸泡法,及胚囊子房注射介导等方法也被用于转基因水稻的研究中,但这些方法获得的转化株,往往只有当代被转化的证据,而缺乏对其深入的研究,尚未被普遍接受。2.2转基因水稻检测转基因水稻是为了使植物获得抗病、抗虫、抗除草剂、提高作物品质、产量等性状。所以在进行植物的转基因改造时,植物中必须导入能够表达上述性状的14胡贻椿,转基因水稻安全性的研究进展,20098pp.192215PEG转化法是禾谷类作物转化方法中最早应用方法之一。主要原理是利用化合物聚乙二醇PEG及高pH条件诱导原生质体体外摄取外源DNA。原生质体作为受体具有群体数大,便于操作,DNA分子易于进入,获得纯合性的转化子等优点,但原生质体培养难度大、再生频率低、周期长、不适合水稻转化研究。16电激法也叫电穿孔法,是20世纪80年代初发展起来的一种遗传转化技术,也是以原生质体为受体的一种基因转移方法。其原理原理是利用短暂的电场脉冲作用,使原生质体膜形成可逆的瞬间通道,使DNA进入细胞虽然该法具有操作简便,转化效率高的优点,但同时也具有相关仪器昂贵,易造成原生质体损伤,且受原生质体为受体的缺陷。近年来,对电击法的使用又有所发展,通过电激法直接在带壁的植物组织和细胞上打孔,将外源基因导入植物细胞,提高了植物细胞的存活率,并且在水稻上获得转基因植株。17基因枪法又称微弹轰击法,最早由美国康奈尔大学的Sanford提出。基因枪法是20世纪80年代末逐步发展起来的,其原理是将外源DNA包在微小的金粒或钨粒表面,再通过高压将微粒高速地射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到植物染色体上得以表达,从而实现基因的转化。基因枪法是基因直接转化的方法之一,具有操作简便,受体材料广泛等优点,但成本较高,转化频率较低。18农杆菌介导转化法就是将外源基因插入农杆菌的质粒上,由载体将外源基因转移并整合到植物细胞基因组中去。基本程序包括受体系统的建立、转化载体的构建和目的基因的转化三个方面。利用土壤农杆菌转化水稻,转基因水稻植株的再生频率可高达1030%。该转化系统利用天然的转化载体系统,成功率高,遗传稳定性好,可以连接不同的启动子,使外源基因在不同组织里特异表达,且载体可容纳大片段的异源DNA,所以该方法是目前最常用的转基因方法。19秦代锦等,水稻遗传转化研究进展,生物学杂志,2008(25)5pp.5920张启发等,转基因水稻研究的回顾与展望,科学通报,2009(54)18pp.26992717目的基因,同时要在植物中表达这些外源目的基因,还需一个完整的表达调控系统,其中主要包括启动子、终止子以及在构建和鉴定表达系统时所需的选择标记基因21。对转基因植物的检测主要通过检测调控序列启动子、终止子、选择标记基因进行初选,然后再对具体的目的基因检测。对转基因水稻的检测可分为定性检测法和定量检测法。目前常用的转基因作物检测方法有PCR(PolymeraseChainReaction)检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、外源基因整合鉴定法、Western杂交法、生物测定检测法和基因芯片法等。3、转基因水稻的安全问题研究3.1转基因水稻安全问题的内涵转基因水稻的安全问题可分为食品安全和生态环境安全两个方面。稻米在食物链中具有非常广泛的作用,几乎所有的养殖业都可以将水稻作为饲料,而且稻草不仅用于喂养牲畜,还被用作生产食用菌,食物链中的任何一环都可能涉及转基因水稻及其产品。因此,转基因水稻食品安全问题更为复杂。转基因水稻的食品安全方面的关键问题有经基因工程技术处理后的水稻产生的新基因产品是否产生毒性或致敏性转基因水稻是否会带来潜在危害的非预期变化以及这些变化将会造成怎样的影响。转基因水稻的环境安全性包括生存竞争性、与近缘野生种的可交配性、对非靶生物的影响及病毒的重组和异源包装等内容。转基因水稻会通过花粉将基因传播给近亲植物,这会令其它植物也出现转基因水稻如抗除草剂的特征,扰乱生态平衡规律。如果抗除草剂的基因传播到杂草,更会出现超级杂草,危害粮食生产。害虫长年累月地接触某种毒素,体内自然地会产生抗体,有可能变成不怕杀虫剂的超级害虫。强势的转基因生物可能致使自然界原有的品种绝种,破坏生物多样性。另外,转基因改造过的生物可能会为其它生物如蝴蝶、瓢虫等益虫带来危害。目前关注的转基因水稻环境安全问题主要有转基因植物在生存竞争方面具有的优势可能导致生物多样性的减少基因是否会发生不可控制的水平转移。具体地,转基因水稻可能向栽培稻的其它品种、野生稻和稻田杂草产生基因漂移,危害这些品种或物种的遗传完整性、遗传多样性和生存竞争力,还可能对自然基因库造成污染,使得许多优良的农作物品种丧失其次是转基因水稻的杂草化问题。21李伟丰等,转基因水稻检测方法的研究进展,生物技术通报,20065,pp.5861
编号:201312191420466754    大小:3.67MB    格式:DOC    上传时间:2013-12-19
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abingge上传于2013-12-19

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