6 种中药多糖对诱导树突状细胞成熟及刺激T 细胞抗肿瘤作用的比较.pdf

实用医学杂志2009年第25卷第22期作者单位：056002河北省邯郸市，河北工程大学医学院人体解剖学与组织胚胎学系组胚教研室多数补益中药多糖具有免疫功能调节的活性1，但不同中药多糖对免疫功能调节作用强弱的比较研究，文献报道甚少，因此，本文筛选出对免疫功能影响较大的枸杞子多糖（lyciumbararumpolysaccharide，LBP）、猪苓多糖（polyporusumbellatuspolysaccharide，PUP）、茯苓多糖（poriacocospolysaccharide，PPS）、灵芝多糖（ganodermalucidumpolysaccharide，GLP）、黄芪多糖（astruguspolysaccharide，APS）和当归多糖（amgelicasinensispolysaccharide，ASP）6味中药多糖，通过其对人树突状细胞（dendriticcell，DC）成熟、刺激T细胞增殖能力和对肿瘤的杀伤的影响进行了比较，以筛选增强免疫功能较强的中药多糖，为中药多糖进一步开发和利用奠定试验基础。1材料与方法11材料新鲜人外周血购自邯郸市血站。淋巴细胞分离液（Ficoll，1077gL）购自上海试剂二厂。GM-CSF、IL-2和IL-4购自德国RD公司。尼龙毛柱购自FENWAL（USA）。鼠抗人MHC、CD86、CD83，即用型二步法生物素检测试剂盒（PV9000）、FITC标记的鼠抗人IgG抗体购自北京中杉生物技术有限公司。6种中药多糖均购自北京中杉生物技术有限公司。12方法121DC的诱导培养取正常人外周血200L，以淋巴细胞分离液分离单个核细胞于培养皿培养2h后，取贴壁细胞即单核细胞，加入GM-CSF1L（1000UL）；IL-41L（500UL）培养7d后，收获的细胞分别加入终浓度为100gL的6种中药多糖，加入等量的RPMI-1640作为对照；37培养48h后收集细胞。观察树突状细胞的形态变化，免疫细胞化学法检测其表面标志的表达。122肿瘤细胞全抗原致敏未成熟树突状细胞（immaturedendriticcell，imDC），诱导分化为成熟树突状细胞（maturedendriticcell，mDC）常规培养肝癌细胞株Bel-7402，收集处于对数生长期的细胞并反复冻融（80室温）4次离心，取上清作为肿瘤细胞全抗原。将imDC调整细胞浓度至1106L，加入肿瘤细胞全抗原02L，培养2d，即肿瘤细胞全抗原致敏的imDC。与imDC中分别加入终浓度为100gL的6种中药多糖，加入等量的RPMI-1640作为对照；继续培养48h后。观察DC的形态变化及用免疫细胞化学法检测其表面标志的表达。123T细胞的获得按方法121获得单个核细胞于培养皿培养2h后，收集非贴壁细胞即为淋巴细胞，将3107L的淋巴细胞注入尼龙毛柱，放入培养箱静置1h。用培养液洗柱，洗下的即为T细胞。124T细胞的激活和增殖调整T细胞浓度为2106个L，加入96孔板，100L孔，作为反应细胞。方法122制备的DCs作为刺激细胞。按照1100的比例使DC与T细胞混合，总体积每孔200L。培养120h，于最后18h加入10LMTT（5mgL）离心，弃上清，加入150L的二甲基亚砜（DMSO）。酶标仪检测OD值，并按下式计算细胞增殖指数：增殖指数（实验组OD值反应细胞对照组OD值刺激细胞对照组OD值）反应细胞对照组OD值。125效应T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用将方法124获得不同T细胞，作为效应细胞置96孔板中，新鲜分离的T细胞作为对照。按效靶比为301的比例分别加入人肝癌细胞Bel-7402和人骨肉瘤细胞6种中药多糖对诱导树突状细胞成熟及刺激T细胞抗肿瘤作用的比较单铁英许忠新苏安英摘要目的：比较6种中药多糖对树突状细胞（DC）诱导成熟及刺激T细胞活化、杀伤肿瘤的能力。方法：分离人外周血单核细胞，经体外诱导培养为未成熟DC。用冻融法制备肝癌细胞完全抗原并致敏未成熟DC，成熟DC进一步激活特异性效应T细胞。用MTT法测定效应T细胞对肝癌细胞的杀伤率。观察枸杞子多糖、猪苓多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、黄芪多糖和当归多糖6味中药多糖对人树突状细胞成熟、刺激T细胞增殖能力和对肿瘤细胞的杀伤能力。结果：经6种中药多糖诱导的DC分子表达有明显变化，MHC、CD86、CD83（P005，P001），而经RPMI-1640培养的DC分子表达与培养前无明显变化。经6种中药多糖诱导的DC均能促进效应T细胞的增殖能力（P001），效应T细胞能有效地杀伤肝癌细胞（P005），而对MG-63细胞不能有效杀伤（P005）。其中枸杞多糖对上述功能的作用最为明显（P005）。结论：上述6种中药多糖均可诱导DC分化与成熟，刺激T细胞增殖和肿瘤杀伤活性，枸杞多糖与其余5种多糖比较，对上述功能的作用最为明显。关键词中药疗法；树突细胞；中药多糖；枸杞多糖；抗肿瘤；人3755实用医学杂志2009年第25卷第22期表16种中药多糖和RPMI1640培养的DC分子表达的图像分析结果（n10）xs，组别对照组LBP组PUP组PPS组GLP组APS组ASP组MHC-00279001630286000157*0242600038*0213500079*0186300064*0165700062*0157300124*CD8600128000320186900142*0153200081*0136100045*0109600053*0118100101*0104700091*CD8300253000190195800087*0167500043*0142800019*0132500142*0129400073*0109100086*注：与对照组比较，*P005，*P001表26种多糖作用DC后刺激效应T细胞对肿瘤细胞杀伤作用的影响（n10）xs组别TDCLBPTDCPUPTDCPPSTDCGLPTDCAPSTDCASPTDCRPMI-1640TBel-740206920019*06630025*06280043*06010037*05900016*05850032*03060013*01780016MG-630193001101900031018900420187003601810024018000400179000901750018注：与MG-63组比较，*P005MG-63。用MTT法测各孔的OD值，并按下式计算T细胞杀伤活性：T细胞杀伤活性（）（靶细胞对照组OD值实验组OD值效应细胞OD值）靶细胞对照组OD值13统计学方法所得数据经SPSS110软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，实验结果用xs表示。以P005为有统计学差异。2结果21DC的体外诱导与培养正常人外周血分离的单核细胞，倒置相差显微镜下可见细胞在培养过程中体积逐渐增大，细胞形态由圆形变为逗点状、蝌蚪状、长梭形或不规则形，并向四周伸出不规则状的突起。经6种中药多糖作用的DC：细胞呈悬浮状生长，体积较大，大小不等，呈圆形，细胞表面有突起且在培养液中可摆动或伸缩。细胞核为一个，居中。而经RPMI-1640培养的DC对照组与培养前无明显变化。226种中药多糖对DC细胞MHCII、CD86、CD83等分子表达的影响经6种中药多糖诱导培养的DC分子表达有明显变化：MHCII、CD86、CD83，其中LBP诱导DC成熟的能力显著增强，而经RPMI-1640培养的DC分子表达与培养前无明显变化。7组培养的DC分子表达图像分析见表1。236种中药多糖对T细胞作用的影响在混合淋巴细胞实验中，经6种中药多糖作用后DC均能激发T细胞的增殖能力（P001）。LBP与其余各实验组间比较作用显著（P005），其余各实验组间比较无统计学差异性（P005），见图1。24T细胞杀伤肿瘤细胞通过MTT法检测肿瘤细胞活力的影响，来表明肿瘤细胞的杀伤情况：经6种中药多糖作用后DC激发的效应T细胞杀伤肝癌细胞能力不同，而对MG-63细胞不能有效地杀伤（P005）。未经mDC刺激的T细胞作为对照，由于缺乏mDC的抗原呈递和刺激作用，T细胞不具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力（表2）。3讨论中药多糖已经被很多实验证明具有调节免疫功能和抗肿瘤的功能2。有文献3报道，中药多糖对巨噬细胞、T细胞、NK细胞均有明显的调节作用，但对DC表型和功能的影响却未见报道。DC是一种重要的专职抗原提呈细胞，对启动辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的免疫应答具有重要作用46。imDC俘获和处理外源性抗原后成为mDC，通过主要组织相容性复合物（MHC）分子提呈抗原多肽来激活T细胞，启动特异性免疫应答。实验证明710，DC的成熟状态与其功能有关，imDC有较强的抗原摄取和加工能力，同时，低表达MHC-、CD86、CD83。mDC摄取抗原功能下降，但是，MHC-、CD86、CD83分子高表达。这些分子正是与DC抗原提呈作用密切相关的分子，也是与DC对T细胞的激活作用密切相关的分子。本实验结果显示，经过6种中药多糖刺激作用后的DC，MHC-、CD86、CD83的表达水平明显增高，且DC激活T细胞能力及T细胞增殖能力增强。这些结果都说明6种中药多糖能诱导DC成熟，同时刺激T细胞增殖能力增强。经肝癌细胞抗原致敏imDC并培养为mDC激活的T细胞能特异性地杀伤肝癌细胞，而经6种中药多糖作用后DC刺激效应T细胞杀伤肝癌细胞的能力进一步增强。对MG-63细胞因为不能有效地识别所以不能杀伤。上述实验证明6种中药多糖可明显促进树突状细胞成熟，增强效应T细胞的增殖和杀伤肿瘤作用强弱不同，其中LBP的能力最强。但其具体的分子生物学机制尚需进一步的研究。图16种中药多糖作用后DC刺激T细胞的增殖率（n10）3756实用医学杂志2009年第25卷第22期患者男，64岁，农民，因“痰中带血1周”于2008年10月26日入院。既往无慢性病史，抽烟30年，每日60支。在当地医院医院胸片检查，提示左肺门占位性病变，伴左上肺不张，拟诊“左侧中央型肺癌”，来我院就诊。胸片：左上肺占位性病变，伴左上肺不张（图1），拟诊“左侧中央型肺癌”，建议作胸部CT检查。10月27日纤维支气管镜检查，见左侧主支气管完全阻塞，肿物表面有白色膜状物覆盖，触之易出血（图2），取组织活检。10月30日病理报告，未见癌组织，见组织内大量菌丝生长。同日取气管内分泌物培养，也见曲霉菌生长（图3）。当天即开始抗真菌治疗，给予伏立康唑注射液02g，每日2次。同时给予二性霉素B雾化治疗（2次d）。2周后改为口服，伏立康唑02g，每日2次。一直坚持服药，但痰中仍有少许血丝。抗真菌治疗1周后，气管内肉芽组织逐渐缩小，先后进行过6次纤维支气管镜检查，取组织活检均为肉芽组织，组织中可见曲霉菌丝。并予钳取坏死组织，气管内坏死组织基本清除，但1周后气管内仍见较多的坏死组织，不能完全去除，先后6次纤维支气管镜取组织活检，6次病理检查均未找到癌细胞。鉴于抗真菌治疗效果不佳，经胸外科会诊后，建议作肺叶切除。于11月24日行左上叶切除术，送组织活检，结果为小细胞肺癌。肺癌并气管内曲霉菌病1例张常然徐文明林建聪李鸣作者单位：510700广州市，中山大学附属第一医院黄埔院区讨论临床上一般将肺曲霉病分为变态反应性支气管肺曲霉病、侵入性肺曲霉病、肺曲霉球病等3种类型。气管内曲霉菌病属少见类型，称之为气道侵袭性曲霉病，与侵袭性肺曲霉病不同，该病一般不直接侵犯肺实质，主要引起气管支气管炎并可引起支气管的阻塞，故又称为曲霉性气管支气管炎和阻塞性支气管曲霉病，诊断主要依靠支气管镜检查。本例患者发病初期，根据影像学检查，诊断为中心型肺癌，但无病理学证据。虽经6次纤维支气管镜活检，竟没有找到原发病灶，可能与肺癌位置较深，其上覆盖大量坏死组织有关。曲霉广泛分布于自然界中，是条件致病菌，正常人对曲霉有极强的免疫力。如果发生气管内曲霉菌感染，应积极查找原因，多见于免疫功能低下的患者，如肺结核、糖尿病、支气管扩张症、肺脓肿等，经文献检索，肺癌合并气管内曲霉菌病少见。笔者曾发现2例变态反应性支气管曲霉菌病，使用伏立康唑静脉注射及二性霉素B雾化治疗，均取得了较好的治疗效果，但本例患者使用了1个月的抗真菌治疗，效果较差。气管内曲霉菌不能根治的原因，可能与肿瘤导致机体免疫功能低下有关，解除病因如手术切除原发病灶可能为气管内曲霉菌较好的治疗方法。（收稿：20090409编辑：陈兵）图1胸部CT显示左上肺占位性病变图2左侧主支气管完全阻塞，肿物表面有白色膜状物覆盖图3组织内见曲霉菌菌丝123456789104参考文献GonGH，ShenP，JinL，etalTherapeuticeffectsofLyciumbarbarumpolysaccharide（LBP）onirradiationorchemotherapy-inducedmyelosuppressivemiceJCancerBiotherRadiopharm，2005，20（2）：155162GanL，ZhangS，YangX，etalImmunomodulationandantitumoractivitybyapolysaccharideproteincomplexfromlyciumbarbarumJIntImmunopharmacol，2004，4（4）：563569KongXF，HuYL，YinYL，etalChineseherbalingredientsareeffectiveimmunestimulatorsforchickensinfectedwiththeNewcastlediseasevirusJPoultSci，2006，85（12）：169LanzavecchiaA，SallustoFRegulationofTcellimmunitybydendriticcellsJCell，2001，106（3）：263266LiuYLDendriticcellsubsetsandlineages，andtheirfunctionsininnateandadaptiveimmunityJCell，2001，106（3）：2