siRNA 给药途径的研究进展.pdfsiRNA 给药途径的研究进展.pdf

收藏 分享

资源预览需要最新版本的Flash Player支持。
您尚未安装或版本过低,建议您

DOI10.3969/J.ISSN.10097090.2009.05.023SIRNA给药途径的研究进展郑孝志.杜联芳.461..综述.摘要RNA干扰RNAI通过在生物体细胞内导入外源性或内源性的双链RNA.使同源性MRNA降解、抑制特定基因表达而治疗某些基因异常所致的疾病,近年来已成为研究热点之一。文章就小分子干扰RNASIRNA的病毒载体给药、非病毒载体给药途径及优缺点做一综述。关键词RNA干扰;小分子干扰RNA;给药途径中图分类号R73文献标识码A文章编号10097090200905046104ADVANCEINADMINISTRATIONROUTESOFSIRNAZHENGXIAOZHI,DULIANFANGDEPARTMENTOFUHRASOUND,.SK啦反FIRSTPEOPLE’SHOSPITAL,鼽叽曲面JIAO%昭UNIVERSITY,SHANGHAI200080,CHINA将与内源性MRNA序列相对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNADOUBLESTRANDEDRNA.DSRNA导人细胞.可使内源性MRNA降解和基因沉默.这种转录后基因沉默机制POSTRANSCRIPTIONALGENESILENCING。PTGS被称为RNA干扰RNAINTERFERENCE.RNAI。近几年来,由于RNAI具有高度特异性的基因沉默功能.可与基因敲除相媲美。在临床上可广泛用于肿瘤、病毒、炎症、心血管及神经退行性疾病等的治疗。小分子干扰RNASMALLINTERFERINGRNA或SHORTINGINTERFERINGRNA。SIRNA是RNAI作用得以发生的重要中间效应分子。它可以是外源性的.也可以是内源性的。它是一类长约21~23个核苷酸的特殊DSRNA分子.其序列与所作用的靶MRNA序列具有同源性阁。DSRNA是诱导细胞RNAI的关键组分.外源性DNA、RNA序列均可激发细胞产生相应的DSR.NA。DSRNA在DICER酶作用下解旋裂解形成21~23个核苷酸的SIRNA。由SIRNA中的反义链指导形成的沉默复合体RNAINDUCEDSILENCINGCOMPLEX,RISC对靶MRNA具有识别和切割作用.利用结合在其上的核酸内切酶切割靶MRNA分子中与DSRNA反义链互补的区域.形成了21.23个核苷酸长的DSRNA小片段.从而达到干扰基因表达作用31。外源性SIRNA分子由体外经一些物理技术如基作者单位上海交通大学附属上海第一人民医院超声科.上海200080收稿日期20081228修回日期200906一15作者简介郑孝志1974一.男,江苏宿迁市入,博士研究生,主治医师.主要从事超卢靶向治疗研究。审校者常津天津大学材料科学学院纳米生物技术研究所.天津300072因枪、电穿孔术、高压注射及载体技术如病毒、脂质体等可导人细胞实现一定程度的转染。采用物理技术使用范围局限.部分有创伤性高压注射还可引起急性心力衰竭41裸SIRNA分子由于其具有核酸分子类的特性,在生物体内高浓度血清环境中极易被核酸酶降解而不稳定.且不易被组织吸收.因此在生物体内具有稳定性差、半衰期短、细胞内转染效率低和靶向性差等缺点。因此,要将SIRNA分子成功导人生物体并发挥有效的治疗作用,首先应解决载体问题。由于生物体内直接应用SIRNA分子的限制.大多数研究都借助了给药载体,包括病毒载体和非病毒载体两类。1病毒载体给药病毒载体,如腺相关病毒、逆转录病毒、腺病毒和慢病毒等均可介导SIRNA分子的转染.产生有效的RNAI现象。MICHELU等53根据在中枢神经系统血清型2腺相关病毒AAV一2优先转导神经元的理论.在AAV_2的基础上分别建立了表达定向于聚合酶Ⅱ启动因子的荧光蛋白的病毒载体和定向于人类H1启动因子的SIRNA的病毒载体。活体实验中,鼠视网膜神经节细胞内的携带靶向增强绿色荧光蛋白酶的SIRNAENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEINSIRNA,EGFPSIRNA完全能够抑制突触蛋白I启动因子触发的EGFP表达。在体外实验中,EGFPSIRNA亦可完全抑制AAV一2介导的荧光蛋白表达。进一步研究证实。在鼠海马神经元培养物中.靶向H1的SIRNA干扰作用更为特异和有效。FECHNERH等【Q研究证实AAV一9能有效介导靶向柯萨奇病毒B3RNA聚合酶的SIRNA转染心肌,进而改善柯萨奇病毒B3心肌病的心功能。万方数据BRUMMELKAMPTR等用建立的逆转录病毒载体稳定而又特异地抑制了人类胰腺癌细胞致癌基因KRASVN等位基因的表达.而KRASVL2表达缺失将导致肿瘤失去自主生长和致癌的特性。SINGERO等8】用慢病毒作为靶向B分泌酶BACEL的SIRNA的载体.于小鼠大脑局部注射.有效抑制了脑中BACEI的表达.改善了阿尔茨海默病ALZHEIMER’SDISEASE动物的神经病理改变。使用病毒载体能产生特异和高效的RNAI效应.基因转染率高.并可在生物体内产生可持续的表达。但病毒类载体存在一定的免疫原性和致瘤性.使其运用受到了限制。2非病毒载体给药近来.为了使SIRNA能够尽早涉人临床使用阶段,产生确切的治疗效果,避免明显的负面效应。许多学者开展了非病毒类给药载体如脂质体和纳米粒等研究。2.1脂质体介导SIRNA给药脂质体介导SIRNA给药是RNAI技术最常见的给药方式.该方面的研究亦较多。SIOUDM等19L运用氢化荧光素标记SIRNA探讨脂质体介导SIRNA经静脉和经腹腔注射两种途径在小鼠的转导情况.结果两种转导方式均使SIRNA进入机体各种细胞.从而为脂质体介导SIRNA给药奠定了基础。SCRENSENDR等忡J探讨了脂质体介导SIRNA系统给药抑制外源性和内源性基因在成年鼠表达情况。经小鼠腹腔注射阳离子脂质体携带的抗TNFD的SIRNA.可有效抑制由脂多糖引起的TNF_Q基因表达。更重要的是在注射致死量的脂多糖后形成的脓毒症.在预先予抗TNFOL的SIRNA鼠中受到了明显的抑制。FOGEDC等INL采用双面乳剂技术将SIRNA包裹于密封的脂质体中.密封脂质体中的SIRNA通过脂质体分泌磷脂酶A2而实现定位的主动释放。初步流式细胞分析和共聚焦显微镜数据表明该脂质体可以促进SIRNA进人海拉细胞囊泡内。他们认为密封脂质体可以介导SIRNA靶向沉默类风湿性关节炎炎症部位细胞因子的表达。SATOA等|12J为了实现肝实质细胞特异性传导而将半乳糖苷化的阳离子脂质体和SIRNA进行合成.其合成物GALACTOSYLATEDLIPOSOMES/SIRNA在血浆中表现出更高的稳定性。静脉给药后,GALACTOSYLATEDLIPOS}OMES/SIRNA未经过核酸酶消化和尿液排泄.并有效地传导到肝实质细胞.而在肝非实质细胞中未发现此合成物。当给予0.29NMOL/G的GALACTOSYLATEDLIPOSOMES/SIRNA.鼠内源性基因UBCL3的表达被抑制80%,而裸的阳离子脂质体介导的SIRNA未表现出明显的肝内源性基因沉默效应。由此表明半乳糖苷化的阳离子脂质体可介导SIRNA经静脉给药靶向传递至肝脏发挥基因沉默作用。MORRISSEVDV等3J制备了一种表面偶联了聚乙烯二醇POLYETHYLENEGLYCOL,PEG的阳离子脂质体。其表面的PEG水化膜使制剂粒子更加稳定,可防止系统的迅速清除。这种双层脂质体可帮助经稳定性修饰的抗乙型肝炎病毒HEPATIFFSBVIRUS.HBVSIRNA分子被细胞摄入并从细胞质内小泡中释放。血管途径给药后,PEG脂质体从纳米粒子表面解离,此时纳米粒子可转染进细胞。该SIRNA制剂的半衰期长达6.5H.能显著降低动物体内HBVDNA复制。这种抑制作用呈特异性和剂量相关性.对HBV的抑制作用可持续6周。尽管该纳米粒子脂质体制剂无肝靶向配体的修饰.但实验结果表明.此种制剂仍然能有效地将SIRNA分子递人生物体内.并持久地获得生物治疗效果。上述研究表明,利用脂质体可以有效地介导SIRNA的传递.目前一些脂质体转染试剂已经实现了商品化。如LIPOFECTIN、RNAIFECT、OLIGOFECTAMINE、LIPOFECTAMINE等。但脂质体缺乏靶向性、潜在的致敏性、系统给药的毒性和低转染效率限制了其应用191。2.2阳离子聚合物纳米粒子介导SIRNA分子给药阳离子聚合物同样可介导SIRNA在生物体内的给药。常用的阳离子聚合物有壳聚糖、聚乙烯亚胺和多聚赖氨酸等。KATASH等114嗵过离子交联复合、三聚磷酸钠离子胶凝两种方法制作了壳聚糖纳米粒子.并比较它们介导SIRNA给药的效果。结果显示三聚磷酸钠离子胶凝法制作的壳聚糖纳米粒子由于其具有更高的结合量和装载效率而更具优势。TANWB等【51将壳聚糖纳米粒子和具有包膜的量点合成在一起用于传导针对人类表皮生长因子受体2的SIRNAHER2/LIEUSIRNA。由于纳米粒子中荧光量点的存在.SIRNA的转染过程可以被实时监控。在壳聚糖纳米粒子表面标记针对SKBR3乳腺癌细胞上HER2受体的抗体.结果显示HER2SIRNA通过该粒子可特异地转导入过度表达HER2的SKBR3乳腺癌细胞中。通过荧光素酶和HER2酶联免疫吸附测定可证实壳聚糖纳米粒子介导的SIRNA产生了明确的基因沉默效应。最近还有将SIRNA包埋于壳聚糖纳米粒子中.靶向治疗肿瘤J】61和采用磁性化纳米粒子传递SIRNAF叼的研究.前景较为乐观。SCHIFFELERSRM等旧制备了抗血管内皮生长因子VASCULARENDOTHELIALGROWTHFACTOR.VEGF的SIRNA一聚乙烯亚胺POLYETHVLENEIMINE,PEI万方数据生物医学丁程与临床2009年9月第13卷第5期BMECLINMED,SEPTEMBER2009,V01.13,NO.5纳米粒子.表面经PEGRGDRGD为一种小分子寡肽.可靶向结合新生血管内皮细胞表面表达的整合素受体修饰后.从荷瘤鼠尾静脉注射,可特异地抑制靶基因的转录和靶蛋白的表达.抑制肿瘤新生血管的发生.从而抑制肿瘤生长。MORIGUCHIR等1191用左旋聚赖氨酸浓缩编码抗荧光素酶SIRNA的质粒DNA并将其包装入多功能聚合物纳米粒子中.在体外转染实验中.左旋聚赖氨酸聚合物使荧光素酶表达抑制率达96%.即使被稀释100倍.抑制率也在60%以上。阳离子聚合物纳米粒子介导SIRNA分子给药优于病毒载体和裸SIRNA.是抑制特定基因表达的理想工具.生物体内稳定性比阳离子脂质体好.具有较低的免疫原性和细胞毒性.但其转染效率没有病毒载体高.较大地增加了制剂成本.使临床试验设计更为复杂。2.3经化学修饰后的SILⅢA分子血管内直接给药为了延长SIRNA的半衰期、减少免疫原性、降低被核酸酶降解的概率和增加药物治疗效果.一些研究小组采取了化学修饰SIRNA分子的方法。MORRISSEYDV等俐报道当SIRNA和血清一起孵化时.通过2’一F、27一OME和27一H替换2一OH并联合磷硫酰连接和帽子末端可明显延长SIRNA的半衰期.从数分钟延长到接近48H。这些分子和编码HBV的质粒自尾静脉高压注射人鼠体内.同样表现出较长的半衰期。在HBV载体携带化学修饰的SIRNA分子3D后.化学修饰SIRNA分子仍具有活力.其还以LGO.9的速度抑制HBVDNA表达。相反。未经化学修饰的SIRNA分子便没有此活力。目前以类似方式进行修饰的SIRNA药物在探索人类某些疾病如退行性黄斑变性等治疗过程中。已经进入临床试验I、Ⅱ期,未见明显的副作用211。SOUTSCHEKJ等1221将21O一甲基修饰的抗载脂蛋白BAPOLIPOPROTEINB.APOBSIRNA分子共价连接上胆同醇分子.经小鼠尾静脉给药.可显著降低APOBMRNA的水平、血浆APOB的含量和总胆固醇水平。而且.SIRNA分子的血浆清除半衰期大大延长。SONGE等俐利用鱼精蛋白能吸附核酸分子的特性.制备了单链抗体或抗体FAB片段与鱼精蛋白的融合蛋白.其中抗体分子能靶向于表达HIV包膜蛋白的细胞。该融合蛋白与体外合成的SIRNA分子的复合物直接注射入肿瘤或静脉注射给药后.SIRNA能进入靶组织细胞质,沉默靶基因的表达.抑制HIV病毒复制或肿瘤细胞增生。与此相反.裸SIRNA分子不能被靶组织细胞摄入。另外.该融合蛋白介导的SIRNA分子给药系统在动物体内未出现干扰素应答反应.证明是一种可全身给药、具有细胞特异性的安全的给药.463.方法。SIRNA分子经细胞或组织靶分子修饰.增加了热稳定性和对核酸酶降解的抗性.可经血管内直接给药,临床应用前景良好,但仍需一定的制作工艺。2.4超声及微气泡超声对比剂介导SIIⅢA分子给药采用微气泡超声对比剂结合SIRNA分子.经静脉注射进入血液循环.当达到靶区域时.运用超声破坏微泡.使其在局部释放.可提高局部组织的SIRNA分子浓度.进而达到增强转染目的。对比剂被击碎的过程中所产生的“空化效应”、“声孑L效应”使局部毛细血管破裂、内皮细胞间隙增宽、通透性增加.使SIRNA分子易于穿过血管屏障进入组织内微泡破裂时产生“空化效应”、“声孔效应”所形成的冲击波、微声流.还可增加细胞膜的通透性.同时作为一种驱动力量可促使从微泡释放出来的药物或基因进人靶细胞124_281。KINOSHITAM等41研究表明微气泡超声对比剂OPTISON2%联合超声能够介导靶向EGFPSIRNA抑制人类B细胞淋巴瘤细胞BJABEGFP的表达。同时亦证实超声CW、5.5W,108能够增强EGFPSIRNA抑制鼠C166一GFP细胞EGFP的表达.TSUNODAS等【别进行了超声联合第3代微气泡超声对比剂BRL4介导质粒DNA和SIRNA的双联体转染成年鼠心脏的研究。他们将携带荧光素酶、B一半乳糖苷酶3GAL和EGFP报告基因的质粒DNA和BRL4的混合物经皮注入C57BL/6成年鼠的左心室.经其胸廓给予LMHZ的超声照射60S。结果示探头输出功率为2.0WLCM2、脉冲负载率比例为50%时心脏的荧光素酶表达量最高.组织学检测在左心室心内膜下心肌3GAL、EGFP表达最高。在EGFP转基因小鼠中.左心室腔内共同注射SIRNAGFP和BRL4并结合超声照射可以使冠状动脉表达的EGFP减少.这种方法可用于调节成年鼠心脏功能的基因工程研究。最近OTANIK研究小组130L进行了微气泡超声对比剂联合超声照射介导SIRNA转染间充质干细胞的研究,取得了令人振奋的结果。该研究证实微气泡超声对比剂联合超声照射不仅可以介导SIRNA对癌细胞、体细胞进行转染.还可以介导SIRNA对干细胞进行转染而达到基因修饰.提高其生存活力的目的.进而为以干细胞移植为基础的相关疾病的治疗提供了新思路。上述研究结果表明微气泡超声对比剂联合超声照射可以介导SIRNA的转染.提供了SIRNA分子给药的又一有效途径。尽管针对RNAI技术的载体给药途径的研究取得了一定的突破和发展.但要使SIRNA分子成功应用于生物体内.并成为常规途径.仍有一些关键性问题需要解决。今后研究的重点仍是发展可被临床广泛万方数据..464..生望垦兰三矍皇堕垦塑兰旦箜堂兰塑旦塑兰壁垡坚£生唑塑∑塑应用的SIRNA制剂及方便、高效、靶向性强的给药途径。参考文献1】FIRE凡XUS,MONTGOMERYMK,ET01.POTENTANDSPECIFICGENETICINTERFERENCEBYDOUBLESTRANDEDRNAINCAENORHABDITSELEGANS叨.NATURE,1998,3916669806811.【2】ZAMOREPD,TUSCHLT,SHARPPA,ETA1.RNAIDOUBLESTRANDEDRNADIRECTSTHEATPDEPENDENTCLEAVAGEOFMRNAAT21TO23NUCLEOTIDEINTERVALSJ.CELL,2000,10112533.【3】HAMMONDSM,BERNSTEINE,BEACHD,ETA1.ANRNADIRECTEDNUCLEASEMEDIATESPOSTTRANSCRIPTIONALGENESILENCINGINDROSOPHILCELLSJ.NATURE,2000,4046775293296.【4】KINOSHITAM,HYNYNENKANOVELMETHODFORTHEINTRACELLULARDELIVERYOFSIRNAUSINGMICROBUBBLEENHANCEDFOCUSEDU1.TRASOUND【J】.BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2005,3352393399.5MICHELU,MALIKI,EBERTS,ET01.LONGTERMINVIVOANDINVITROAAV2MEDIATEDRNAINTERFERENCEINRATRETINALGAN一IONCEHSANDCULTUREDPRIMARYNEURONSJ】.BIOCHEMBIOPHYSRESCOMMUN,2005,3262307312.【6】FECHNERHSIPOLWESTERMANND,ET01.CARDIACTARGETEDRNAINTERFERENCEMEDIATEDBYANAAV9VECTORIMPROVESCARDIACFUNCTIONINCOXSACKIEVIRUSB3CARDIOMYOPATHY叽JMOLME2008,869987997.【7】BRUMMELKAMPTR,BEMARDSR,AGAMIR.STABLESUPPRESSIONOFTUMORIGENICITYBYVIRUSMEDIATEDRNAINTERFERENCE【J1.CANCERCELL,2002,23243247.【8】SINGERO,MARTRA,ROCKENSTEINE,ETA1.TARGETINGBACE1WITHSIRNASAMELIORATESALZHEIMER’SDISEASENEUROPATHOLOGYINATRANSGENICMODELJ.NATNEUROSCI,2005,81013431349.9】SIOUDM,SCRENSENDR.CATIONICLIPOSOMEMEDIATEDDELIVERYOFSIRNASINADULTMICE【J】.BIOCHEMBIOPHYSLRESCOMMUN,2003,312412201225.【10】SCRENSENDR,LEIRDALM,SIOUDM,ETA1.GENESILENCINGBYSYSTEMICDELIVERYOFSYNTHETICSIRNASINADULTMICE叨.JMOLBIOL,2003,3274761766.【11FOGEDC,NIELSENHM,FROKJAERS.LIPOSOMESFORPHOSPHOLIPASEA2TRIGGEREDSIRNARELEASEPREPARATIONANDINVITROTEST【J.INTJPHARM,2007,33L2160166.【12】SATO凡TAKAGIM,SHIMAMOTO凡ETA1.SMALLINTERFERINGRNADELIVERYTOTLLELIVERBYINTRAVENOUSADMINISTRATIONOFGALACTOSYLATEDCATIONICLIPOSOMESINMICE口LBIOMATERIALS,2007,28∽1434_1442.13】MORRISSEYDV,LOCKRIDGEJA,SHAWLETA1.POTENTANDPERSISTENTINVIVOANTIHBVACTIVITYOFCHEMICALLYMODIFIEDSIRNAS叨.NATBIOTECHNOL,2005,23810021007.【14】KATASH,ALPARHO.DEVELOPMENTANDCHARACTERISATIONOFCHITOSANNANOPARTICLESFORSIRNADELIVERYJ.JCONTROLRELEASE,2006,1152216225.【15】TANWB,JIANGS,ZHANGY.QUANTUMDOTBASEDNANOPARTICLESFORTARGETEDSILENCINGOFHER2/NEUGENEVIARNAINTERFERENCE【J.BIOMATERIALS,2007,28815651571.【16】TANMLCHOONGPF,DASSCR.CANCERCHITOSANNANOPARTICLESANDCATALYTICNUCLEICACIDSJ.JPHARMPHARMACOL,2009,611131Z【17】MYKHAYLYKO,ZELPHATIO,ROSENECKERJ.SIRNADELIVERYBYMAGNETOFECTIONJ.CURTOPINMOLTHER,2008,LO5493505.【18】SCHIFFELERSRM,ANSARIA,XUJ,ET01.CANCERSIRNATHERAPYBYTUMORSELECTIVEDELIVERYWITHLIGANDTARGETEDSTERICALLYSTABILIZEDNANOPARTICLE【J.NUCLEICACIDSRES,2004,3219E149.19MORIGUEHIR,KOGUREK,AKITAH,ETA1.AMUHIFUNCTIONALEUVELOPETYPENANODEVICEFORNOVELGENEDELIVERYOFSIRNAPLASMIDSJ.INTJPHARM,2005。30112277285.【20】MORRISSEYDV,BLANCHARDK,SHAWLET01.ACTIVITYOFSTABI.1IZEDSHORTINTERFERINGRNAINAMOUSEMODELOFHEPATITISBVIRUSREPLICATIONJ.HEPATOLOGY,2005,4L613491356.【21】BEHLKEMA.CHEMICALMODIFICATIONOFSIRNASFORINVIVOUSEJ.0LIGONUCLEOTIDES,2008,184305319.【22】SOUTSCHEKJ,AKINCA,BRAMLAGEB,ETA1.THERAPEUTICSILENCINGOFANENDOGENOUSGENEBYSYSTEMICADMINISTRATIONOFMODIFIEDSIRNASJ.NATURE,2004。4327014173178.23】SONGE,ZHUP,LEESK,ETA1.ANTIBODYMEDIATEDINVIVODELIV.CRYOFSMALLINTERFERINGRNASVIACELLSURFACERECEPTORSJ.NATBIOTECHNOL,2005,236709717.【24BRUJANEA.THEROLEOFCAVITATIONMICROJETSINTHETHERAPEUTICAPPLICATIONSOFULTRASOUNDJ.ULTRASOUNDMEDBIOL,2004,303381387.【25】NOZAKIT,OGAWAR,WATANABEA,ETA1.ULTRASOUNDMEDIATEDGENETRANSFECTIONPROBLEMSTOBESOLVEDANDFUTUREPOSSIBILI.TIESJ.JMADULTRASONICS,2006,333135142.【26ROMEC,DECKE璐R,MOONENCT.THEUSEOFULTRASOUNDINTRANSFECTIONANDⅡANSGENEEXPRESSIONJ.HANDBEXPPHARMACOL,2008,185PT2225243.27】HEMOTS,KLIBANOVALMICROBUBBLESINULTRASOUNDTRIGGEREDDRUGANDGENEDELIVERYJ.ADVDRUGDELIVREV,2008,601011531166.【28】UYS,REIDCN,MCHALEAP.ENHANCINGULTRASOUNDMEDIATEDCELLMEMBRANEPERMEABILISATIONS
编号:201312191514377227    类型:共享资源    大小:316.79KB    格式:PDF    上传时间:2013-12-19
  
5
关 键 词:
管理 组织 经营
  人人文库网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
关于本文
本文标题:siRNA 给药途径的研究进展.pdf
链接地址:http://www.renrendoc.com/p-247227.html

当前资源信息

4.0
 
(2人评价)
浏览:25次
abaodong上传于2013-12-19

官方联系方式

客服手机:17625900360   
2:不支持迅雷下载,请使用浏览器下载   
3:不支持QQ浏览器下载,请用其他浏览器   
4:下载后的文档和图纸-无水印   
5:文档经过压缩,下载后原文更清晰   

相关搜索

精品推荐

相关阅读

人人文库
关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

网站客服QQ:2846424093    人人文库上传用户QQ群:460291265   

[email protected] 2016-2018  renrendoc.com 网站版权所有   南天在线技术支持

经营许可证编号:苏ICP备12009002号-5